D-半乳糖、亞硝酸鈉和三氯化鋁聯(lián)合作用對(duì)小鼠認(rèn)知能力的影響

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D-半乳糖、亞硝酸鈉和三氯化鋁聯(lián)合作用對(duì)小鼠認(rèn)知能力的影響

劉梅訊1，孫天敏2

目的探討D-半乳糖、亞硝酸鈉和三氯化鋁聯(lián)合作用對(duì)小鼠認(rèn)知能力的影響。方法選取健康小鼠40只隨機(jī)分為AD模型組、正常組，各20只。對(duì)模型組采用三氯化鋁、D-半乳糖和亞硝酸鈉聯(lián)合給藥，對(duì)正常組小鼠相應(yīng)使用同體積生理鹽水給藥。均連續(xù)給藥3個(gè)月，觀察兩組行為學(xué)、抗氧化指標(biāo)和形態(tài)學(xué)染色的差異。結(jié)果①AD模型組的潛伏期、第一次穿越原平臺(tái)位置的時(shí)間均明顯長(zhǎng)于正常組(P<0.01)，而在原平臺(tái)象限的活動(dòng)時(shí)間，前者又明顯短于后者(P<0.01)；②AD模型組超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化酶(GSH-Px)活性明顯降低、低于正常組(P<0.01)，而丙二醛(MDA)含量明顯升高，高于正常組(P<0.01)；③剛果紅染色，AD模型組海馬CA2區(qū)細(xì)胞外可見(jiàn)多個(gè)Aβ斑，而正常組未見(jiàn)Aβ斑；④改良氨銀染色，AD模型組海馬CA2區(qū)可見(jiàn)錐體細(xì)胞稀少、不整齊，核周體內(nèi)棕黑色細(xì)絲增粗、局部呈小塊狀，神經(jīng)元外可見(jiàn)老年斑；而正常組海馬CA2區(qū)組織結(jié)構(gòu)清晰。結(jié)論通過(guò)D-半乳糖、亞硝酸鈉和三氯化鋁對(duì)小鼠的復(fù)合、慢性作用，部分復(fù)制了AD的病理變化，是建立AD動(dòng)物模型比較理想的方法。

阿爾茨海默??；D-半乳糖；亞硝酸鈉；三氯化鋁；脂質(zhì)過(guò)氧化；學(xué)習(xí)記憶

Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of D-galactose， sodium nitrite，and alchlor on cognitive competence in mice.MethodsThe health mice were selected and divided into Alzheimer’s disease (AD) model group and normal group.Mice in model group were injected with alchlor， D-galactose and sodium nitrite for three consecutive months. Mice in normal group were injected with normal saline of the same volume. The behavior， anti-oxidative index and morphological staining pattern were observed.ResultsThe incubation period and the time when the original platform position passed through for the first time in AD model group were significantly longer than that in normal group (P<0.01).The activity time in the original platform position the former were significantly shorter in AD model group than that in normal group (P<0.01). The activities of SOD， GSH-Px decreased in AD model group，which was lower than that in normal group (P<0.01). MDA concentration rises in AD model group，which was higher than that in normal group (P<0.01). Congo red stainning method showed that many Aβ spots could be seen in hippocampal CA2 sector in AD model group， while no Aβ spot was observed in normal group. Improved amine silver staining method showed that few and irregular pyramidal cells could be found in hippocampal CA2 sector in AD model group. There was thickened black filament around the nucleus and it showed a forma of small patch in some area， and age pigment could be seen outside the neuron. However， the tissue structure of hippocampal CA2 sector of the normal group was clear.ConclusionAD pathological changes are partially modeled by the combined and chronic effect of D-galactose， sodium nitrite and alchlor in mice， which is proved to be an ideal method to establish AD animal model.

Keywords：Alzheimer’s disease；D-galactose;sodium nitrite；alchlor;lipid peroxidation；learning and memory

老年性癡呆又稱阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)，由德國(guó)醫(yī)生Alois Alzheimer于1906年最先描述，是與年齡高度相關(guān)的、以進(jìn)行性認(rèn)知障礙為主要表現(xiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。AD腦三大病理變化為：神經(jīng)元外由β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)組成的老年斑(senile plaques，SP)、神經(jīng)元內(nèi)由異常磷酸化tau蛋白(p-tau)組成的神經(jīng)元纖維絲纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFTs)以及神經(jīng)元及其突觸的廣泛丟失。但其發(fā)病機(jī)制尚未完全明了，亦無(wú)根治藥物。關(guān)于AD研究的最大難題是沒(méi)有特異性的動(dòng)物模型，以致于嚴(yán)重影響研究的針對(duì)性和實(shí)用性[1]。因而，探索建立理想的動(dòng)物模型是目前AD研究最迫切的工作。現(xiàn)有的AD動(dòng)物模型如老化型、損傷型、轉(zhuǎn)基因型、胰島素抵抗型、腦缺血型等，均只是在一個(gè)局部或一個(gè)點(diǎn)反映AD的病理變化和發(fā)病機(jī)制，急需建立AD復(fù)合模型，來(lái)揭示AD發(fā)病機(jī)制、提供研究以及指導(dǎo)治療[1-3]。為此，本課題探討D-半乳糖、亞硝酸鈉和三氯化鋁聯(lián)合作用對(duì)小鼠認(rèn)知能力的影響，試圖為復(fù)制AD動(dòng)物復(fù)合模型提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑 健康雄性昆明小鼠40只，SPF級(jí)，10月齡，體質(zhì)量(40±5)g。由湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)：SCXK(鄂)2016-0008、SYXK(鄂)2016-0031]提供。實(shí)驗(yàn)前將小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)兩周，且剔除行為學(xué)反應(yīng)明顯遲緩者。MT-200水迷宮行為學(xué)跟蹤系統(tǒng)購(gòu)于成都泰盟。D-半乳糖(D-galactose；純度>98%)、亞硝酸鈉(Sodium nitrite；純度>98%)、三氯化鋁(Aluminium trichloride；純度>98%)、谷胱甘肽過(guò)氧化酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)試劑盒、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒(武漢博士德)。

1.2 分組與給藥 選取健康小鼠40只隨機(jī)分為兩個(gè)組：AD模型組、正常組，各20只。對(duì)模型組小鼠采用三氯化鋁、D-半乳糖和亞硝酸鈉聯(lián)合給藥：①D-半乳糖(500 mg/kg；濃度：10 mg/0.1 mL或100 g/L)、亞硝酸鈉(45 mg/kg；濃度：0.9 mg/0.1 mL或9 g/L)，配成水溶液、頸背部皮下注射；②三氯化鋁(40 mg/kg)，按每只小鼠平均飲水5 mL/ d配制液體，讓小鼠自由飲用；均持續(xù)用藥3個(gè)月。對(duì)正常組小鼠相應(yīng)使用同體積生理鹽水給藥。

1.3 小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的測(cè)試 ①定位航行實(shí)驗(yàn)。檢測(cè)小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶過(guò)程和能力。連續(xù)進(jìn)行5 d。每只小鼠一天接受3次訓(xùn)練，依次從不同象限中點(diǎn)，頭朝池壁入水，去尋找平臺(tái)，記錄小鼠找到平臺(tái)的潛伏期、搜索策略以及游泳速度。實(shí)驗(yàn)時(shí)先讓小鼠放在平臺(tái)上適應(yīng)15 s。若小鼠在60 s內(nèi)未找到平臺(tái)，則計(jì)潛伏期為60 s。小鼠無(wú)論找到平臺(tái)與否，均被安排在平臺(tái)上休息15 s，然后才進(jìn)行下一輪訓(xùn)練。②空間探索實(shí)驗(yàn)。觀察小鼠的空間記憶保持能力。在定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后第1天進(jìn)行。移去平臺(tái)，讓小鼠自由游泳30 s、尋找平臺(tái)。記錄每只小鼠第1次穿越原平臺(tái)位置的時(shí)間以及在每個(gè)象限的活動(dòng)時(shí)間。

1.4 取材與染色 水迷宮測(cè)試完畢后取材即斷頭取腦：①將小鼠頭靠近枕骨剪斷，置于事先準(zhǔn)備好的冰盤(pán)上，并用剪刀剔除頭后部的軟組織；②由后向前，沿中線剪開(kāi)小鼠頭皮，并將皮膚、皮下組織向兩側(cè)分離，暴露顱骨；③同樣沿中線向前，剪開(kāi)枕骨、頂骨直至頂、額兩骨分界處，用鑷子將顱骨由中線向兩側(cè)快速掀開(kāi)；④輕輕分開(kāi)腦組織與顱骨，剪斷與顱骨相連的腦神經(jīng)等，取出全腦，在前囟后2.3 mm至前囟后6.3 mm處分離出大腦皮質(zhì)、海馬，用生理鹽水清洗，放入液氮中保存。整個(gè)操作在2 min之內(nèi)完成。灌注取腦：用10%水合氯醛腹腔麻醉小鼠，迅速開(kāi)胸，剪開(kāi)右心耳和心尖部，灌注針經(jīng)左心室插入升主動(dòng)脈，固定灌注針，用生理鹽水(含1% 肝素)快速灌注，直至右心耳流出的液體清亮?xí)r更換0.1 mol/L、4℃的固定液快速灌注。快速灌注20 s后，速度調(diào)整為20滴/min，持續(xù)20 min。灌注完畢后，完整取出腦組織，置4℃冰箱后固定；備用。常規(guī)做剛果紅染色、改良Bielschowsky氨銀液染色[4-5]。

1.5 生化檢測(cè) 從液氮中取出小鼠大腦皮質(zhì)、海馬，稱量、剪碎，按質(zhì)量體積比(W/V)1∶9加入4℃生理鹽水，用電動(dòng)勻漿機(jī)(3 000 r/min)，制成10%大腦皮質(zhì)、海馬組織勻漿液，離心15 min，取上清液分裝在EP管中。嚴(yán)格按各試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，依次測(cè)定SOD、GSH-Px活性和MDA含量。

2 結(jié) 果

2.1 兩組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的測(cè)試結(jié)果 ①在定位航行實(shí)驗(yàn)中，從第3天開(kāi)始，AD模型組的潛伏期明顯長(zhǎng)于正常組，且它們之間的差距逐漸加大(P<0.05)。在4 d～5 d，AD模型組潛伏期顯著長(zhǎng)于正常組(P<0.01)。詳見(jiàn)圖1A。②在空間探索實(shí)驗(yàn)中，第一次穿越原平臺(tái)位置的時(shí)間，AD模型組小鼠明顯長(zhǎng)于正常組 (P<0.01)，而在原平臺(tái)象限的活動(dòng)時(shí)間，AD模型組小鼠又明顯短于正常組(P<0.01)。詳見(jiàn)圖1B、圖1C。

注：1A為潛伏期：與正常組比較，AD模型組# P<0.01 P<0.01，## P<0.01；1B為第一次穿越原平臺(tái)位置時(shí)間：與正常組比較，AD模型組++ P<0.01；1C為在原平臺(tái)象限活動(dòng)時(shí)間：與正常組比較，AD模型組** P<0.01。圖1 兩組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的測(cè)試結(jié)果

2.2 兩組小鼠SOD、GSH-Px及MDA含量檢測(cè)結(jié)果 與正常組對(duì)應(yīng)的3個(gè)指標(biāo)比較，AD模型組SOD、GSH-Px活性明顯降低(P<0.01)，而MDA含量明顯升高(P<0.01)。詳見(jiàn)表1。

表1 兩組SOD、GSH-Px及MDA檢測(cè)結(jié)果比較(±s)

2.3 兩組腦組織Aβ斑的形成情況 剛果紅染色，AD模型組海馬CA2區(qū)細(xì)胞外可見(jiàn)多個(gè)Aβ斑，染成淡紅色，在其周?chē)赡苡薪?rùn)的膠質(zhì)細(xì)胞及變性神經(jīng)細(xì)胞染成藍(lán)色，背景清晰(圖2A)；而正常組錐體細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，未見(jiàn)Aβ斑(圖2B)。

注：2A為AD模型組，2B為正常組

2.4 兩組神經(jīng)元纖維和Aβ斑或老年斑的形態(tài) 改良Bielschowsky氨銀液染色結(jié)果：AD模型組海馬CA2區(qū)可見(jiàn)錐體細(xì)胞排列不整齊、稀疏、萎縮、核固縮，核周體內(nèi)棕黑色細(xì)絲增粗、呈小塊狀； 軸突內(nèi)神經(jīng)元纖維模糊不清；神經(jīng)元外可見(jiàn)Aβ斑或老年斑，體積較大、數(shù)量較多，且周?chē)薪?rùn)的膠質(zhì)細(xì)胞及變性的神經(jīng)元(圖3 A)。正常組海馬CA2區(qū)錐體細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，可清晰地看到棕黑色的細(xì)絲狀結(jié)構(gòu)即神經(jīng)原纖維，在核周體內(nèi)交織成網(wǎng)，并伸入樹(shù)突和軸突；神經(jīng)元外未見(jiàn)Aβ斑或老年斑(圖3B)。詳見(jiàn)圖3。

注：3A為AD模型組，3B為正常組。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，采用D-半乳糖、亞硝酸鈉和三氯化鋁對(duì)小鼠聯(lián)合、持續(xù)給藥3個(gè)月后，行為學(xué)測(cè)試，AD模型組小鼠的潛伏期和第一次穿越原平臺(tái)位置時(shí)間增長(zhǎng)，而在原平臺(tái)象限活動(dòng)時(shí)間縮短。這說(shuō)明這些小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力和空間記憶保持能力出現(xiàn)明顯的缺損[6]。AD模型組小鼠大腦皮質(zhì)和海馬組織中SOD、GSH-Px活性明顯下降和MDA表達(dá)明顯上升。這表明小鼠體內(nèi)產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化(lipid peroxidation，LPO)反應(yīng)。SOD、GSH-Px是體內(nèi)十分重要的抗氧化酶，其濃度和活性的降低，會(huì)產(chǎn)生大量氧自由基(ROS)損傷腦組織；而MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化后的代謝產(chǎn)物，其濃度高低標(biāo)志著脂質(zhì)過(guò)氧化的程度[7]。AD模型組剛果紅染色在神經(jīng)細(xì)胞外可見(jiàn)多個(gè)淡紅色的類(lèi)Aβ斑，銀染可見(jiàn)海馬CA2區(qū)錐體細(xì)胞丟失、排列紊亂，神經(jīng)元纖維增粗、局部呈小塊狀。盡管這些表現(xiàn)不十分典型，但也不同程度地表達(dá)AD部分的病理學(xué)特征[8]。

本實(shí)驗(yàn)將三氯化鋁按照每天、每公斤體質(zhì)量40 mg放入飲用水中，讓小鼠自由飲用，且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)3個(gè)月，大大地超過(guò)了世界衛(wèi)生組織1 mg的標(biāo)準(zhǔn)，直接造成小鼠鋁的慢性中毒[9]。鋁是一種慢性蓄積性神經(jīng)毒素。三氯化鋁毒性一方面通過(guò)損害膜結(jié)構(gòu)、介導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化[10]；另一方面引起神經(jīng)元纖維變性、抑制神經(jīng)傳導(dǎo)[11]；還可以誘導(dǎo)α-分泌酶和β-分泌酶活性不均衡作用，導(dǎo)致腦組織β-淀粉樣蛋白的過(guò)表達(dá)[12]。長(zhǎng)時(shí)間注射D-半乳糖，其代謝產(chǎn)物半乳糖醇不能進(jìn)一步代謝而堆積在細(xì)胞內(nèi)，影響滲透壓，引起細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化，導(dǎo)致一系列氧化損傷[13]。亞硝酸鈉的氧化性能將血紅蛋白中的二價(jià)鐵氧化成三價(jià)鐵，失去攜帶、輸送氧氣功能，使機(jī)體組織產(chǎn)生缺氧性中毒[14]。

通過(guò)D-半乳糖、亞硝酸鈉和三氯化鋁對(duì)小鼠的復(fù)合、慢性作用，部分復(fù)制AD的病理變化。一是脂質(zhì)過(guò)氧化，產(chǎn)生ROS連鎖反應(yīng)，損傷細(xì)胞膜，繼而神經(jīng)元變性、壞死；二是可能出現(xiàn)的Aβ斑，誘導(dǎo)神經(jīng)元過(guò)早凋亡；三是可能產(chǎn)生的神經(jīng)元纖維變性，使神經(jīng)元纖維退化、萎縮，大腦早老化。這三個(gè)發(fā)生、發(fā)展過(guò)程單個(gè)或聯(lián)合作用，均能導(dǎo)致小鼠大腦皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元及其之間的突觸丟失，從而導(dǎo)致小鼠認(rèn)知功能的障礙，即成功復(fù)制小鼠AD模型[14]。因此認(rèn)為，D-半乳糖、亞硝酸鈉和三氯化鋁三者聯(lián)合作用是建立AD動(dòng)物模型的比較理想的方法[1-3]。

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Effects of D-galactose， Sodium Nitrite and Alchlor on Cognitive Competence in Mice

Liu Meixun， Sun Tianmin

Taihe Hospital Affiliated to Hubei University of Medicine， Shiyan 442000， Hubei， China Corresponding Author： Sun Tianmin (Hubei University of Medicine， Shiyan， Hubei， China)

R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.18.009

1672-1349(2017)18-2251-04

2016-10-19)

(本文編輯 王雅潔)

2014年十堰市科學(xué)技術(shù)研究與開(kāi)發(fā)立項(xiàng)項(xiàng)目(No.14Y08)

1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院(湖北十堰 442000)；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院

孫天敏，E-mail：252014327 @qq.com

信息：劉梅訊，孫天敏.半乳糖、亞硝酸鈉和三氯化鋁聯(lián)合作用對(duì)小鼠認(rèn)知能力的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15(18)：2251-2254.