不同產(chǎn)地和葉形附子水煎液的抗炎、鎮(zhèn)痛作用比較

繆璐琳，熊秋韻，高繼海，李夢婷，敖慧，謝曉芳，彭成

（成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，成都611137）

不同產(chǎn)地和葉形附子水煎液的抗炎、鎮(zhèn)痛作用比較

繆璐琳＊，熊秋韻，高繼海，李夢婷，敖慧，謝曉芳，彭成#

（成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，成都611137）

目的：比較不同產(chǎn)地（江油、布拖）和葉形（大花葉、小花葉）附子水煎液的抗炎、鎮(zhèn)痛作用。方法：將動物隨機分為空白組（蒸餾水），陽性組，江油大、小花葉附子水煎液組和布拖大、小花葉附子水煎液組（給藥劑量按生藥計均為5 g/kg）。分別通過二甲苯致小鼠耳廓腫脹實驗（n＝12）和雞蛋清致大鼠足跖腫脹實驗（n＝10）（陽性藥物均為醋酸地塞米松片，0.005 g/kg）考察不同產(chǎn)地和葉形附子水煎液的抗炎作用；分別通過冰醋酸致小鼠扭體反應(yīng)實驗（n＝12）和小鼠熱板致痛實驗（n＝12）（陽性藥物均為鹽酸嗎啡片，0.002 5 g/kg）考察不同產(chǎn)地和葉形附子水煎液的鎮(zhèn)痛作用。結(jié)果：布拖大、小花葉附子和江油小花葉附子水煎液均可顯著降低小鼠的耳廓腫脹度（P＜0.01）；江油大花葉附子水煎液和布拖大花附子水煎液可顯著降低給藥6 h后大鼠的足跖腫脹度（P＜0.05）；布拖小花葉附子水煎液可顯著減少醋酸致痛小鼠的扭體次數(shù)、延長熱板致痛小鼠的痛閾值（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論：布拖大花葉、小花葉附子和江油小花葉附子的抗炎作用較好，布拖小花葉附子的鎮(zhèn)痛作用更佳。

產(chǎn)地；附子；葉形；抗炎；鎮(zhèn)痛

ABSTRACTOBJECTIVE：To compare the anti-inflammation，analgesia effects of decoctions extracted from Aconiti lateralis with different leaf shapes（dahua leaf，xiaohua leaf）from different producing areas（Jiangyou，Butuo）.METHODS：Animals were randomly divided into blank group（distilled water），positive group，groups of Aconiti lateralis with dahua，xiaohua leaf from Jiangyou，groups of Aconiti lateralis with dahua，xiaohua leaf from Butuo（with dose of 5 g/kg，calculated by crude drug）.The anti-inflammation effect of decoctions extracted from Aconiti lateralis with different variety sources and leaf shapes was investigated by xylene-induced ear swelling test（n＝12）in mice and egg white-induced toe swelling test（n＝10）in rats（positive drug wasDexamethasone acetate tablet，0.005 g/kg）.And its analgesic effect was investigated by acetic acid-induced writhing body reaction test（n＝12）and hot-plate-induced pain test（n＝12）in mice（positive drug was Morphine hydrochloride tablet，0.002 5 g/kg）.RESULTS：The decoctions extracted from Aconiti lateralis with dahua，xiaohua leaf from Butuo and xiaohua leaf from Jiangyou can significantly reduce the ear swelling degree（P＜0.01）.The decoctions extracted from Aconiti lateralis with dahua leaf from Jiangyou and Butuo can significantly decrease the toe swelling degree after 6 h of medication（P＜0.05）.And decoctions extracted from Aconiti lateralis with xiaohua leaf from Butuo can significantly reduce the number of writhing body in mice with acetic acid-induced pain and prolong the pain threshold of mice with hot-plate-induced pain（P＜0.05 or P＜0.01）.CONCLUSIONS：Aconiti lateralis with dahua and xiaohua leaf from Butuo and with xiaohua leaf from Jiangyou show better anti-inflammation effect，and Aconiti lateralis with xiaohua leaf from Butuo shows better analgesic effect.

KEYWORDSProducing areas；Aconiti lateralis；Leaf shapes；Anti-inflammation；Analgesia

附子是毛茛科烏頭（Aconitum carmichaelii Debx.）的子根加工品，味辛、甘，性大熱，具有回陽救逆、溫陽通脈、散寒止痛之效，為古今常用中藥[1]。附子道地產(chǎn)區(qū)在四川江油，現(xiàn)亦主產(chǎn)于四川布拖、平武、安縣等地。在長期人工種植栽培中，附子出現(xiàn)了多種種內(nèi)變異。原四川中醫(yī)藥研究院南川藥物種植研究所曾對現(xiàn)有附子栽培品種來源進行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)江油附子的種源川烏品種類型眾多，出現(xiàn)了南瓜葉、鵝掌葉、大花葉、小花葉等種內(nèi)變異類型[2]；中壩附子特產(chǎn)于四川江油、彰明兩縣，近年來主要以大花葉種、花葉子種（小花葉種）為栽培品種[3]，但藥材采收時未按葉形分開。相關(guān)研究表明，在3個附子品系的31個生物學(xué)性狀中，僅第2葉面積等7個性狀未表現(xiàn)出差異，其余性狀均有顯著差異[4]。不同種類藥材中可能存在同種有效成分，特別是近源品種，但這不意味著其有效成分含量、生物學(xué)性狀相同。如不同葉形杜仲中京尼平苷酸等活性成分質(zhì)量分數(shù)間存在顯著差異[5]；紫花型桔?？偘被岷扛哂诜刍ㄐ蚚6]；云南煙葉原料的外觀形狀與內(nèi)在品質(zhì)具有密切的關(guān)系，通過外觀性狀可以基本判斷煙葉的內(nèi)在品質(zhì)[7]。因此，對不同葉形附子進行區(qū)別研究具有重要意義。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，大花葉和艾葉兩種葉形的烏頭DNA甲基化修飾有較大差異。根據(jù)表觀遺傳學(xué)，同種植物核苷酸序列相同時，非DNA序列的改變，如染色體結(jié)構(gòu)和DNA甲基化狀態(tài)的改變會使個體性狀的表現(xiàn)產(chǎn)生差異。DNA甲基化修飾雖不改變基因序列，但對植物生命過程如基因表達、生長發(fā)育、抗逆境脅迫等具有重要的調(diào)節(jié)作用[8-9]。植物的葉形與藥用部位選擇及化學(xué)成分分布之間存在一定相關(guān)性，葉形也可粗略反映出某些化學(xué)成分的分布規(guī)律。

鑒于此，本研究選取道地產(chǎn)區(qū)江油和主產(chǎn)區(qū)布拖目前主要栽培的兩個品種（大花葉、小花葉）附子作為研究對象，比較不同產(chǎn)地和葉形附子的抗炎、鎮(zhèn)痛作用，以期為不同品系附子的臨床合理應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

AL104型十萬分之一電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）]；PV-200型足趾容積測試儀、RB-200型智能熱板儀（成都泰盟軟件有限公司）。

1.2 藥材、藥品與試劑

江油大花葉附子、布拖大花葉附子、江油小花葉附子、布拖小花葉附子均由課題組到當(dāng)?shù)夭墒?，?jīng)洗凈、切片、烘干（45℃）后制得，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室盧先明教授鑒定均為真品；醋酸地塞米松片（浙江仙琚制藥股份有限公司，批號：140327，規(guī)格：0.75 mg/片）；鹽酸嗎啡片（青海制藥廠有限公司，批號：20130513，規(guī)格：5 mg/片）；二甲苯、冰醋酸（成都市科龍化工試劑廠，批號：2010111110、2014020801）。

1.3 動物

SPF級KM小鼠216只，♀♂各半，體質(zhì)量20～25 g；清潔級SD大鼠60只，♂，體質(zhì)量180～200 g。實驗動物均由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院實驗動物中心提供[動物質(zhì)量合格證號：SCXK（川）2013-19]。

2 方法

2.1 附子水煎液的制備

稱取江油大花葉附子、布拖大花葉附子、江油小花葉附子、布拖小花葉附子各700 g，分別加入10倍量水，浸泡30 min后，煎煮5 h，收集水煎液；藥渣再加入8倍量水，煎煮3 h，收集水煎液?；旌?次水煎液，濃縮至最大質(zhì)量濃度（江油大花葉為25.828 g/kg、布拖大花葉為16.118 g/kg、江油小花葉為13.488 g/kg、布拖小花葉為14.368 g/kg）。

2.2 抗炎作用考察

2.2.1 二甲苯致小鼠耳廓腫脹實驗 將72只KM小鼠（♂）隨機分為空白組、陽性組、江油大花葉附子水煎液組、布拖大花葉附子水煎液組、江油小花葉附子水煎液組和布拖小花葉附子水煎液組，每組12只?？瞻捉M小鼠ig蒸餾水10 mL/kg，陽性組小鼠ig醋酸地塞米松片0.005 g/kg（蒸餾水溶解）[10]，各附子水煎液組小鼠均ig生藥量為5 g/kg的相應(yīng)水煎液（相當(dāng)于臨床最大用量的20倍）[11]，每天給藥1次，連續(xù)7 d。末次給藥1 h后，于每只小鼠右耳廓均勻涂抹二甲苯0.04 mL。0.5 h后脫頸椎處死小鼠，小心取下雙耳，在雙耳同一部位打孔并迅速稱定耳片質(zhì)量，計算耳廓腫脹度[耳腫廓脹度（%）＝（右耳片質(zhì)量－左耳片質(zhì)量）/左耳片質(zhì)量×100%]。

2.2.2 雞蛋清致大鼠足跖腫脹實驗 將60只SD大鼠（♂）按“2.2.1”項下分為6組，每組10只，并按“2.2.1”項下方法連續(xù)給藥6 d。末次給藥1 h后，每只大鼠右后足跖sc新鮮蛋清0.05 mL致炎，測定致炎后0.5、1、2、3、4、6 h小鼠足容積（mL），以給藥前后右后足容積之差計算足跖腫脹度，并計算腫脹抑制率[腫脹抑制率（%）＝（空白組平均足跖腫脹度－給藥組平均足跖腫脹度）/空白組平均足跖腫脹度×100%]。

2.3 鎮(zhèn)痛作用考察

2.3.1 冰醋酸致小鼠扭體反應(yīng)實驗 將72只KM小鼠（♀♂各半）按“2.2.1”項下方法分為6組，每組12只?？瞻捉M小鼠ig蒸餾水10 mL/kg，陽性組小鼠ig鹽酸嗎啡片2.5 mg/kg（蒸餾水溶解），不同葉形附子水煎液組小鼠均ig生藥量為5 g/kg的水煎液，每天1次，連續(xù)7 d。末次給藥后1 h，每只小鼠ip 0.6%冰醋酸10 mL/kg致痛，即刻計時，記錄小鼠首次出現(xiàn)扭體反應(yīng)的時間（即為扭體潛伏期），同時記錄每只小鼠造模后15 min內(nèi)出現(xiàn)的扭體次數(shù)。

2.3.2 小鼠熱板致痛實驗 取KM小鼠（♀），用熱板儀[溫度為（55±0.5）℃）]篩選基礎(chǔ)痛閾值（小鼠開始出現(xiàn)舔后足反應(yīng)的時間）在5～30 s的小鼠72只，然后按基礎(chǔ)痛閾值的高低將小鼠隨機分為6組，分組及給藥同“2.3.1”項下，連續(xù)給藥6 d。分別在末次給藥后0.5、1、1.5、2 h采用熱板儀測定各組小鼠的痛閾值。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料以x±s表示，組間比較采用單因素分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 抗炎作用考察結(jié)果

3.1.1 二甲苯致小鼠耳廓腫脹實驗結(jié)果 與空白組比較，陽性組，布拖大、小花葉附子水煎液組和江油小花葉附子水煎液組小鼠的耳廓腫脹度均顯著降低（P＜0.01），且以布拖小花葉附子水煎液組小鼠耳廓腫脹度降低程度最大，結(jié)果見表1。

表1 各組小鼠耳廓腫脹度的測定結(jié)果（x±s，n＝12）Tab 1 Determination results of ear swelling degree of mice in each group（x±s，n＝12）

3.1.2 雞蛋清致大鼠足跖腫脹實驗結(jié)果 與空白組比較，陽性組大鼠在給藥后0.5～6 h足跖腫脹度均顯著降低（P＜0.01）；各附子水煎液組大鼠在給藥后0.5 h足跖腫脹度均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）；布拖大、小花葉附子水煎液組和江油小花葉附子水煎液組大鼠在給藥后3 h足跖腫脹度均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）；布拖大花葉附子小煎液組和江油小花葉附子水煎液組大鼠在給藥后4 h足跖腫脹度均顯著降低（P＜0.05）；江油大花葉附子水煎液組和布拖大花葉附子水煎液組大鼠在給藥后6 h足跖腫脹度均顯著降低（P＜0.05）?？傮w而言，各附子水煎液抑制雞蛋清致大鼠足跖腫脹的作用效果差別不大，結(jié)果見表2。

表2 給藥不同時間后各組大鼠足跖腫脹度的測定結(jié)果（x±s，n＝10）Tab 2Determination results of toe swelling degree in rats in each group after different administration time（x±s，n＝10）

3.2 鎮(zhèn)痛作用考察結(jié)果

3.2.1 冰醋酸致小鼠扭體反應(yīng)實驗結(jié)果 與空白組比較，各給藥組小鼠的扭體次數(shù)均不同程度地減少，其中布拖小花葉附子水煎液組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示布拖小花葉附子水煎液的鎮(zhèn)痛效果較好，結(jié)果見表3。

3.2.2 小鼠熱板致痛實驗測定結(jié)果 與空白組比較，除陽性組大鼠在給藥后1.5 h的痛閾值略有縮短外，其余各

表3 各組小鼠扭體反應(yīng)的測定結(jié)果（x±s，n＝12）Tab 3 Determination results of numbers of writhing body in mice in each group（x±s，n＝12）

給藥組小鼠在給藥后0.5～2.0 h的痛閾值均不同程度地延長，其中以布拖小花葉附子水煎液組小鼠痛閾值延長較為顯著，且在給藥后1 h差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），結(jié)果見表4。表4 給藥不同時間后各組小鼠痛閾值的測定結(jié)果（x±s，n＝12）Tab 4 Determination results of pain threshold in mice in each group after different administration time（x±s，n＝12）

4 討論

本研究采用抗炎、鎮(zhèn)痛實驗的經(jīng)典造模方法比較了不同產(chǎn)地和葉形附子水煎液的抗炎、鎮(zhèn)痛作用。在抗炎實驗中，二甲苯致小鼠耳廓腫脹及雞蛋清致大鼠足跖腫脹分別是以水腫和滲出為主的急性炎癥反應(yīng)[12]，雌性激素對此有一定抗炎作用，故本研究選用雄性動物（♂）進行研究。醋酸地塞米松是一類腎上腺皮質(zhì)激素，可減輕和防止組織對炎癥的反應(yīng)，從而減輕炎癥的表現(xiàn)。本研究結(jié)果顯示，醋酸地塞米松，布拖大、小花葉附子水煎液和江油小花葉附子水煎液均可明顯減輕二甲苯致小鼠的耳廓腫脹；各附子水煎液對雞蛋清致大鼠早期（0.5 h）足跖腫脹均有一定抑制作用，但隨時間延長此效果減弱。這提示布拖大花葉、江油小花葉、布拖小花葉附子對急性炎癥有一定抑制作用。在鎮(zhèn)痛實驗中，鎮(zhèn)痛陽性藥嗎啡效果不明顯，其具體原因有待分析。布拖小花葉附子的鎮(zhèn)痛效果較佳，對于減少扭體疼痛次數(shù)及延長熱板痛閾值均有較為顯著的作用。

綜上所述，布拖大、小花葉附子水煎液和江油小花葉附子水煎液的抗炎作用好，布拖小花葉附子水煎液對物理性疼痛（熱板致痛）和炎性疼痛（冰醋酸致痛）均具有明顯的鎮(zhèn)痛作用。中藥療效的物質(zhì)基礎(chǔ)主要為植物次生代謝產(chǎn)物，其含量的高低不僅與外界生長環(huán)境、栽培、采收等有關(guān)，還與有機體的遺傳特性有關(guān)，即品種來源對藥材的品質(zhì)有重要的影響。本研究結(jié)果也顯示，不同產(chǎn)地、不同葉形的附子抗炎鎮(zhèn)痛藥效有明顯的差異，這為不同產(chǎn)地和不同葉形附子的臨床應(yīng)用提供了一定依據(jù)。

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Comparison of the Anti-inflammation，Analgesic Effects of Decoctions Extracted from Aconiti Lateralis with Different Leaf Shapes from Different Producing Areas

MIAO Lulin，XIONG Qiuyun，GAO Jihai，LI Mengting，AO Hui，XIE Xiaofang，PENG Cheng
（College of Pharmacy，Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 611137，China）

R285；R282.5

A

1001-0408（2017）25-3483-04

2016-11-17

2017-05-12）

（編輯：林 靜）

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.25.08

國家基礎(chǔ)科學(xué)人才培養(yǎng)基金資助項目（No.J1310034）；國家自然科學(xué)基金資助項目（No.81630101）；國家中藥標(biāo)準(zhǔn)化項目（No.ZYBZH-C-SC-51）；四川省中醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)研究專項項目（No.2016ZY008）；四川省科技廳項目（No.2013SZ0114）；四川省青年科技創(chuàng)新研究團隊專項計劃項目（No.2015TD0028）；四川省科技計劃項目（No.2014SZ0156）

＊本科生。研究方向：中藥藥理學(xué)。E-mail：787294002@qq.com

#通信作者：教授，博士生導(dǎo)師。研究方向：中藥藥理與毒理。電話：028-61800018。E-mail：pengchengchengdu@126.com