文冠果葉片離體再生體系的優(yōu)化研究

張凌，郭帥，張蕓香，郭晉平

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 城鄉(xiāng)建設(shè)學(xué)院，山西 太谷 030801)

文冠果葉片離體再生體系的優(yōu)化研究

張凌1，郭帥1，張蕓香1，郭晉平2*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 城鄉(xiāng)建設(shè)學(xué)院，山西 太谷 030801)

[目的]探明不同處理對(duì)文冠果葉片離體再生體的反應(yīng)。[方法]以成熟文冠果葉片作為外植體，通過誘導(dǎo)和培養(yǎng)的方法，研究不同培養(yǎng)基激素配比對(duì)文冠果離體培養(yǎng)的影響。[結(jié)果]2,4-D及其與BA組合誘導(dǎo)的愈傷組織不適宜進(jìn)行間接不定芽誘導(dǎo)；MS培養(yǎng)基中添加2.0 mg·L-1KT和0.2 mg·L-1NAA時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率最高，且在愈傷組織上可分化出不定芽，是葉片通過愈傷組織誘導(dǎo)不定芽再生的一條最佳途徑。IBA與NAA、IAA組合中，NAA、IAA濃度為1.0 mg·L-1時(shí)，為最佳生長素配比；生長素速蘸方法不適宜進(jìn)行試管苗生根培養(yǎng)。[結(jié)論]不同組合和配比生長系，對(duì)文冠果再生體有不同效果。

文冠果；葉片外植體；間接器官發(fā)生；增殖；生根

Abstract:[Objective]To ascertain the reaction of different treatments. [Methods]The effects of hormone ratio on the culture ofXanthocerassorbifoliawere studied by induction and culturemethod . The conditions of indirect adventitious bud induction, adventitious bud proliferation and rooting culture were studied.[Results]The results showed that the 2,4-D and BA combination were not suitable for callus indirect adventitious bud induction. MS culture medium with 2.0 mg·L-1KT and 0.2 mg·L-1NAA, were the highest callus induction rate and callus differentiation of adventitious buds. The best way of regeneration was that leaves through callus induction of adventitious buds. The best auxin ratio was NAA, IAA concentration of 1.0 mg·L-1,IBA the combination with NAA and IAA. The auxin fast dipmethod was not suitable for the test tube rooting culture.[Conclusion]Different combination and proportions of auxin have different effect on regenetion.

Keywords:Xanthocerassorbifolia, Leaf explants, Indirect organogenesis, Proliferation, Rootage

文冠果(Xanthocerassorbifolia)，又名文冠花、文登閣、崖木瓜等，為無患子科植物，落葉喬木或灌木[1]。文冠果是中國特有的溫帶木本油料植物[2]，其種子含油率達(dá)30%～60%, 種仁含油率高達(dá)55%～66%，被譽(yù)為“北方油茶”[3]。文冠果油為半干性油，透明，氣味芳香，是一種優(yōu)良食用、藥用和生物柴油原料[4]，具有很大的開發(fā)利用價(jià)值。文冠果適應(yīng)性強(qiáng)，是綠化荒山的先鋒樹種，根系發(fā)達(dá)、根萌蘗性強(qiáng)，也是很好的水土保持樹種。

目前文冠果種質(zhì)資源缺乏、繁殖困難、后代變異分化嚴(yán)重,且文冠果種子繁殖個(gè)體性狀差異顯著，進(jìn)而影響產(chǎn)量。此外，文冠果的嫁接繁殖成活率也較低[5]，因此，研究文冠果組織培養(yǎng)及營養(yǎng)器官立體再生，可以快速繁殖文冠果苗，培育性狀穩(wěn)定且優(yōu)良的樹種。

對(duì)于文冠果無性器官離體培養(yǎng)的研究已有一些報(bào)道，如王玉珍[6]、柳金鳳[7]、任如意[8]采用文冠果的嫩莖作為外植體進(jìn)行培養(yǎng)；柳金鳳[7]、宋群雁[9]用文冠果的葉片作為外植體進(jìn)行培養(yǎng)；黃永偉[10]、蘭士波[11]、王非[12]等對(duì)文冠果生根的激素配比進(jìn)行了研究。

本研究以成熟文冠果葉片作為外植體，通過器官間接再生途徑對(duì)不定芽進(jìn)行誘導(dǎo)，并對(duì)不定芽的增殖和生根問題進(jìn)行了研究，旨在通過研究文冠果組織培養(yǎng)及營養(yǎng)器官的離體再生，快速繁殖優(yōu)良性狀的文冠果品種。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用葉片采自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院苗圃栽培的7年生文冠果實(shí)驗(yàn)林，挑選健康、無病蟲害植株，采集其葉片作為試驗(yàn)所用的外植體。將采回的葉片用流水沖洗過后，放置在超凈臺(tái)上進(jìn)行消毒。先用75%酒精處理30 s，無菌蒸餾水沖洗3次，再用0.1%升汞消毒4 min，無菌水沖洗5～6次，去掉葉片邊緣，準(zhǔn)備接種，所有葉片以遠(yuǎn)軸面接觸培養(yǎng)基。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)所用培養(yǎng)基中均添加蔗糖3%，瓊脂4.3 g·L-1，pH調(diào)至5.8～5.9，121 ℃高壓滅菌15 min。所有培養(yǎng)物均于(25±2)℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.1 葉片間接愈傷組織的誘導(dǎo)

(1)不同濃度2,4-D及其與BA對(duì)葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響

將滅菌后的葉片外植體接種于MS基本培養(yǎng)基上，并添加不同濃度的2,4-D(0.1,0.5,1.0,2.0,5.0 mg·L-1)及其分別與1.0 mg·L-1BA組合。本階段葉片接種于培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿接種20個(gè)葉片，每個(gè)組合接種3個(gè)培養(yǎng)皿，重復(fù)3次。30 d后統(tǒng)計(jì)葉片愈傷組織誘導(dǎo)率和不定芽誘導(dǎo)率。

(2)不同濃度KT與NAA組合對(duì)葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響

將滅菌后的葉片外植體接種到添加0.02 mg·L-1NAA的MS培養(yǎng)基上，并添加不同濃度的KT(1.0,2.0,3.0,5.0 mg·L-1)，共4個(gè)組合。本階段葉片接種于培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿接種20個(gè)葉片，每個(gè)組合接種3個(gè)培養(yǎng)皿，重復(fù)3次。30 d后統(tǒng)計(jì)文冠果葉片愈傷組織誘導(dǎo)率和不定芽誘導(dǎo)率。

1.2.2 葉片不定芽分化培養(yǎng)

將誘導(dǎo)出愈傷組織的葉片轉(zhuǎn)接于MS培養(yǎng)基上，并添加2.0 mg·L-1BA和0.2 mg·L-1NAA，進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)。

1.2.3 試管苗的生根培養(yǎng)

(1)不同濃度NAA、IAA與IBA組合對(duì)試管苗生根培養(yǎng)的影響

將繼代增殖的試管苗轉(zhuǎn)接于上述篩選出的最佳基本培養(yǎng)基，添加0.5 mg·L-1IBA與不同濃度(0.5, 1.0， 2.0 mg·L-1)的NAA與IAA組合，30 d后統(tǒng)計(jì)試管苗的生根率、生根數(shù)及根長。

(2)生長素速蘸法對(duì)試管苗生根培養(yǎng)的影響

將繼代增殖的試管苗分別在含有不同濃度的NAA和IBA溶液中速蘸，其濃度分別為：50、100和200 mg·L-1，然后轉(zhuǎn)接到不含任何生長素的基本培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，30 d后統(tǒng)計(jì)生根率、生根數(shù)及根長。

2 結(jié)果與分析

2.1 2,4-D對(duì)葉片愈傷組織及不定芽誘導(dǎo)的影響

在所有的培養(yǎng)基中均觀察到，外植體有所膨大，30 d后，在葉脈或切口邊緣處均誘導(dǎo)出淡黃、疏松愈傷，以葉脈數(shù)居多，有些外植體的整個(gè)葉脈都被愈傷組織覆蓋，少數(shù)外植體分化出雪白或淡黃粘稠狀的愈傷組織(圖1)。方差分析表明，2，4-D濃度對(duì)葉片愈傷組織誘導(dǎo)影響顯著(P=0.034)。

圖1 淡黃、疏松的愈傷組織圖Fig.1 Pale yellow, loose callus

2,4-D濃度為0.1 mg·L-1時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)96.67%，但愈傷量較少；2,4-D升高至0.5 mg·L-1，愈傷組織誘導(dǎo)率高達(dá)100.00%，而且愈傷量最多；繼續(xù)升高，誘導(dǎo)率仍高達(dá)100.00%，但愈傷量逐漸減少，見表1。

表1 2,4-D濃度對(duì)葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響因素
Table1 Effect of different concentration of 2,4-D on callus induction

2,4-D/mg·L-1愈傷誘導(dǎo)率/%Callusinduction生長狀態(tài)Growthsituation0.196.67±1.67b少量淡黃、疏松愈傷0.5100.00±0.00a大量淡黃、疏松愈傷,少部分為雪白色或淡黃粘稠狀1.0100.00±0.00a適量淡黃白色、疏松愈傷2.0100.00±0.00a少量淡黃白色、疏松愈傷5.0100.00±0.00a少量淡黃白色、疏松愈傷

將誘導(dǎo)的白色、結(jié)構(gòu)疏松的愈傷組織轉(zhuǎn)接到MS培養(yǎng)基并添加2.0 mg·L-1BA和0.2 mg·L-1NAA，愈傷組織未分化出不定芽；隨著時(shí)間的延長，會(huì)出現(xiàn)輕微褐化現(xiàn)象。因此，通過2,4-D誘導(dǎo)的愈傷組織不能間接誘導(dǎo)出不定芽。

2.22,4-D與BA組合對(duì)葉片愈傷組織及不定芽誘導(dǎo)的影響

所有2,4-D與BA組合中均觀察到，在葉脈與切口處分化出淡黃、松軟的愈傷組織，甚至整個(gè)葉片外植體也被愈傷組織包圍，見圖2。方差分析表明，2,4-D與BA組合對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)率影響顯著(P=0.007)。

圖2 松軟的愈傷組織Fig.2 Soft callus

培養(yǎng)基中添加低濃度的2,4-D，愈傷組織誘導(dǎo)率較低，且愈傷量較少；隨著2,4-D濃度的不斷增加，愈傷組織誘導(dǎo)率逐漸升高。2,4-D濃度升高至1.0 mg·L-1，愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)到最高，達(dá)98.41%，愈傷量也較多；繼續(xù)升高，誘導(dǎo)率略有下降，見表2。

表2 2,4-D與BA組合對(duì)葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 2 Effect of the combination of 2,4-D and BA on callus induction

將淡黃、松軟愈傷組織轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基中也未能分化出不定芽。因此，通過2,4-D與BA組合誘導(dǎo)的愈傷組織不適宜進(jìn)行間接不定芽誘導(dǎo)。

2.3KT與NAA組合對(duì)葉片愈傷組織及不定芽誘導(dǎo)的影響

所有KT與NAA組合中，均誘導(dǎo)出淡黃、松軟或淡綠、致密愈傷組織(圖3)。方差分析表明，KT與NAA組合對(duì)葉片愈傷組織誘導(dǎo)率影響顯著(P<0.001)。

研究結(jié)果表明，培養(yǎng)基增加1.0 mg·L-1KT和0.2 mg·L-1NAA，愈傷組織的誘導(dǎo)率較低，達(dá)78.70%；隨著KT濃度的升高，愈傷組織誘導(dǎo)率亦逐漸升高。當(dāng)KT濃度為2.0 mg·L-1時(shí)，愈傷組織的誘導(dǎo)率最高，達(dá)88.32%；繼續(xù)升高，愈傷組織誘導(dǎo)率呈下降趨勢(shì)，見表3。

圖3 淡綠、致密的愈傷組織Fig.3 Light green, dense callus

30 d后，將淡綠、致密愈傷組織轉(zhuǎn)接到新鮮培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，可分化出不定芽芽點(diǎn)，繼而進(jìn)一步生長。

因此，MS培養(yǎng)基中添加2.0 mg·L-1KT和0.2 mg·L-1NAA時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率最高，且在愈傷組織上可分化出不定芽，為葉片通過愈傷組織途徑誘導(dǎo)不定芽再生的最佳途徑。

2.4不同濃度NAA、IAA與IBA組合對(duì)試管苗生根培養(yǎng)的影響

1/2MS作為基本培養(yǎng)基，將0.5 mg·L-1IBA與不同濃度的NAA和IAA組合，進(jìn)行試管苗生根培養(yǎng)。觀察發(fā)現(xiàn)，試管苗誘導(dǎo)的根部部分呈膨松狀，而且逐漸變黃、枯死，其余生長正常，見圖4。

表3 KT與NAA組合對(duì)葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 3 Effect of the combination of KT and NAA on callus induction

圖4 生根苗Fig.4 Rooting seedlings

方差分析表明，生長素組合對(duì)試管苗的生根率(P=0.019)、生根數(shù)(P=0.001)和根長(P=0.005)均有顯著性影響。

IBA與NAA組合中，NAA濃度為1.0 mg·L-1，生根率最高，達(dá)30.60%，高于或低于此濃度，生根率均有所降低；生根數(shù)與生根率呈相同趨勢(shì)，NAA濃度為1.0 mg·L-1，生根數(shù)達(dá)到最大，為5.90，高于或低于此濃度，生根數(shù)均有所降低；NAA濃度為0.5 mg·L-1，根長最長，為1.59 cm，見表4。

IBA與IAA組合中，IAA濃度為1.0 mg·L-1，生根率最高，達(dá)33.63%，高于或低于此濃度，生根率均有所降低；生根數(shù)與生根率呈相同趨勢(shì)，IAA濃度為1.0 mg·L-1，生根數(shù)達(dá)到最大，為3.00，高于或低于此濃度，生根數(shù)均有所降低；IAA濃度為0.5 mg·L-1，根長最長，為3.78 cm，見表4。另外，當(dāng)IAA濃度為1.0 mg·L-1時(shí)，發(fā)現(xiàn)有少量側(cè)根出現(xiàn)，生根苗可以正常生長。

2.5 生長素速蘸法對(duì)試管苗生根培養(yǎng)的影響

試管苗經(jīng)不同濃度的生長素速蘸后，培養(yǎng)于未添加任何生長素的1/2MS培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，觀察發(fā)現(xiàn)(表5)，所有試管苗均未誘導(dǎo)生根，且當(dāng)生長素的濃度高于50 mg·L-1時(shí)，出現(xiàn)輕微玻璃化現(xiàn)象，見圖5，這種現(xiàn)象隨著生長素濃度的升高而加劇。因此，生長素速蘸方法不適宜進(jìn)行試管苗生根培養(yǎng)。

表4 不同濃度NAA、IAA與IBA組合對(duì)文冠果生根培養(yǎng)的影響Table 4 Effect of different NAA、IAA combination with IBA on rooting of in vitro regenerated shoots

圖5 玻璃化的試管苗Fig.5 Test tube seedling

表5生長素濃度速蘸對(duì)試管苗生根的影響
Table5 Effect ofspeed-dip in auxins method on rooting of in vitro regenerated shoots

生長素/mg·L-1Auxins生根率/%Rooting生長狀況GrowthsituationNAA500.00未誘導(dǎo)出根,逐漸枯黃NAA1000.00出現(xiàn)輕微玻璃化現(xiàn)象,未誘導(dǎo)出根NAA2000.00出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象,未誘導(dǎo)出根IBA500.00未誘導(dǎo)出根,逐漸枯黃IBA1000.00出現(xiàn)輕微玻璃化現(xiàn)象,未誘導(dǎo)出根IBA2000.00出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象,未誘導(dǎo)出根

3 討論與結(jié)論

愈傷組織的誘導(dǎo)與植物生長調(diào)節(jié)劑的種類和密度密切相關(guān)。一般來說，誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生及增殖最常用的植物生長調(diào)節(jié)劑是2,4-D[13]。但長時(shí)間使用高濃度的2,4-D反而會(huì)影響愈傷組織的形態(tài)特征，限制愈傷組織的再分化。因此，篩選植物生長調(diào)節(jié)劑的種類和濃度就顯得尤為重要。

本試驗(yàn)單獨(dú)添加2,4-D，研究其對(duì)葉片愈傷組織及不定芽的誘導(dǎo)，結(jié)果表明，所有的培養(yǎng)基中均誘導(dǎo)出白色、結(jié)構(gòu)疏松的愈傷組織，但誘導(dǎo)的愈傷量有所差別。將誘導(dǎo)的愈傷組織轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基中，均未能誘導(dǎo)出不定芽，說明2,4-D誘導(dǎo)的愈傷組織不能進(jìn)行不定芽再生。此結(jié)論與王慧梅[14]在喜樹愈傷組織的誘導(dǎo)和不定芽再生研究結(jié)論一致。也有研究表明，較高濃度的2,4-D對(duì)Chinese Leymus 組織培養(yǎng)再生芽的誘導(dǎo)非常有效[15]。

為實(shí)現(xiàn)葉片間接不定芽誘導(dǎo)，本試驗(yàn)對(duì)2,4-D與1.0 mg·L-1BA組合進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，所有培養(yǎng)基均誘導(dǎo)出淡黃、松軟的愈傷組織。將誘導(dǎo)的淡黃、松軟愈傷組織轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，均未能誘導(dǎo)出不定芽。由此可見，2,4-D與1.0 mg·L-1BA組合也不適宜用于葉片間接不定芽誘導(dǎo)。在復(fù)葉槭組織培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)，MS培養(yǎng)基添加1.0 mg·L-1BA和0.01 mg·L-12,4-D，葉片外植體分化出黃綠色、致密愈傷組織，尤其在葉脈處分化愈傷組織較多[16]。在草莓體外培養(yǎng)再生研究中發(fā)現(xiàn)，不同濃度的2,4-D與BA組合，誘導(dǎo)出的愈傷組織為淡黃色或黃色，顆粒狀，緊實(shí)，較干燥或濕潤，轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，約70.5%的愈傷組織可分化出不定芽[17]。

本研究對(duì)KT和NAA組合進(jìn)行葉片愈傷組織誘導(dǎo)及不定芽再生研究，結(jié)果表明，所有培養(yǎng)基中，均誘導(dǎo)出淡黃、松軟或淡綠、致密愈傷組織；培養(yǎng)基添加2.0 mg·L-1KT和0.2 mg·L-1NAA，愈傷組織誘導(dǎo)率最高，繼續(xù)培養(yǎng)可分化出不定芽。草莓葉片外植體在KT和NAA的組合下，誘導(dǎo)的愈傷組織為淡黃或黃色，顆粒狀，緊實(shí)，較干燥或濕潤，在分化培養(yǎng)基中也可分化出不定芽[17]，而對(duì)高山紅景天葉片外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)研究時(shí)得出，培養(yǎng)基添加KT和NAA，愈傷組織誘導(dǎo)率最低，誘導(dǎo)效果最差[18]。以上現(xiàn)象可能是由于不同樹種因其內(nèi)源激素不同，對(duì)同種激素組合的反應(yīng)也有所差異。

NAA、IBA和IAA是目前最常用的生長素。通常認(rèn)為，同時(shí)使用兩種或兩種以上的生長素，對(duì)生根培養(yǎng)的效果要好于單獨(dú)使用某一種生長素。將IBA與NAA、IAA組合，結(jié)果表明， IBA與NAA組合，NAA濃度為1.0 mg·L-1，生根率最高，生根數(shù)達(dá)到最大，根長適宜生長，IBA與IAA組合，IAA濃度為1.0 mg·L-1，生根率最高，生根數(shù)達(dá)到最大，根長適宜生長。

試驗(yàn)采用不同濃度的NAA和IBA速蘸后，培養(yǎng)與為添加任何生長素的1/2MS培養(yǎng)基中，研究發(fā)現(xiàn)，所有的試管苗均未誘導(dǎo)生根?？梢?，高濃度的生長素速蘸對(duì)試管苗生根是無效的。而對(duì)翅果油樹的生根研究發(fā)現(xiàn)，在200 mg·L-1IBA溶液中浸泡30 min，生根效果較好。這可能是不同樹種對(duì)生長素刺激的反應(yīng)不同。

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(編輯：梁文俊)

StudyonoptimizationofXanthocerassorbifolialeafregenerationsystem

Zhang Ling1, Guo Shuai1, Zhang Yunxiang1, Guo Jinping2*

(1.CollegeofForestry,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China；2.CollegeofUrbanandRuralConstruction,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China)

S792.99

A

1671-8151(2017)10-0707-06

2017-04-15

2017-06-25

張凌(1972-)，女(漢)，碩士，實(shí)驗(yàn)師，研究方向：森林培育、森林生態(tài)

*通信作者：郭晉平，教授，博士生導(dǎo)師，Tel:0354-6288227；E-mail: jinpguo@126.com

山西省留學(xué)基金(2014041)；山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目(20120311015-3)