Ⅱ～Ⅲ期上皮性卵巢癌原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶中miR-199a-5p表達變化及其意義

彭靚,葉萍,陳國慶,謝曉英

(贛南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院, 江西贛州 341000)

·臨床研究·

Ⅱ～Ⅲ期上皮性卵巢癌原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶中miR-199a-5p表達變化及其意義

彭靚,葉萍,陳國慶,謝曉英

(贛南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院,江西贛州341000)

目的觀察Ⅱ～Ⅲ期上皮性卵巢癌原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶中miR-199a-5p表達變化，并探討其臨床意義。方法選擇52例Ⅱ～Ⅲ期上皮性卵巢癌患者卵巢癌組織標本為卵巢癌原發(fā)組，卵巢癌盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶標本為卵巢癌轉(zhuǎn)移組，29例良性上皮性卵巢腫瘤患者的腫瘤組織標本為良性組，32例因子宮肌瘤行子宮附件切除術(shù)患者的正常卵巢組織標本為對照組。采用實時熒光定量PCR法檢測四組標本中miR-199a-5p表達量，并分析上皮性卵巢癌組織miR-199a-5p表達量與上皮性卵巢癌FIGO分期、病理分級及組織學類型的關(guān)系。結(jié)果卵巢癌原發(fā)組、卵巢癌轉(zhuǎn)移組、良性組、對照組標本miR-199a-5p表達量分別為1.058±0.306、0.704±0.343、4.335±0.666、4.414±0.470。卵巢癌原發(fā)組miR-199a-5p表達量低于良性組和對照組(P均<0.05)，卵巢癌轉(zhuǎn)移組miR-199a-5p表達量低于良性組和對照組(P均<0.05)，卵巢癌轉(zhuǎn)移組miR-199a-5p表達量低于卵巢癌原發(fā)組(P<0.05)，良性組和對照組miR-199a-5p表達量相比P>0.05。上皮性卵巢癌組織miR-199a-5p表達量和卵巢癌FIGO分期有關(guān)(P<0.05)，與病理分級和組織學類型無關(guān)(P均>0.05)。結(jié)論Ⅱ～Ⅲ期上皮性卵巢癌原發(fā)病灶和盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶組織中miR-199a-5p表達降低。檢測上皮性卵巢癌原發(fā)病灶組織中miR-199a-5p表達量有助于判斷上皮性卵巢癌的FIGO分期。

卵巢癌；上皮性卵巢癌；微小RNA；微小RNA199a-5p

卵巢癌是婦科常見三大惡性腫瘤之一，據(jù)國家癌癥中心最新數(shù)據(jù)估計，2013 年卵巢癌發(fā)病例數(shù)為5萬例，發(fā)病率約為7.53/10萬，位居女性惡性腫瘤發(fā)病的第10位[1]。上皮性卵巢癌是最常見的卵巢惡性腫瘤，5年生存率一直徘徊在30%～40%，嚴重威脅婦女生命和健康[2]。因此，明確上皮性卵巢癌發(fā)病機制，并尋找早期診斷和治療方法至關(guān)重要。微小RNA(miRNA)是一類大小19～25個核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，其與腫瘤的關(guān)系是目前的研究熱點[3，4]。MiR-199a-5p是miRNA的一種，在各種腫瘤組織中表達不一，其在宮頸癌[10]、肝癌[11]組織中表達下調(diào)，而在胃癌[12]、結(jié)直腸癌[13]組織中表達上調(diào)。但是目前未有miR-199a-5p在上皮性卵巢癌組織中表達情況的研究報道。本研究觀察了Ⅱ～Ⅲ期上皮性卵巢癌原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶組織中miR-199a-5p表達變化，并分析其與上皮性卵巢癌FIGO分期、病理分級、組織學類型的關(guān)系。現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇贛南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院婦科2014年5月～2015年12月收治的52例Ⅱ～Ⅲ期上皮性卵巢癌患者的卵巢癌組織標本為卵巢癌原發(fā)組，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶組織標本為卵巢癌轉(zhuǎn)移組?；颊吣挲g 22～71歲，平均47歲。均經(jīng)術(shù)后病理檢查證實。按FIGO2009卵巢癌診斷及分級標準，F(xiàn)IGO分期Ⅱ期22例，Ⅲ期30例；病理分級G1級13例，G2級23例，G3級16例；組織學類型漿液性腺癌 25例、黏液性腺癌21例，子宮內(nèi)膜樣癌 4 例，透明細胞癌2例。所有患者術(shù)前均未接受過放療、化療或激素治療。選擇29例良性上皮性卵巢腫瘤患者的卵巢腫瘤組織標本為良性組，患者年齡18～68歲，平均45歲。選擇因子宮肌瘤行子宮附件切除術(shù)的32例患者的正常卵巢組織標本為對照組，患者年齡19～62歲，平均47歲。三組患者均未合并其他器官腫瘤或內(nèi)外科合并癥。三組患者年齡相比P>0.05。本研究已獲得醫(yī)院倫理委員會批準，患者均已簽署知情同意書。

1.2 miR-199a-5p檢測 采用實時熒光定量PCR法。標本離體后10 min內(nèi)置于去除RNase的凍存管中，經(jīng)液氮罐迅速冷凍后置-196 ℃保存待測。檢測時取各組標本用液氮研磨法磨成粉末并稱取合適量，加入總RNA提取試劑NcmZolReagent，按NcmZolReagent試劑說明書的步驟提取總RNA。分光光度計檢測RNA溶液D260/D280比值，計算RNA濃度和純度，比值若在1.8～2.1，說明提取的總RNA較純，進行后續(xù)實驗，否則棄用。行逆轉(zhuǎn)錄，反應條件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 40 min，85 ℃ 10 min。行實時熒光定量PCR，以U6 為內(nèi)參照。引物購自上海吉瑪生物技術(shù)有限公司。miR-199a-5p上游引物5′-GTCGATACCAGTGCGTGTCGTCCTGTCGGC-3′，下游引物5′AATTGCACTGGATACGACAGCCTAT-3′。U6上游引物 5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游引物5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。PCR 反應條 件 ：95 ℃變性 5 min， 94 ℃ 30 s、60 ℃ 20 s、70 ℃ 45 s共40個循環(huán)。重復3次。 用2-ΔΔCt表示各組miR-199a-5p表達量。

2 結(jié)果

2.1 各組標本miR-199a-5p表達量比較 卵巢癌原發(fā)組、卵巢癌轉(zhuǎn)移組、良性組、對照組標本miR-199a-5p表達量分別為1.058±0.306、0.704±0.343、4.335±0.666、4.414±0.470。卵巢癌原發(fā)組miR-199a-5p表達量低于良性組和對照組(P均<0.05)，卵巢癌轉(zhuǎn)移組miR-199a-5p表達量低于良性組和對照組(P均<0.05)，卵巢癌轉(zhuǎn)移組miR-199a-5p表達量低于卵巢癌原發(fā)組(P<0.05)，良性組和對照組miR-199a-5p表達量相比P>0.05。

2.2 上皮性卵巢癌組織miR-199a-5p表達量和卵巢癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 見表1。上皮性卵巢癌組織miR-199a-5p表達量和卵巢癌FIGO分期有關(guān)(P<0.05)，與病理分級和組織學類型無關(guān)(P均>0.05)。

3 討論

上皮性卵巢癌是最常見的卵巢惡性腫瘤，占卵巢惡性腫瘤的85%～90%，病死率高居婦科惡性腫瘤之首。由于卵巢惡性腫瘤的生成是多環(huán)節(jié)、多因素作用的結(jié)果，基因功能和表達的異常通常直接參與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過程，如原癌基因的激活和抑癌基因的突變等，而侵襲轉(zhuǎn)移是導致惡性腫瘤患者死亡的最關(guān)鍵因素之一。探尋參與上皮性卵巢癌發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移過程的基因并加以干預有可能為治療上皮性卵巢癌提供新的途徑。

表1 上皮性卵巢癌組織miR-199a-5p表達量和卵巢癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

研究表明，miRNAs調(diào)控著人類1/3基因的表達，參與腫瘤發(fā)生發(fā)展[5，6]。Calin等[7]首次證實了miRNA在人類惡性腫瘤慢性淋巴細胞性白血病中的作用，miR-15a/miR-16-1被確定為腫瘤抑制因子。miR-200a高表達與卵巢癌組織學類型和分期有關(guān)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者轉(zhuǎn)移灶中miR-200c表達顯著升高，血漿中的miR-200a和miR-200c可能是診斷卵巢癌的標記物[8]。miR-199a-5p是由其基因轉(zhuǎn)錄初產(chǎn)物pri-miR-199a經(jīng)酶剪切并加工成熟后形成的，miR-199a由位于19號染色體和1號染色體上的2種基因剪切產(chǎn)生[9]。由于組織細胞中存在多種miRNA的表達，并且同一種miRNA在不同組織中的表達情況也各不一樣，因此有報道m(xù)iR-199a-5p在各類腫瘤組織中的表達報道不一，其在宮頸癌[10]及肝癌[11]中表達下調(diào)，而在胃癌[12]及結(jié)直腸癌[13]中表達上調(diào)。He等[12]研究發(fā)現(xiàn)，相比正常胃黏膜組織，miR-199a-5p在胃癌組織中顯著上調(diào)，并且miR-199a-5p能夠增加胃癌細胞遷移和侵襲能力，晚期腫瘤或是有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中miR-199a-5p表達水平相對較高。鄒阮敏等[14]的研究報道了miR-199a-5p在宮頸癌及宮頸上皮內(nèi)瘤變組織中的表達低于正常組織，并且miR-199a-5p表達與宮頸癌的組織分化程度存在一定相關(guān)性，而宮頸癌小細胞的miR-199a-5p表達低于其他組織分化類型的標本。miR-199a-5p在宮頸癌組織中的異常表達。miR-199a-5p有望成為宮頸癌新的治療靶點。

本研究結(jié)果顯示，卵巢癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶組織中 miR-199a-5p 表達量明顯低于良性卵巢腫瘤及正常卵巢組織，提示 miR-199a-5p與上皮性卵巢癌的發(fā)病具有密切聯(lián)系。卵巢癌轉(zhuǎn)移灶中 miR-199a-5p表達量低于原發(fā)灶，提示miR-199a-5p可能參與卵巢癌的轉(zhuǎn)移過程。有研究表明，復發(fā)性卵巢癌和原發(fā)性卵巢癌組織中miR-199a-5p表達具有差異性，且miR-199a-5p表達量與患者無進展生存、總生存率有關(guān)[15]。這一研究進一步提示我們miR-199a-5p表達量與卵巢癌轉(zhuǎn)移及預后有關(guān)。國內(nèi)李燕彬等[16]檢測了miR-199a-5p在胃癌組織及癌旁正常組織表達情況，miR-199a-5p在胃癌中表達較正常胃黏膜組織明顯下降，miR-199a-5p的表達量與腫瘤大小、分期、分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示上皮性卵巢癌原發(fā)灶miR-199a-5p表達量與上皮性卵巢癌FIGO分期有關(guān)，Ⅲ期上皮性卵巢癌原發(fā)灶miR-199a-5p表達量低于Ⅱ期上皮性卵巢癌，進一步表明miR-199a-5p參與上皮性卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過程，并且與上皮性卵巢癌的進展相關(guān)。但本研究結(jié)果顯示，上皮性卵巢癌原發(fā)灶miR-199a-5p表達量與上皮性卵巢癌病理分級、組織學類型無關(guān)。考慮為樣本量較小導致的，今后如有條件，可進一步擴大樣本量繼續(xù)研究。

綜上，Ⅱ～Ⅲ期上皮性卵巢癌原發(fā)病灶和盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶組織中miR-199a-5p表達降低。檢測上皮性卵巢癌原發(fā)病灶組織中miR-199a-5p表達量有助于判斷上皮性卵巢癌的FIGO分期。在miR-199a-5p可能在上皮性卵巢癌發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮抑癌基因的功能，但這一功能的具體機制不明，今后可以對此進行研究，尋找相關(guān)分子通路上游或下游靶基因，進一步認識卵巢癌發(fā)病的分子機制，并加以干預。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2017.35.012

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1002-266X(2017)35-0039-03

2017-06-07)

國家自然科學基金項目(81360383)。

謝曉英(E-mail:xiexiaoying603@126.com)