小干擾RNA與反義寡核苷酸技術(shù)抑制肝星狀細(xì)胞RhoA表達(dá)的效果比較

張玉峰，葉坤英，鐘丹

(1河南中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，鄭州450002；2井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)院)

小干擾RNA與反義寡核苷酸技術(shù)抑制肝星狀細(xì)胞RhoA表達(dá)的效果比較

張玉峰1，葉坤英1，鐘丹2

(1河南中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，鄭州450002；2井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)院)

目的對(duì)比觀察小干擾RNA(siRNA)和反義寡核苷酸(ASODN)技術(shù)抑制肝星狀細(xì)胞RhoA表達(dá)的效果。方法將培養(yǎng)的大鼠肝星狀細(xì)胞株HSC-T6隨機(jī)分為siRNA組和ASODN組，兩組又分別分為A、B、C、D各4個(gè)亞組；siRNA組和ASODN組中的A亞組不轉(zhuǎn)染質(zhì)粒， C、D、B亞組分別采用siRNA、ASODN技術(shù)轉(zhuǎn)染大鼠RhoA特異性Rat1 、Rat2質(zhì)粒及HK-A陰性對(duì)照質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染48 h取各組細(xì)胞，以RT-PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中的RhoA、Ⅰ型膠原(Col Ⅰ) mRNA，酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)細(xì)胞上清液中的透明質(zhì)酸(HA)及層粘連蛋白(LN)。結(jié)果siRNA組與ASODN組中RhoA、Col Ⅰ mRNA均以C亞組表達(dá)量最低，組內(nèi)A、C亞組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，組內(nèi)其余亞組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；siRNA組C亞組RhoA、Col Ⅰ mRNA相對(duì)表達(dá)量低于ASODN組(P均<0.05)，兩組A、B、D同亞組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。siRNA組與ASODN組細(xì)胞上清液HA、LN水平均以C亞組最低，組內(nèi)A、C亞組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，組內(nèi)其余亞組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；siRNA組C亞組細(xì)胞上清液HA、LN水平低于ASODN組(P均<0.05)，兩組A、B、D同亞組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。結(jié)論siRNA和ASODN均可抑制大鼠HSC-T6細(xì)胞的RhoA表達(dá)，但siRNA下Rat1質(zhì)粒所介導(dǎo)的 RNA干擾技術(shù)相對(duì)于ASODN能更有效抑制HSC-T6細(xì)胞外基質(zhì)HA、Col Ⅰ、LN的生成。

小干擾RNA；反義寡核苷酸；RhoA；透明質(zhì)酸；Ⅰ型膠原；層粘連蛋白；肝星狀細(xì)胞

肝纖維化是肝臟疾病慢性發(fā)展的一個(gè)重要病理特征，也是肝硬化發(fā)生的中間環(huán)節(jié)。研究[1～4]發(fā)現(xiàn)，肝星狀細(xì)胞(HSC)在肝纖維化過(guò)程中明顯存在增殖活化，增殖活化的HSC可產(chǎn)生大量的細(xì)胞外基質(zhì)，如透明質(zhì)酸(HA)、Ⅰ型膠原(Col Ⅰ)及層粘連蛋白(LN)等，這些物質(zhì)沉淀最終可導(dǎo)致肝纖維化。Rho家族蛋白能參與多種信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。有研究[5～8]顯示，Rho參與了多種器官組織的纖維化。因此，理論上認(rèn)為抑制Rho信號(hào)傳導(dǎo)途徑可阻止肝纖維化的進(jìn)程。小干擾RNA(siRNA)和反義寡核苷酸(ASODN)是目前常用的端粒酶抑制劑，常用于基因的靶向治療。2015年6月～2016年6月，我們對(duì)比觀察了這兩種靶向技術(shù)對(duì)大鼠HSC中Rho表達(dá)的抑制效果，為肝纖維化的基因治療提供一定參考依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠HSC-T6細(xì)胞購(gòu)自上海中醫(yī)藥大學(xué)，表達(dá)綠色熒光蛋白(EGFP)的大鼠RhoA特異性Rat1及Rat2質(zhì)粒、HK-A陰性對(duì)照質(zhì)粒由上海中醫(yī)藥大學(xué)合成；DMEM高糖培養(yǎng)基、新生牛血清(Gibco公司)，TaqDNA聚合酶及M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、Rnasin核酸酶抑制劑(Promega公司)；大鼠HA、Col Ⅰ及LN聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)試劑盒(上海生物科技有限公司)。離心機(jī)(BECKMAN公司)，恒溫培養(yǎng)箱(Thermo Forma公司)，PCR擴(kuò)增儀(MJ Research公司)，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(Thermo Labsysterm公司)，紫外分光光度儀(Bechman公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 取DMEM高糖培養(yǎng)基與新生牛血清，配制成含10%新生牛血清培養(yǎng)液；將HSC-T6細(xì)胞在5%CO2、飽和濕度、37 ℃下培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)80%～90%融合時(shí)進(jìn)行傳代；傳代過(guò)程中以10%新生牛血清培養(yǎng)基終止消化，獲取實(shí)驗(yàn)所需的HSC-T6細(xì)胞。

1.2.2 細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染 將HSC-T6細(xì)胞隨機(jī)分為siRNA組和ASODN組，兩組又分別分為A、B、C、D各4個(gè)亞組，均接種于6孔板，每組接種2孔(0.5×106/孔)，同時(shí)每組另設(shè)6個(gè)復(fù)孔為對(duì)照。siRNA組和ASODN組中的A亞組不轉(zhuǎn)染質(zhì)粒， C、D、B亞組分別采用siRNA、ASODN技術(shù)轉(zhuǎn)染大鼠RhoA特異性Rat1 、Rat2質(zhì)粒及HK-A陰性對(duì)照質(zhì)粒。24 h后熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞和上清。兩組中A亞組細(xì)胞生長(zhǎng)良好，形態(tài)輪廓清楚；B、C、D組細(xì)胞中均見(jiàn)綠色熒光，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)較差，細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功。

1.2.3 細(xì)胞中RhoA、Col Ⅰ mRNA檢測(cè) 采用RT-PCR技術(shù)。取各組細(xì)胞，經(jīng)RNA的提取、mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA、PCR反應(yīng)、電泳等步驟，電泳產(chǎn)物最終在圖像分析儀中進(jìn)行灰度掃描；用圖像分析儀采集圖像，以擴(kuò)增目的片段與β-actin的灰度比值表示所擴(kuò)增的目的基因片段相對(duì)表達(dá)水平。RhoA上游引物為5′-GTAGAGTTGGCTTTATGGG-3′，下游引物為5′-CTCACTCCGTCTTTGGTC-3′，擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度為347 bp。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min，53 ℃退火50 s，72 ℃延伸40 s，32個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸8 min。Col Ⅰ上游引物為5′-TGGCGTTCGTGGCTCTCAGGGTAG-3′，下游引物為5′-GCATGTGCGGGCAGGGTTCTTTC-3′，擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度為259 bp；擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性1 min，5 ℃退火50 s，72 ℃延伸40 s，32個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸8 min。

1.2.4 細(xì)胞上清液中HA、LN檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附法。經(jīng)前述細(xì)胞培養(yǎng)、分組及轉(zhuǎn)染，以3 000 r/min，4 ℃離心10 min，取上清液，檢測(cè)細(xì)胞上清液中HA、LN。檢測(cè)過(guò)程包括建立標(biāo)準(zhǔn)孔及對(duì)照孔、各孔加待測(cè)液及一抗、酶標(biāo)抗體工作液、底物抗體工作液、終止液等步驟，最終產(chǎn)物以紫外分光光度儀在492 nm處測(cè)定吸光值，計(jì)算出HA及LA含量。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞中RhoA、Col Ⅰ mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 siRNA組與ASODN組中RhoA、Col Ⅰ mRNA均以C亞組表達(dá)量最低，組內(nèi)A、C亞組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，組內(nèi)其余亞組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；siRNA組C亞組RhoA、Col Ⅰ mRNA相對(duì)表達(dá)量低于ASODN組(P<0.05)，兩組A、B、D同亞組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞中RhoA、Col Ⅰ mRNA相對(duì)表達(dá)量

注：與同組內(nèi)A亞組比較，*P<0.05；與ASODN組同亞組比較，#P<0.05。

2.2 各組細(xì)胞上清液HA、LN水平比較 siRNA組與ASODN組細(xì)胞上清液HA、LN水平均以C亞組最低，組內(nèi)A、C亞組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，組內(nèi)其余亞組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；siRNA組C亞組細(xì)胞上清液HA、LN水平低于ASODN組(P均<0.05)，兩組A、B、D同亞組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組細(xì)胞上清液HA、LN水平比較

注：與同組內(nèi)A亞組比較，*P<0.05；與ASODN組同亞組比較，#P<0.05。

3 討論

HSC被認(rèn)為是肝纖維化過(guò)程中的關(guān)鍵細(xì)胞，也是導(dǎo)致肝細(xì)胞發(fā)生纖維化及膠原產(chǎn)生的主要原因。HSC被激活后可分泌腫瘤壞死因子、血小板源性生長(zhǎng)因子等細(xì)胞因子，從而引起細(xì)胞外基質(zhì)在肝內(nèi)沉積，導(dǎo)致肝纖維化發(fā)生。Col Ⅰ、HA及LN是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，臨床研究也顯示在肝纖維化時(shí)Col Ⅰ、HA及LN的表達(dá)均明顯升高[9～11]。在肝細(xì)胞受損時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)HA的降解能力下降，因此在細(xì)胞及血清中HA升高。Col Ⅰ則為細(xì)胞基底膜的組成成分，在肝內(nèi)合成及代謝。肝細(xì)胞受損可引起Col Ⅰ破壞，LA主要參與肝竇毛細(xì)血管化形成。因此，以上指標(biāo)往往作為判斷有無(wú)纖維化及纖維化嚴(yán)重程度的指標(biāo)被臨床應(yīng)用。

Rho家族蛋白已經(jīng)臨床證實(shí)參與了多種器官組織的纖維化進(jìn)程，其介導(dǎo)的信號(hào)通路一直是臨床纖維化研究中的新靶點(diǎn)。有研究[5～8]顯示，RhoA是重要的促纖維化因子，采用RNA干擾技術(shù)對(duì)HSC-T6細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染能抑制RhoA基因的表達(dá)，同時(shí)阻斷RhoA對(duì)HSC激活，降低Col Ⅰ、HA及LN等細(xì)胞外基質(zhì)的生成，起到阻斷纖維化過(guò)程。反義技術(shù)是根據(jù)核酸間堿基配對(duì)結(jié)合原理從基因水平上干擾核酸向蛋白質(zhì)的傳遞，siRNA和ASODN兩組技術(shù)均屬于反義技術(shù)[12～16]，以mRNA為靶點(diǎn)，對(duì)靶基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)。本研究采用以上兩種方法抑制HSC-T6細(xì)胞中的RhoA表達(dá)，結(jié)果顯示兩種方法均能抑制RhoA的表達(dá)，證實(shí)抑制HSC-T6細(xì)胞中的RhoA表達(dá)采用以上技術(shù)是可行的。觀察兩種方法下Col Ⅰ、HA及LN的表達(dá)，均表現(xiàn)為以上細(xì)胞外基質(zhì)指標(biāo)的下調(diào)；但是，進(jìn)一步比較兩種技術(shù)下具體下調(diào)效果，siRNA相對(duì)于ASODN對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的下調(diào)效果更為明顯，說(shuō)明以上兩種技術(shù)可能有不同的反義作用機(jī)制。一般認(rèn)為，ASODN主要是通過(guò)與細(xì)胞核內(nèi)的mRNA前體相互作用形成雙鏈DNA最終阻斷蛋白質(zhì)的翻譯，siRNA與ASODN存在差別可能在于mRNA前體和成熟mRNA一級(jí)結(jié)構(gòu)，因此導(dǎo)致最終抑制效應(yīng)也存在不同。但是，由于ASODN在研究過(guò)程中更為穩(wěn)定，并且研究較為成熟，這也是臨床尚未放棄研究ASODN機(jī)制的原因。但是，siRNA也已經(jīng)成為臨床新的研究熱點(diǎn)，值得進(jìn)一步深入研究其機(jī)制。

綜上所述，siRNA和ASODN均可抑制HSC-T6細(xì)胞中RhoA的表達(dá)，siRNA下Rat1質(zhì)粒所介導(dǎo)的 RNA干擾技術(shù)相對(duì)于ASODN能更有效抑制HSC-T6細(xì)胞外基質(zhì)HA、Col Ⅰ、LN的生成，為肝纖維化的基因治療提供了方向。

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Effect comparison of small interfering RNA and antisense oligonucleotide in inhibition of RhoA expression of rat hepatic stellate cells

ZHANGYufeng1,YEKunying,ZHONGDan

(1TheSecondClinicalMedicalCollegeofHenanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Zhengzhou450002,China)

ObjectiveTo compare the effects of small interfering RNA (siRNA) and antisense oligonucleotide (ASODN) in inhibition of RhoA expression of rat hepatic stellate cells.MethodsRat hepatic stellate cell line HSC-T6 was divided into the siRNA group and ASODN group, respectively, and then each group was separately divided into subgroups A, B, C, and D. Cells in the subgroup A of the siRNA group and ASODN group were cultured normally, subgroup B was transfected with HK-A negative control plasmid, subgroup C with Rat1, and subgroup D with Rat2. After transfection for 48 h, the mRNA expression of RhoA and ColⅠin HSC-T6 cells of each group was detected by reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), respectively; the content of hyaluronic acid (HA) and laminin (LN) in culture serum was measured by specific ELISA.ResultsThe expression of RhoA mRNA and Col I mRNA in the subgroup C of siRNA group and ASODN group was the lowest, and significant difference was found between subgroup A and subgroup C (bothP<0.05), but no significant difference was found between the rest of subgroups (allP>0.05). The mRNA expression of RhoA and Col Ⅰ in the subgroup C of the siRNA group was lower than that in the ASODN group (P<0.05). There was no significant difference in the subgroups A, B, and D between the siRNA group and ASODN group (allP>0.05). The levels of HA and LN in the supernate of subgroup C of the siRNA group and ASODN group were the lowest, and significant difference was found between subgroup A and subgroup C (bothP<0.05), but no significant difference was found between the rest of subgroups (allP>0.05). The levels of HA and LN in the supernate of subgroup C of the siRNA group were lower than those in the ASODN group (bothP<0.05). There was no significant difference in the subgroups A, B, and D between the siRNA group and ASODN group (allP>0.05).ConclusionBoth siRNA and ASODN can inhibit RhoA expression of rat HSC-T6 cells, and RNA interference mediated by Rat1 plasmids targeting RhoA can more effectively inhibit the formation of extracellular matrix HA, Col Ⅰ, and LN than that of ASODN.

small interfering RNA; antisense oligonucleotide; RhoA; hyaluronic acid; collagenⅠ; laminin; hepatic stellate cells

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.34.002

R365；Q522

A

1002-266X(2017)34-0005-04

2017-01-03)

河南省中醫(yī)藥科學(xué)研究專項(xiàng)課題(2014ZY02027)。

張玉峰(1969-)，男，碩士，副教授，副主任醫(yī)師，主要研究方向?yàn)橄到y(tǒng)疾病的中西醫(yī)治療。E-mail: zhouyihb@163.com