脂多糖誘導(dǎo)SPLUNC1基因的表達

肖丁良 鐘禮立 高喜容

論 著

脂多糖誘導(dǎo)SPLUNC1基因的表達

肖丁良 鐘禮立 高喜容

目的了解脂多糖（LPS）對人支氣管上皮細(xì)胞（HBECs）增殖的影響，通過觀察不同濃度脂多糖（LPS）不同時間誘導(dǎo)HBECs的短上腭、肺及鼻咽上皮克隆1（SPLUNC1）基因表達情況，探討SPLUNC1在呼吸道感染中的作用。方法采用0.01、0.1、1.0、10 mg/L LPS誘導(dǎo)HBECs，通過噻唑藍（MMT）法檢測LPS對HBECs增殖的影響，誘導(dǎo)HBECs 2、4、8、16、24 h后通過實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（FQ-PCR）檢測SPLUNC1基因表達情況，結(jié)果以SPLUNC1/GAPDH基因拷貝數(shù)比值表示。結(jié)果0.01、0.1、1.0、10 mg/L的LPS均可抑制HBECs的生長〔吸光度（A值）：0.48±0.03、0.37±0.01、0.30±0.03、0.27±0.02，相對生長指數(shù)：94.12%、72.55%、58.82%、52.94%〕，并能誘導(dǎo)SPLUNC1基因表達上調(diào)；在同一濃度組，LPS刺激細(xì)胞2 h后SPLUNC1基因表達開始上調(diào)，隨著時間延長逐漸升高，呈時間依賴性〔0.01 mg/L組2、4、8、16、24 h分別為0.19±0.03、0.24±0.04、0.26±0.03、0.44±0.05、0.51±0.07；0.1 mg/L組分別為0.43±0.02、0.52±0.05、0.60±0.06、0.63±0.08、0.68±0.05；1.0 mg/L組分別為0.44±0.02、0.48±0.02、0.50±0.03、0.58±0.05、0.70±0.06；10 mg/L組分別為0.34±0.03、0.38±0.04、0.68±0.05、0.96±0.08、0.98±0.07〕，不同時間點組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。結(jié)論LPS可抑制HBECs的生長，能誘導(dǎo)HBEC細(xì)胞SPLUNC1基因表達上調(diào)，并在一定濃度范圍內(nèi)表達呈時間依賴性，推測SPLUNC1可能參與細(xì)菌感染最初的防御。

脂多糖； 人支氣管上皮細(xì)胞； 短上腭、肺及鼻咽上皮克隆1

革蘭陰性（G-）菌是兒童呼吸道感染常見病原菌［1］；也是醫(yī)院感染主要病原菌［2］。G-菌對抗菌藥物耐藥性逐年增加，除合理選擇抗菌藥物降低耐藥性外，還應(yīng)研發(fā)新型抗菌藥物、尋找其他抗菌物質(zhì)。

黏膜分泌蛋白人上腭、肺及鼻咽上皮癌相關(guān)蛋白（PLUNC）家族是呼吸道的先天免疫防御物質(zhì)，在保護呼吸道正常的生理功能中起重要作用，而短上腭、肺及鼻咽上皮克隆1（SPLUNC1）是其家族中高表達于呼吸道并參與先天免疫應(yīng)答的蛋白分子。目前對SPLUNC1作用機制和功能的研究還沒有一致的定論，但大多認(rèn)為它參與了呼吸道抵御病原菌的先天免疫應(yīng)答，且很有可能擁有抑菌、殺菌的作用，可能成為將來抗菌藥物耐藥壓力下的另一種抗菌物質(zhì)選擇方案。

SPLUNC1是高表達于呼吸道上皮并參與固有免疫的蛋白分子。鑒于SPLUNC1表達的組織特異性，且能結(jié)合G-菌脂多糖（LPS），并具有殺滅細(xì)菌的作用。且實時熒光聚合酶鏈反應(yīng)（FQ-PCR）技術(shù)簡便、快捷、靈敏度高、特異性強，在臨床上應(yīng)用廣泛，具有較高的應(yīng)用價值［3-4］。故本研究選擇G-菌死亡后釋放的毒力產(chǎn)物L(fēng)PS，通過FQ-PCR方法檢測不同濃度LPS誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞（HBECs）不同時間SPLUNC1表達的變化，為以后人工調(diào)控其分泌、防治呼吸道感染進行前期研究，為防治兒童呼吸道感染提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料 LPS購于美國Sigma公司；HBECs購于湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心；總RNA提取試劑盒（E.Z.N.A.Total RNA Kit I）購于美國Omega公司；RPMI-1640購于美國Gibco公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Prime Script RT reagent Kit Perfect Real Time）購于日本TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 HBECs的培養(yǎng) 用10%胎牛血清（FCS）的RPMI-1640培養(yǎng)基在5% CO2、37℃的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HBECs。

1.2.2 實驗分組及細(xì)胞增殖檢測 通過噻唑藍（MTT）法檢測LPS對細(xì)胞增殖的影響。將生長良好的HBECs置于5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后棄原培養(yǎng)液，分為對照組和不同濃度LPS組（濃度分別設(shè)為0.01、0.1、1.0、10 mg/L），各濃度設(shè)4個復(fù)孔。在培養(yǎng)終止前每孔加入20 μL MTT溶液再繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后棄去上清液，加入150 μL二甲基亞砜，放到搖床上待結(jié)晶完全溶解，通過酶標(biāo)儀570 nm測定吸光度值（A值）。相對生長指數(shù)（GI）＝（處理組A值/對照組A值）×100%，GI＞100%為刺激生長，GI＜100%為抑制生長。

1.2.3 FQ-PCR測定SPLUNC1基因表達

1.2.3.1 分組及處理方法 將HBECs分為LPS組和對照組。LPS組分別加入濃度為0.01、0.1、1.0、10 mg/L的LPS，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2、4、8、16、24 h，再提取細(xì)胞總RNA用于FQ-PCR檢測，以上同樣實驗重復(fù)3次。

1.2.3.2 細(xì)胞總RNA提取及cDNA的合成 嚴(yán)格按照試劑盒操作說明提取RNA；電泳檢測RNA的質(zhì)量，并計算RNA含量，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.3 引物、探針由上海生工生物工程有限公司設(shè)計和合成。

1.2.3.4 制備標(biāo)準(zhǔn)品 將反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA進行半定量PCR，由上海生工生物工程有限公司將PCR產(chǎn)物及擴增引物構(gòu)建SPLUNC1、3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）基因質(zhì)粒，提取RNA測A值，并得出基因拷貝數(shù)及其相應(yīng)的濃度，得到質(zhì)粒的實時熒光定量標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2.3.5 FQ-PCR反應(yīng) 將反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA模板稀釋10倍，將模板、引物與Mix混合，PCR反應(yīng)體系和程序分別見表1，獲得SPLUNC1 mRNA及GAPDH mRNA的拷貝數(shù)。

表1 FQ-PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序

1.3 統(tǒng)計分析 本檢測測數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0軟件軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測不同濃度LPS刺激對HBECs增殖的影響 LPS在一定濃度范圍內(nèi)（0.01～10 mg/L）能抑制細(xì)胞生長，存在劑量依賴性，細(xì)胞活力明顯降低。見表2。

表2 不同濃度LPS對HBECs細(xì)胞增殖的影響

表3 不同濃度LPS對HBECs細(xì)胞SPLUNC1基因相對表達量的影響

表3 不同濃度LPS對HBECs細(xì)胞SPLUNC1基因相對表達量的影響

注：與對照組比較，；與前一濃度比較；與前一時間點比較

2.2 FQ-PCR檢測SPLUNC1基因表達

2.2.1 FQ-PCR對不同時間點上SPLUNC1基因的表達情況檢測結(jié)果結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線，我們可得到樣品中SPLUNC1基因拷貝數(shù)（見圖1）及看家基因GAPDH基因拷貝數(shù)（見圖2），其中橫坐標(biāo)代表Ct值，縱坐標(biāo)代表熒光強度。

圖1 SPLUNC1基因絕對定量結(jié)果擴增曲線

圖2 GAPDH基因絕對定量結(jié)果擴增曲線

2.2.2 通過SPLUNC1/GAPDH基因拷貝數(shù)比值得到LPS誘導(dǎo)的SPLUNC1相對表達量，見表3。LPS誘導(dǎo)細(xì)胞2 h后SPLUNC1基因表達開始上調(diào)，同一濃度組隨時間延長（2、4、8、16、24 h）基因表達量持續(xù)增高，在一定時間范圍內(nèi)呈時間依賴性。不同時間組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。

3 討論

SPLUNC1蛋白可調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)，抑制病原菌的繁殖及呼吸道感染的發(fā)展，其作用機制目前不是很清楚。SPLUNC1蛋白可通過增加細(xì)菌細(xì)胞壁的滲透性、誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞的趨化、抑制生物膜的形成達到殺菌或抑菌的作用。Sayeed等［5］研究發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)外環(huán)境中的SPLUNC1均有抑制銅綠假單胞菌生長的功能；Liu等［6］發(fā)現(xiàn)，SPLUNC1蛋白能讓小鼠抵抗肺炎克雷伯菌的能力增強。另外，肺炎鏈球菌感染［7］、肺炎支原體感染［8］也可以誘導(dǎo)SPLUNC1表達，從而發(fā)揮宿主防御作用。

本實驗發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，LPS可抑制HBECs的生長，并能誘導(dǎo)SPLUNC1基因表達上調(diào)。在刺激2 h后發(fā)現(xiàn)基因表達開始上調(diào)，并在24 h內(nèi)隨著時間的延長持續(xù)增高，呈時間依賴性。推測可能隨著時間的延長，細(xì)菌感染加重，SPLUNC1蛋白的增加，機體抵抗細(xì)菌的能力也增強。在細(xì)菌及肺炎支原體感染后均可誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞SPLUNC1基因表達，但在兩者感染后基因表達量是否存在差異還有待進一步研究。

綜上所述，SPLUNC1蛋白能抵抗外界病原微生物的入侵，還能作為防御蛋白來保護宿主；同時可以增強慢性肺部疾病患者呼吸道對外界病毒、細(xì)菌的防御。這為以后SPLUNC1蛋白作為臨床藥物開發(fā)打下良好的基礎(chǔ)。

1 張瑾.住院兒童下呼吸道感染病原監(jiān)測及耐藥譜分析［D］.石家莊：河北醫(yī)科大學(xué)，2014.

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4 林瀛，陳小巖，俞訓(xùn)彬.結(jié)核分枝桿菌DNA實時定量PCR技術(shù)在臨床病理診斷中的應(yīng)用［J］.實用檢驗醫(yī)師雜志，2015，7（3）：143-147.

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6 Liu Y，Bartlett JA，Di ME，et al. SPLUNC1/BPIFA1 contributes to pulmonary host defense against Klebsiella pneumoniae respiratory infection ［J］. Am J Pathol， 2013，182（5）：1519-1531.

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SPLUNC1 gene expression induced by lipopolysaccharide

Xiao Dingliang, Zhong Lili, Gao Xirong.
Children's hospital neonatal of Hunan Province, People's Hospital Pediatrics of Hunan Province, Changsha 410007, Hunan, China

ObjectiveTo study the effects of lipopolysaccharide (LPS) on the growth of human bronchial epithelial cells (HBECs). To observe the expression of short palate lung and nasal epithelium clone 1 (SPLUNC1)at different time points after being induced by LPS of different concentration in HBECs. To explore the role of SPLUNC1 in respiratory tract infection.MethodsThe expression of SPLUNC1 gene in HBECs at different time points (2, 4, 8, 16, 24 hours after LPS simulated) induced by different concentrations of LPS (0.01, 0.1, 1.0,10 mg/L) was detected by real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction (FQ-PCR), and the growth of HBECs was detected. SPLUNC1 gene level results were demonstrated by SPLUNC1/GAPDH gene copies ratio.ResultsLPS inhibited the growth of HBECs [absorbance （A） value: 0.48±0.03, 0.37±0.01, 0.30±0.03,0.27±0.02, relative growth index: 94.12%, 72.55%, 58.82%, 52.94%], and induced the expression of SPLUNC1 gene; in the same concentration group, SPLUNC1 gene expression began to increase after 2 hours stimulation of LPS, with the prolongation of time gradually increased in a time dependent manner (0.01 mg/L group on 2、4、8、16、24 hours were 0.19±0.03, 0.24±0.04, 0.26±0.03, 0.44±0.05, 0.51±0.07, respectively; 0.1 mg/L group were 0.43±0.02, 0.52±0.05, 0.60±0.06, 0.63±0.08, 0.68±0.05, respectively; 1.0 mg/L group were 0.44±0.02,0.48±0.02, 0.50±0.03, 0.58±0.05, 0.70±0.06, respectively; 10 mg/L group 0.34±0.03, 0.38±0.04, 0.68±0.05,0.96±0.08, 0.98±0.07, respectively). There was statistical significance difference between the two groups at different time points (all P ＜ 0.01).ConclusionsLPS can reduce the growth of HBECs induced by LPS, increase the expression of SPLUNC1 gene, and its expression is time-dependent in a certain range. It is speculated that SPLUNC1 may be involved in the initial defense of bacterial infection.

Lipopolysaccharide; Human bronchial epithelial cells; Short palate lung and nasal epithelium clone 1

2017-05-17）

（本文編輯：楊程伍 李銀平）

410007 湖南長沙，湖南省兒童醫(yī)院新生兒科（肖丁良，高喜容）；湖南長沙，湖南省人民醫(yī)院兒科（鐘禮立）

肖丁良，Email：xjsd8902@126.com

10.3969/j.issn.1674-7151.2017.03.013

Corresponding author: Xiao Dingliang, Email: xjsd8902@126.com