野百合堿誘導(dǎo)肺動脈高壓大鼠右心室脂肪酸代謝紊亂的機制

韓婷，權(quán)磊，胡婷婷，劉青，張寶，譚文

(1華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣州510006；2廣東工業(yè)大學(xué)生物醫(yī)藥研究院)

野百合堿誘導(dǎo)肺動脈高壓大鼠右心室脂肪酸代謝紊亂的機制

韓婷1，權(quán)磊1，胡婷婷1，劉青1，張寶1，譚文2

(1華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣州510006；2廣東工業(yè)大學(xué)生物醫(yī)藥研究院)

目的觀察野百合堿誘導(dǎo)的肺動脈高壓大鼠右心室CD36、過氧化物酶體增殖劑激活受體α(PPAR α)、過氧化物酶體增殖劑激活受體γ(PPAR γ)的表達情況，探討肺動脈高壓大鼠右心室脂肪酸代謝紊亂的機制。方法24只大鼠隨機分成對照組10只和觀察組14只。觀察組通過一次性腹腔注射60 mg/kg野百合堿來建立肺動脈高壓模型，對照組腹腔注射相同劑量的生理鹽水。4周時通過右心導(dǎo)管法測定大鼠的平均右心室壓(mRVP)以及右心室收縮壓(RVSP)；稱量右心室(RV)、左心室+室間隔(LV+S)的質(zhì)量，計算右心肥厚指數(shù)[RV/(LV+S)]；采用實時熒光定量PCR方法檢測右心室CD36、PPAR α、PPAR γ的mRNA表達的變化。結(jié)果4周時，觀察組mRVP和RVSP高于對照組(P均<0.05)，肺動脈高壓模型建立成功。 對照組右心室心肌肥厚指數(shù)、心肌細胞橫截面積分別為0.20±0.02、 (290.32±28.16) μm2，觀察組分別為0.40±0.07、(187.92±21.15)μm2，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。對照組右心室CD36、PPAR α、PPAR γ mRNA相對表達量分別為1.00±0.00、1.00±0.00、1.00±0.00，觀察組分別為1.26±0.08、0.71±0.06、0.48±0.09，觀察組右心室CD36表達量高于對照組，PPAR α、PPAR γ的表達量低于對照組(P均<0.05)。結(jié)論野百合堿誘導(dǎo)的肺動脈高壓大鼠右心室CD36的表達增加和PPAR α、PPAR γ表達減少，導(dǎo)致右心室脂肪酸利用水平降低，形成脂毒性，引起右心室功能紊亂。

肺動脈高壓；右心室脂肪酸代謝紊亂；野百合堿；CD36；過氧化物酶體增殖劑激活受體α；過氧化物酶體增殖劑激活受體γ

肺動脈高壓(PAH)是一種復(fù)雜的、多因子疾病，肺動脈高壓誘發(fā)的肺血管阻力升高會增加右心室負荷，導(dǎo)致患者心衰和死亡。研究發(fā)現(xiàn)，肺動脈高壓患者右心室能量代謝的主要特點是糖利用增加和脂肪酸利用減少[1，2]。 脂肪酸轉(zhuǎn)運分子CD36以及糖代謝、脂肪氧化調(diào)節(jié)因子過氧化物酶體增殖劑激活受體α(PPAR α)、過氧化物酶體增殖劑激活受體γ(PPAR γ)[3]的表達異常，可導(dǎo)致脂肪酸代謝不良，脂肪酸以甘油三酯、甘油二酯和神經(jīng)酰胺的形式儲存在胞質(zhì)中，形成脂毒性[3～5]。2016年5～ 10月，我們觀察了野百合堿導(dǎo)致的肺動脈高壓大鼠右心室組織CD36、PPAR α、PPAR γ的mRNA的表達變化。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 24只SPF級雄性SD大鼠[南方醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，動物許可證號：SCXK(粵)2011-0015]，體質(zhì)量250～280 g。野百合堿(Sigma，批號:WXBC1381V)，RNAisolater Total RNA extraction Reagent, HiScript Ⅱ Q RT Super Mix for qPCR(+gDNA wiper), SYBR Green Master Mix (南京諾唯贊生物科技有限公司)。Powerlab數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)(AD Instruments Inc)，熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystem7500 Real Time PCR System)

1.2 大鼠分組及肺動脈高壓模型的制備 24只大鼠隨機分成對照組10只和觀察組14只。觀察組大鼠一次性腹腔注射60 mg/kg的野百合堿，制作肺動脈高壓模型，對照組注射同等體積的生理鹽水。

1.3 肺動脈高壓大鼠右心室壓力測定 野百合堿注射4周，腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉對大鼠進行麻醉，然后仰臥固定在實驗臺上，剪掉大鼠頸部的毛，并用碘酊消毒。分離右頸外靜脈，進行頸外靜脈插管，用右心導(dǎo)管法測定大鼠的平均右心室壓(mRVP)和右心室收縮壓(RVSP)。導(dǎo)管中充滿0.1%的肝素，并通過三通閥與壓力傳感器相連，同時用Powerlab對波形進行記錄。進行右心室插管的時候，要時刻密切關(guān)注波形的變化。導(dǎo)管依次進入上腔靜脈、右心房，最后到達右心室。待右心室波形穩(wěn)定后，進行波形記錄，每只大鼠記錄30 min。

1.4 心肌肥厚指數(shù)、心肌細胞橫截面積檢測 血流動力學(xué)的測定完成后，處死大鼠，并取出右心室，用提前配制好的磷酸鹽緩沖液進行沖洗，然后將清洗過的組織標本用濾紙擦干，并小心分離右心室，分別稱量右心室(RV)、左心室+室間隔(LV+S)的質(zhì)量，以RV/(LV+S)作為右心肥厚指數(shù)。將右心室平分兩份，一份用4%的多聚甲醛固定，并進行石蠟包埋切片，切片厚度為4 μm，用于HE染色。HE染色切片在200倍顯微鏡下選擇3個區(qū)域拍照，每個區(qū)域20個細胞，使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件計算右心室心肌細胞橫截面積。一份立刻投入液氮中保存，并轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱中長期保存，以備后期的mRNA的檢測。

1.5 心室組織CD36、PPAR α、PPAR γ檢測 采用實時熒光定量PCR法。從-80 ℃冰箱中取50 mg右心室組織，加入1 mL Trizol在冰上磨碎，嚴格按照說明書提取RNA，進行反轉(zhuǎn)錄和擴增。β-actin作為內(nèi)參，2-ΔΔCt表示各個基因的相對表達量。所用引物由上海捷瑞合成，其序列為：CD36 上游引物5′- GGTGTGCTGGACATTGG-3′ ,下游引物5′- CTATGCTCATCTTCGTTAGG-3′;PPAR α 上游引物 5′-TGTATGAAGCCATCTTCACG-3′,下游引物5′-GGCATTGAACTTCATAGCGA-3′;PPAR γ 上游引物 5′-TCAAACCCTTTACCACGGTT-3′，下游引物 5′-CAGGCTCTACTTTGATCGCA-3′; β-actin 上游引物：5′-CTACAGCTTCACCACCACAGC-3′,下游引物 5′-CATTGCCGATAGTGATGACCT-3′。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：50℃ 15 min，85℃ 2 min；實時熒光定量PCR的條件：95℃ 30 s，95℃ 10 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)。

2 結(jié)果

2.1 兩組右心室壓力及結(jié)構(gòu)變化 見表1。

表1 兩組右心室壓力及結(jié)構(gòu)變化比較

注：與對照組比較,*P<0.05。

2.2 兩組右心室CD36、PPAR α、PPAR γ mRNA相對表達量 見表2。

表2 兩組右心室CD36、PPAR α、PPAR γ mRNA相對表達量的比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

3 討論

右心室心衰是肺動脈高壓死亡的主要原因[6]，且右心室代謝紊亂被證實在肺動脈高壓導(dǎo)致的心衰中起重要作用。本研究通過一次性腹腔注射60 mg/kg野百合堿建立肺動脈高壓模型，顯示與對照組相比，觀察組右心室心肌肥厚指數(shù)、心肌細胞橫截面積均增大，肺動脈高壓大鼠存在右心室結(jié)構(gòu)和功能紊亂情況。

有研究報道[7]，右心室功能紊亂與異常能量代謝的基因表達改變有關(guān)。過氧化物酶體增殖劑激活受體(PPARs)是一個核受體的亞家族，在調(diào)節(jié)能量平衡、糖脂代謝中起重要作用。PPARs主要有3種表型(α、β/δ和γ)，三種異型體都可以被脂肪酸和其代謝產(chǎn)物活化。PPAR α主要存在于肝臟、肌肉以及腎臟中，其主要功能為調(diào)節(jié)脂肪酸氧化以及糖的穩(wěn)態(tài)平衡。有研究表明在低氧導(dǎo)致肺動脈高壓的動物模型中PPAR β/δ 激動劑 GW0742可以減輕右心室肥厚、降低收縮壓[8]。研究表明，大部分的肺動脈高壓患者的肺組織中PPAR γ的表達量顯著減少[9]。PPAR γ可以抑制內(nèi)皮細胞中趨化因子的產(chǎn)生以及NF-κB的激活[10]，還可以抑制細胞間粘附因子以及血管細胞粘附因子的產(chǎn)生。除此之外，PPAR γ可以增加內(nèi)皮細胞中一氧化氮的產(chǎn)生，抑制平滑肌細胞的增殖和遷移[11]。本研究表明，與對照組相比肺動脈高壓大鼠右心室PPAR α、PPAR γ的表達均顯著減少，表明右心室脂肪酸的氧化能力減弱。

CD36是健康人心臟的主要脂肪酸轉(zhuǎn)運分子，負責(zé)大約70%心肌細胞的脂肪酸攝取[12]。在各種由脂毒性導(dǎo)致的心臟收縮功能紊亂的心臟代謝疾病中，CD36均發(fā)揮重要作用。CD36作為脂毒性中的一個關(guān)鍵分子，是抑制或治療胰島素抵抗相關(guān)心臟收縮功能紊亂的主要靶點。在一個存在PPAR α表達但缺少CD36表達的心臟脂毒性小鼠模型中，盡管脂肪酸的利用情況基本不變，但心肌細胞中甘油三酯代謝紊亂和心臟功能紊亂均減輕，糖的攝取和氧化增加，這表明CD36表達增加對脂毒性心肌病的發(fā)展有重要作用。并且，目前采用新型藥物有針對性地抑制CD36介導(dǎo)的脂肪酸攝取，可以阻止或治療心臟功能紊亂。敲除CD36基因可以抑制代謝壓力對心臟的不良影響。Talati等[13]的最新研究表明，在BMPR2突變的小鼠的肺動脈高壓模型中，其右心室CD36的表達是增加的；同樣一個左心衰的模型中，右心室的肥厚也伴隨著CD36的表達而增加。然而，CD36在右心室脂毒性的作用仍然不清楚。在肺動脈高壓中，右心室脂毒性可能是導(dǎo)致右心室功能紊亂的重要原因。本研究表明肺動脈高壓伴隨的右心室功能紊亂過程中CD36的表達量顯著升高，從而使CD36轉(zhuǎn)運的脂肪酸含量升高，但是PPAR α、PPAR γ表達減少，導(dǎo)致右心室脂肪酸利用水平降低，形成脂毒性，引起右心室功能紊亂，促進了動脈高壓病情進展。

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譚文(E-mail：went@gdut.edu.cn)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.33.009

R543.2

A

1002-266X(2017)33-0029-03

2016-12-01)