沉默INK4基因座中反義非編碼RNA對人宮頸癌細(xì)胞株HeLa增殖的影響及其機(jī)制

梅奇華，楊鴻雁，時黔宇，李瓊，王卓，趙鴻

(黔西南州人民醫(yī)院，貴州黔西南州562400)

沉默INK4基因座中反義非編碼RNA對人宮頸癌細(xì)胞株HeLa增殖的影響及其機(jī)制

梅奇華，楊鴻雁，時黔宇，李瓊，王卓，趙鴻

(黔西南州人民醫(yī)院，貴州黔西南州562400)

目的觀察沉默INK4基因座中反義非編碼RNA(ANRILA)對人宮頸癌細(xì)胞株HeLa增殖的影響，并探討其機(jī)制。方法取對數(shù)生長期HeLa細(xì)胞分為觀察組和對照組，分別ANRIL-siRNA、對照siRNA亂序。轉(zhuǎn)染24、48 h時采用 CCK-8法觀察兩組細(xì)胞增殖情況(結(jié)果以O(shè)D450表示)。轉(zhuǎn)染48 h時采用熒光定量PCR法檢測兩組細(xì)胞ANRIL、p21、周期蛋白依賴性激酶6(CDK6)、周期蛋白依賴性激酶2(CDK2) mRNA相對表達(dá)量，采用CHIP實(shí)驗(yàn)觀察兩組細(xì)胞p21基因H3K27位點(diǎn)三甲基化狀態(tài)。結(jié)果轉(zhuǎn)染24 h觀察組、對照組OD450分別為0.55±0.08、0.84±0.11，轉(zhuǎn)染72 h觀察組、對照組OD450分別為1.21±0.12、1.82±0.14。轉(zhuǎn)染24、72 h觀察組OD450均低于對照組(P<0.05)。轉(zhuǎn)染48 h觀察組ANRIL及CDK6、CDK2 mRNA相對表達(dá)量低于對照組(P均<0.05)，p21 mRNA相對表達(dá)量高于對照組(P均<0.05)。轉(zhuǎn)染48 h兩組細(xì)胞p21基因H3K27位點(diǎn)三甲基化水平觀察組、對照組分別為1.19±0.08、5.62±0.21，觀察組低于對照組(P<0.05)。結(jié)論沉默ANRIL可抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖。其機(jī)制是沉默ANRIL可以降低宮頸癌HeLa細(xì)胞p21基因H3K27位點(diǎn)三甲基化水平，促進(jìn)p21mRNA表達(dá)，抑制CDK6、CDK2 mRNA表達(dá)，從而抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖。

宮頸腫瘤；宮頸癌；長鏈非編碼RNA;INK4基因座中反義非編碼RNA;細(xì)胞增殖；p21基因；周期蛋白依賴性激酶；甲基化

Abstract:ObjectiveTo observe the effect of silencing ANRIL on the proliferation of human cervical cancer cell line HeLa and to explore its mechanism.MethodsThe HeLa cells in the logarithmic phase were divided into the observation group and the control group, which were transfected with ANRIL-siRNA and control siRNA, respectively. After 24 and 48 h transfection, the proliferation of the two groups was observed by CCK-8 method (the result was expressed by OD450). The expression of ANRIL, p21, cell cycle dependent kinase 6 (CDK6) and cyclin-dependent kinase 2 (CDK2) mRNA was detected by fluorescence quantitative PCR at 48 h after transfection, and CHIP assay was used to detect H3K27me3 in p21 gene of the two groups.ResultsAt 24 h after transfection, OD450of the observation group and the control group were 0.55±0.08 and 0.84±0.11, respectively. At 72 h, OD450of the observation group and the control group were 1.21±0.12 and 1.82±0.14, respectively. The OD450of the observation group was lower than that of the control group at 24 and 72 h after transfection (allP<0.05). The mRNA expression of ANRIL, CDK6, and CDK2 in the observation group was lower than that in the control group at 48 h after transfection (allP<0.05), while the expression of p21 in the observation group was higher than that in the control group (P<0.05). H3K27me3 level of p21 gene in the observation group was 1.19±0.08, which was lower than that (5.62±0.21) of the control group at 48 h (P<0.05).ConclusionSilencing ANRIL can inhibit the proliferation of cervical cancer HeLa cells by reducing the H3K27me3 level in p21 gene, and thus promoting the expression of p21 and inhibiting CDK6 and CDK2 mRNA expression.

Keywords: cervical neoplasms; cervical carcinoma; long non-coding RNA; noncoding RNA in antisense of INK4 loci; p21 gene; cyclin-dependent kinase; methylation

宮頸癌的發(fā)病機(jī)制尚不明確[1～3]，目前仍是臨床研究的熱點(diǎn)。一些長鏈非編碼RNA(LncRNA)參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[4～8]。INK4基因座中反義非編碼RNA(ANRIL)是一條由19個外顯子組成的LncRNA，終產(chǎn)物長度約3 834個堿基，位于p15-p16-p14基因座且與蛋白編碼基因呈反向轉(zhuǎn)錄[9]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織中ANRIL高表達(dá)，提示ANRIL可能參與了宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，但其發(fā)揮的具體作用及作用機(jī)制尚不明確。為此，本研究觀察了沉默和過表達(dá)ANRIL對宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖的影響，并探討其機(jī)制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器 人宮頸癌HeLa細(xì)胞株購自上海中科院生化細(xì)胞所細(xì)胞庫，培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清，ANRIL siRNA由廣州銳博生物技術(shù)有限公司合成。siRNA瞬時轉(zhuǎn)染試劑均采用Invitrogen公司的Lipofectamine 2000包裹。PCR熒光染料為TAKATA SYBR Green，Ki67、H3K27me3抗體購自美國abcam公司，KLF2、p21抗體購自美國Millipore公司。蛋白提取采用碧云天公司RIPA中型裂解液，RNA提取采用TAKARA公司TRIzol試劑，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TAKARA公司，細(xì)胞增殖檢測采用日本同仁公司CCK-8試劑盒，引物由上海上海生工生物技術(shù)有限公司合成。RIP試劑盒為Millipore公司Magna RIP RNA-Binding Protein Immunoprecipitation Kit(17-700)，CHIP試劑盒購自Millipore公司(17-295)，G蛋白磁珠購自Santa Cruz公司。細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自Roche公司。熒光定量PCR儀、檢測酶標(biāo)儀購自Bio-Rad公司。

1.2 HeLa細(xì)胞分組及ANRIL-siRNA轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期HeLa細(xì)胞，培養(yǎng)至細(xì)胞密度約70%時換為無血清培養(yǎng)基饑餓2 h, 設(shè)觀察組和對照組。觀察組轉(zhuǎn)染ANRIL-siRNA，對照組轉(zhuǎn)染Lipofectamine 3000包裹的對照siRNA亂序(NC)。將轉(zhuǎn)染后細(xì)胞置于5 % CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 兩組細(xì)胞增殖情況觀察 分別于轉(zhuǎn)染24、48 h時采用 CCK-8法檢測兩組細(xì)胞增殖情況。操作按試劑盒說明書進(jìn)行。采用熒光酶標(biāo)儀檢測450 nm處光密度(OD450)值，以此表示各組細(xì)胞增殖情況。

1.4 兩組細(xì)胞ANRIL及p21、CDK6、CDK2mRNA檢測 采用熒光定量PCR法，取轉(zhuǎn)染48 h各組細(xì)胞，采用TRIzol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄PCR采用TAKARA公司RT試劑盒、20 μL體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以GAPDH作為內(nèi)參，引物序列為：ANRIL上游引物5′-CAACATCCACCACTGGATCTTAACA-3′；下游引物5′-AGCTTCGTATCCCCAATGAGATACA-3′。 p21上游引物5′-GGAGGCAAAAGTCCTGTGTTC-3′；下游引物5′- GGAAGGGGAGGATTTGACGA-3′。CDK6上游引物5′-TGGTAACTCCTTCCCCAGAGT-3′；下游引物5′-CGAAGCGAAGTCCTCAACAC-3′。CDK2上游引物5′-CTTTGCTGAGATGGTGACTCG-3′；下游引物5′-TCATCCAGGGGAGGTACAACT-3′。GAPDH上游引物5′-AATGGGCAGCCGTTAGGAAA-3′；下游引物5′-GCGCCCAATACGACCAAATC-3′。實(shí)驗(yàn)條件為92 ℃預(yù)變性3 min，92 ℃ 30 s、58 ℃、10s，共39個循環(huán)，72 ℃ 2 min。用2-ΔΔCt表示ANRIL的相對表達(dá)量。

1.5 兩組細(xì)胞p21基因H3K27位點(diǎn)三甲基化水平觀測 采用CHIP實(shí)驗(yàn)。取各組細(xì)胞，醛固定交聯(lián)后，細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，超聲破碎，加入H3K27me3抗體孵育過夜，過夜后加入磁珠捕獲蛋白DNA結(jié)合的復(fù)合物，隨后使用洗滌液洗滌，再加入5 mmol/L NaCl解交聯(lián)，解交聯(lián)結(jié)束后回收DNA，采用熒光定量PCR法檢測復(fù)合物中ANRIL相對表達(dá)量。方法同1.3。以復(fù)合物中ANRIL相對表達(dá)量表示兩組細(xì)胞p21基因H3K27位點(diǎn)三甲基化水平。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染24、72 h兩組細(xì)胞OD450比較 轉(zhuǎn)染24 h觀察組、對照組OD450分別為0.55±0.08、0.84±0.11，轉(zhuǎn)染72 h觀察組、對照組OD450分別為1.21±0.12、1.82±0.14。轉(zhuǎn)染24、72 h時觀察組OD450均低于對照組(P<0.05)。

2.2 轉(zhuǎn)染48 h兩組細(xì)胞ANRIL及p21、CDK6、CDK2 mRNA相對表達(dá)量比較 轉(zhuǎn)染48 h兩組細(xì)胞ANRIL及p21、CDK6、CDK2 mRNA相對表達(dá)量見表1。轉(zhuǎn)染48 h觀察組ANRIL及CDK6、CDK2 mRNA相對表達(dá)量低于對照組(P均<0.05)，p21 mRNA相對表達(dá)量高于對照組(P<0.05)。

表1 轉(zhuǎn)染48 h兩組細(xì)胞ANRIL及p21、CDK6、CDK2 mRNA相對表達(dá)量比較

注：與對照組相比，*P<0.05。

2.3 轉(zhuǎn)染48 h兩組細(xì)胞p21基因H3K27位點(diǎn)三甲基化水平比較 轉(zhuǎn)染48 h兩組細(xì)胞p21基因H3K27位點(diǎn)三甲基化水平觀察組、對照組分別為1.19±0.08、5.62±0.21，觀察組低于對照組(P<0.05)。

3 討論

LncRNA是一類長度超過200 bp的轉(zhuǎn)錄本，具有復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)，相較于microRNA，其作用方式更為復(fù)雜[11]，例如HotAir、Xist等可以與蛋白修飾復(fù)合體互作，影響組蛋白H3K27表觀遺傳學(xué)改變[12]，而H19則可以作為分子篩，發(fā)揮類似海綿作用吸附microRNA分子[13]，最終影響靶mRNA。有別于microRNA分子相對單一的抑制作用，LncRNA既可促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄，也可以抑制轉(zhuǎn)錄；既可以結(jié)合核酸，也可以結(jié)合蛋白；既可以修飾蛋白質(zhì)，也可以影響mRNA的成熟和穩(wěn)定。近期越來越多的研究者發(fā)現(xiàn)，LncRNA在腫瘤的演進(jìn)中扮演關(guān)鍵角色，與腫瘤的增殖、凋亡、遷移、侵襲密切相關(guān)，例如 HOTTIP通過調(diào)控HOXA13基因轉(zhuǎn)錄參與肝癌增殖、侵襲等變化，并與患者的預(yù)后相關(guān)[13]；GIHCG可以通過調(diào)控miR-200b/a/429促進(jìn)肝癌進(jìn)展[14]；MALAT1通過沉默miR-140促進(jìn)葡萄膜黑素瘤細(xì)胞增殖和遷移[15]；ANRIL作為發(fā)現(xiàn)較早的分子，被發(fā)現(xiàn)可以作為癌基因促進(jìn)多個腫瘤的增殖、侵襲[16]。然而，宮頸癌相關(guān)的LncRNA研究卻非常少。

本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染ANRILsiRNA 的HeLa細(xì)胞增殖能力下降。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，沉默ANRIL后，細(xì)胞周期監(jiān)測點(diǎn)蛋白p21 mRNA上調(diào)，而CDK2、CDK6下調(diào)。p21基因也被稱為細(xì)胞周期依賴性激酶抑制劑1或CDK反應(yīng)蛋白1，位于p53基因下游的細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制因子，p21和p53一起構(gòu)成了細(xì)胞周期G1檢查站[17]，假如腫瘤細(xì)胞因快速增殖而產(chǎn)生了DNA損傷，而這些損傷不能得到及時的修復(fù)，那么該細(xì)胞則無法通過G1檢查站。p21通過這一作用減少了受損DNA的復(fù)制和積累，從而協(xié)同p53發(fā)揮抑癌作用。CDK2是重要的細(xì)胞周期推動因素，屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，也被稱為細(xì)胞分裂蛋白激酶2，調(diào)控細(xì)胞周期由G1到S期轉(zhuǎn)換。CDK6也是細(xì)胞周期由G1到S期轉(zhuǎn)換的主要推動因素之一，受到細(xì)胞周期蛋白cyclin D的調(diào)控。由此可知， ANRIL通過調(diào)控p21轉(zhuǎn)錄，進(jìn)一步調(diào)控細(xì)胞周期依賴性激酶CDK2、CDK6的表達(dá)，從而操控細(xì)胞周期，發(fā)揮癌基因的作用。

ANRIL主要定位于細(xì)胞核內(nèi)，提示其可與蛋白交互作用發(fā)揮功能，既往研究提示 ANRIL可引起多個基因的啟動子區(qū)組蛋白表觀遺傳學(xué)印記改變，從而調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。組蛋白H3的不同賴氨酸殘疾的甲基化/乙?；癄顟B(tài)對基因的轉(zhuǎn)錄激活或抑制發(fā)揮著不同的作用， H3K27位點(diǎn)三甲基化抑制基因轉(zhuǎn)錄。本研究結(jié)果顯示，沉默ANRIL后HeLa細(xì)胞p21基因H3K27位點(diǎn)三甲基化水平降低，這應(yīng)該是HeLa細(xì)胞p21 mRNA表達(dá)上調(diào)的原因。

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Effect of silencing ANRIL on proliferation of human cervical cancer cell line HeLa

MEIQihua,YANGHongyan,SHIQianyu,LIQiong,WANGZhuo,ZHAOHong

(Qianxi'nanPeople'sHospital,Qianxi'nan562400,China)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.35.004

R737.33

A

1002-266X(2017)35-0012-03

2016-10-26)

梅奇華(1972-)，女，主治醫(yī)師，主要研究方向?yàn)閷m頸癌、癌前病變、圍產(chǎn)科學(xué)。E-mail: meiqihua111@sina.com