葛根素配伍丹酚酸B注射使用對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用

楊華，董兵，宋瑩瑩

（1.江蘇省東?？h人民醫(yī)院藥劑科，江蘇連云港222300；2.江蘇省東?？h市場監(jiān)督管理局，江蘇連云港 222300）

葛根素配伍丹酚酸B注射使用對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用

楊華1＊，董兵2，宋瑩瑩1

（1.江蘇省東海縣人民醫(yī)院藥劑科，江蘇連云港222300；2.江蘇省東?？h市場監(jiān)督管理局，江蘇連云港 222300）

目的：研究葛根素配伍丹酚酸B注射使用對大鼠心肌缺血再灌注損傷（MIRI）的保護作用。方法：將62只大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、葛根素組（20 mg/kg）和葛根素（20 mg/kg）-丹酚酸B不同配比組（質(zhì)量比分別為1∶0.5、1∶1、1∶2），每組10只。除假手術(shù)組外，其余各組大鼠復(fù)制MIRI模型。再灌注180 min后，檢測大鼠血清中肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）水平及心肌梗死面積百分比。結(jié)果：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中CK、LDH、MDA水平明顯升高（P＜0.01），SOD水平明顯降低（P＜0.01）；心肌梗死面積百分比明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠血清中CK、LDH、MDA水平明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），SOD水平明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），其中葛根素-丹酚酸B（1∶1）組指標變化最為明顯；心肌梗死面積百分比明顯降低（P＜0.01），其中葛根素-丹酚酸B（1∶1）組和（1∶2）組小鼠的心肌梗死面積小于葛根素注射劑組（P＜0.01）。結(jié)論：葛根素注射劑配伍丹酚酸B后較單用葛根素注射劑能更有效地抑制MIRI后心肌細胞損傷、減小心肌梗死面積，且以質(zhì)量比為1∶1時效果最優(yōu)。

葛根素；丹酚酸B；缺血再灌注損傷；心肌梗死；大鼠

ABSTRACTOBJECTIVE：To study the protective effect of the injection of puerarin combined with salvianoli acid B（Sal B）on rats with myocardial ischemia reperfusion injury（MIRI）.METHODS：62 rats were randomly divided into sham operation group，model group，puerarin group（20 mg/kg）and puerarin（20 mg/kg）-Sal B group（mass ratio of 1∶0.5，1∶1，1∶2，respectively），10 in each group.Except for sham operation group，rats in other groups were reduced for MIRI model.After 180 min of reperfusion，kinase（CK），lactate dehydrogenase（LDH），superoxide dismutase（SOD），malondialdehyde（MDA）in serum and percentage of myocardial infarction size of rats were detected.RESULTS：Compared with sham operation group，CK，LDH，MDA levels in serum of rats in model group were obviously increased（P＜0.01），SOD level was obviously decreased（P＜0.01）；and percentage of myocardial infarction size was obviously increased（P＜0.01）.Compared with model group，CK，LDH，MDA levels in serum of rats in each administration group were decreased（P＜0.05 or P＜0.01），SOD levels were obviously increased（P＜0.05 or P＜0.01），and indexes changed the most obviously in puerarin-Sal B group（1∶1）；percentage of myocardial infarction size was obviously decreased（P＜0.01），and the percentage of myocardial infarction sizes in puerarin-Sal B group（1∶1）and group（1∶2）were less than Puerarin injection group（P＜0.01）.CONCLUSIONS：Compared with Puerarin injection alone，puerarin combined with Sal B by injection can more effectively inhibit the cardiomyocyte injury and decrease myocardial infarction size after MIRI，with best efficacy when quality ratio is 1∶1.

KEYWORDSPuerarin；Salvianoli acid B；Myocardial ischemia reperfusion injury；Myocardial infarction；Rats

葛根素是從豆科植物野葛或干葛藤的干燥根中提取的一種黃酮苷，具有擴張冠狀動脈、保護心肌缺血再灌注損傷（MIRI）、阻斷β-腎上腺素能受體、抗心律失常、抑制血栓形成、改善微循環(huán)等作用[1-2]，臨床上主要用于冠心病的防治。丹酚酸B是丹參水溶性成分，具有很強的清除自由基和抗氧化作用[3-4]，對缺血再灌注后的心臟微血管內(nèi)皮細胞損傷具有保護作用[5-6]。由丹參、葛根及血竭等中藥組成的冠脈寧片常用于治療冠心病、心絞痛及冠狀動脈缺血不足，其中葛根素和丹酚酸B為其主要活性成分[7-8]；用于治療由氣滯血淤型冠心病引起的胸悶、心絞痛等癥的心可舒制劑，其主要成分也是葛根素和丹酚酸B。可見，葛根素與丹酚酸B配伍的療效是相輔相成的。本研究通過建立大鼠MIRI模型，探討葛根素配伍丹酚酸B注射使用對MIRI大鼠的保護作用，同時尋找兩者最佳配比，為其臨床聯(lián)合用藥提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

MP150多導(dǎo)生理記錄儀（美國Biopac公司）；SC-3人工呼吸器（上海醫(yī)療器械股份有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；UV-120-02紫外分光光度計（日本島津公司）；AR-100全自動生化分析儀（美國Dupont公司）。

1.2 藥品與試劑

葛根素注射劑（山東方明藥業(yè)有限公司，批號：160502，規(guī)格：0.1 g/mL）；丹酚酸B標準品（四川宏益生物工程有限公司，批號：160418，純度：≥98%）；乳酸脫氫酶（LDH）活性檢測試劑盒（上海拜力生物科技有限公司，批號：160201）；磷酸激酶（CK）活性檢測試劑盒（北京雷根生物技術(shù)公司，批號：121129）；超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號：160214）；丙二醛（MDA）活性檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：151223）；其余試劑均為分析純。

1.3 動物

SD大鼠60只，♂，體質(zhì)量（200±20）g，購自南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，動物合格證號：SYXK（蘇）2015-0009。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將60只大鼠隨機分為6組，分別為假手術(shù)組、模型組、葛根素組（20 mg/kg）[9-10]和葛根素（20 mg/kg）-丹酚酸B不同配比組（質(zhì)量比分別為1∶0.5、1∶1、1∶2），每組10只。將各組大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，ip戊巴比妥鈉麻醉（45 mg/kg），仰位固定，采用多導(dǎo)生理記錄儀以標準Ⅱ?qū)?lián)進行心電圖監(jiān)測。然后切開氣管，插入氣管插管，連接呼吸機；胸骨左緣第4肋間隙開胸，打開心包膜，暴露心臟；在左心耳下緣3～4 mm處進針，向肺動脈圓錐方向出針，將一小段1.5 mm聚乙烯管置于結(jié)扎線下，收緊結(jié)扎線以阻斷左冠狀動脈前降支血流。觀察心電圖，以出現(xiàn)心電圖中幅度最大的波群出現(xiàn)高大、增寬為結(jié)扎成功標志[11]。缺血45 min后，取出聚乙烯管（即再灌注），以心電圖中幅度最大的波群振幅逐漸回落為再灌注成功標志。假手術(shù)組大鼠只結(jié)扎不進行手術(shù)。于再灌注開始時各組大鼠尾iv給藥（給予葛根素立即給予丹酚酸B），假手術(shù)組和模型組大鼠給予等體積生理鹽水。

2.2 血清心肌損傷標記物水平及心肌梗死面積檢測

再灌注180 min后，大鼠腹主動脈取血，嚴格按照試劑盒說明書操作，測定各組大鼠血清中CK、LDH、SOD、MDA水平。然后立即處死大鼠并取其心臟，以生理鹽水沖洗后，在左前降支灌入4%伊文氏藍2 mL，2 h后去除心房組織，切成約2 mm厚的心肌組織切片，氯化三苯基四唑氮37℃染色20 min，最后使用10%甲醛固定。光鏡下檢查，存活心肌區(qū)域呈深紅色，梗死心肌區(qū)域呈白色。采集圖像并以Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件分析心肌組織梗死區(qū)、危險區(qū)（伊文氏藍未染區(qū)）和心肌總面積，心肌梗死面積百分比（%）＝左心室組織切片梗死區(qū)面積/左心室心肌組織切片總面積×100%。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料以x±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 血清中CK、LDH、SOD、MDA水平測定結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中CK、LDH、MDA水平明顯升高（P＜0.01），SOD水平明顯降低（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠血清中CK、LDH、MDA水平均明顯降低，SOD水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；其中葛根素-丹酚酸B（1∶1）組大鼠血清中各指標水平改善程度最大，葛根素-丹酚酸B（1∶0.5）組大鼠血清中上述指標改善程度相對較低，結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠血清中CK、LDH、SOD、MDA水平測定結(jié)果（x±s，n＝10）Tab 1 Results of CK，LDH，SOD，MDA levels in serum of rats in each group（x±s，n＝10）

3.2 心肌梗死面積百分比測定結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織切片總面積明顯增大（P＜0.05），心肌梗死面積百分比明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠心肌組織切片總面積差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），心肌梗死面積百分比明顯降低（P＜0.01）；其中葛根素-丹酚酸B（1∶1）組和（1∶2）組大鼠心肌梗死面積百分比低于葛根素組（P＜0.01），且以葛根素-丹酚酸B（1∶1）組大鼠心肌梗死面積百分比最低，結(jié)果見表2。

4 討論

目前，缺血性心臟病是危害人類生命最嚴重的一類常見病、多發(fā)病，其主要病因是冠狀動脈痙攣或梗塞引起心肌缺血、缺氧。再灌注治療是有效恢復(fù)心肌供血、拯救缺血心臟的常用方法，但再灌注帶來的自由基暴發(fā)和心肌鈣離子超載會導(dǎo)致心肌細胞損傷進一步加重[12]。研究表明，SD大鼠于左前降支結(jié)扎45 min后再灌注3 h，可有效建立在體急性MIRI模型[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中LDH、CK、MDA水平明顯升高，SOD水平明顯降低，左心室組織切片總面積明顯增加，提示急性MIRI模型成功建立，左心室發(fā)生重構(gòu)。

表2 各組大鼠心肌梗死面積百分比測定結(jié)果（x±s，n＝10）Tab 1 Results of percentage of myocardial infarction size of rats in each group（x±s，n＝10）

中醫(yī)學(xué)以活血、化瘀、止痛作為缺血性心臟病基本治則[14]。葛根素是從中藥葛根中提取的效應(yīng)成分，可擴張心血管、改善微循環(huán)，臨床多用于急性腦梗死、冠心病等治療[15]。丹酚酸B可通過提高SOD的活力、提高抗氧自由基能力、抑制缺氧缺血所致炎癥反應(yīng)等途徑發(fā)揮抗心肌缺血的作用。葛根素配伍丹酚酸B后，既可發(fā)揮葛根素擴張冠狀血管、改善冠脈微循環(huán)、抗氧化的作用，又能發(fā)揮丹酚酸B提高SOD的活力、對抗氧自由基、減少缺氧缺血所致炎癥反應(yīng)的作用，兩者在藥效方面可優(yōu)勢互補[16]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，葛根素配伍丹酚酸B注射使用可降低MIRI大鼠血清中心肌損傷標記物CK、LDH及MDA水平，升高血清中SOD水平，顯著改善MIRI大鼠心臟內(nèi)皮功能。當葛根素與丹酚酸B質(zhì)量比為1∶1時，兩者產(chǎn)生的藥效最強，對心肌損傷的保護作用最為顯著。與模型組比較，各給藥組大鼠心肌梗死面積百分比均降低；葛根素組大鼠心肌梗死面積大于葛根素-與丹酚酸B（1∶1）組和（1∶2）組；在3個配伍組中，以葛根素-丹酚酸B（1∶1）組大鼠心肌梗死面積最小，葛根素-丹酚酸B（1∶0.5）組大鼠心肌梗死面積最大。這提示葛根素與丹酚酸B以質(zhì)量比為1∶1配伍時對心室重構(gòu)的抑制作用和受損心肌的保護作用效果最優(yōu)。

綜上所述，葛根素配伍丹酚酸B注射使用可有效抑制MIRI后心肌細胞損傷、降低心肌梗死面積百分比，且以葛根素與丹酚酸B質(zhì)量比為1∶1時效果最優(yōu)。

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（編輯：林 靜）

Protective Effect of the Injection of Puerarin Combined with Salvianolic Acid B on Rats with Myocardial Ischemia Reperfusion Injury

YANG Hua1，DONG Bing2，SONG Yingying1
（1.Dept.of Pharmacy，Jiangsu Province Donghai County People’s Hospital，Jiangsu Lianyungang 222300，China；2.Jiangsu Province Donghai County Market Supervision and Administration Bureau，Jiangsu Lianyungang 222300，China）

R542.2

A

1001-0408（2017）25-3525-03

2017-01-04

2017-06-01）

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.25.19

＊副主任醫(yī)師。研究方向：臨床藥學(xué)。電話：0518-80305071。E-mail：dhyyyy@sina.com