泰萬菌素對大鼠胃菌群的影響

周應(yīng)培，馮莉莉

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南長沙410128；2.長沙道勤生物科技有限公司，湖南長沙410129）

試驗研究

泰萬菌素對大鼠胃菌群的影響

周應(yīng)培1,2，馮莉莉1,2

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南長沙410128；2.長沙道勤生物科技有限公司，湖南長沙410129）

為了解泰萬菌素對大鼠胃內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)的影響,試驗采用PCR-DGGE技術(shù)分離方法分析大、小劑量泰萬菌素作用下大鼠胃內(nèi)細菌的變化情況及其停藥后恢復(fù)狀態(tài)。結(jié)果顯示：泰萬菌素作用時，大鼠胃內(nèi)細菌數(shù)量減少，菌群多樣性降低，且在大劑量組效果顯著；停藥后僅有兩種細菌恢復(fù)，大、小劑量組各有2種、4種細菌消失。泰萬菌素在某種程度上能抑制細菌的生長，但也可以間接促進某些細菌生長，總體而言泰萬菌素對大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響不大。

泰萬菌素；DGGE；胃；菌群結(jié)構(gòu)

胃在動物消化、吸收營養(yǎng)等方面具有重要意義，同時，胃內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)在維持胃正常功能方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。然而，近年來，由于抗生素的濫用，造成了消化道菌群結(jié)構(gòu)紊亂、細菌間的交互耐藥性等方面的問題。為此，英國伊科動物保健公司開發(fā)出比同類型大環(huán)內(nèi)酯類抗生素在抗菌譜、作用強度、毒副作用等方面更具優(yōu)勢的泰萬菌素,其作用機理是阻斷肽鏈延伸，導(dǎo)致細菌難以合成蛋白質(zhì)，從而發(fā)揮殺滅有害菌的治療效果。但抗生素在殺滅有害菌的同時也可能抑殺有益菌，故探究泰萬菌素是否對消化道內(nèi)細菌產(chǎn)生嚴重傷害有一定意義，但目前國內(nèi)外對這方面的研究較少，本研究采用PCR-DGGE技術(shù)探討泰萬菌素對大鼠胃內(nèi)菌群的影響及用藥后細菌恢復(fù)力。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

Wester大鼠18只，體重180±8 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。

1.2 主要試劑及儀器

泰萬菌素，購自湖南某生物科技股份有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒、DNA片段快速純化/回收試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司；變性梯度凝膠電泳儀系統(tǒng)（DGGEK-2001），購自美國CBS公司。

1.3 方法

1.3.1 試驗動物處理與試驗方法

將大鼠連續(xù)預(yù)飼7 d后，隨機分成3組（分別為對照組、小劑量組、大劑量組），每組6只。

以純凈水溶解泰萬菌素，使其濃度為11.6 mg/50mL和23.2mg/50mL，分別供大、小劑量試驗組自由飲用，連續(xù)3d。對照組自由飲用純凈水。第4 d后，兩試驗組停藥，改飲純凈水。

分別于投藥后的第4 d、11 d取樣，取樣方法是：每組隨機取鼠3只，無菌條件下分別取胃內(nèi)容物約2 g置入無菌離心管內(nèi)，加入滅菌生理鹽水（300μL），然后300 r/min離心10min，移取上清液至另一干凈離心管，12 000 r/min，10min，棄上清，沉淀備用。

1.3.2 樣品細菌總DNA提取

取沉淀，加入緩沖液，蛋白酶k消化，按細菌基因組DNA提取試劑盒步驟提取細菌基因組DNA，操作見說明書。

1.3.3 細菌16S rDNA V3區(qū)擴增

以 細 菌 總 DNA 為 模 板 ，341F（5’-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和 907R（5’-CCCCGTCAATTCATTTGAGTTT-3’）為引物，進行第一輪擴增。以上述PCR產(chǎn)物為模板，以341F-GC(5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGC CGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’) 和 518R(5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’)為引物，進行第二輪擴增，產(chǎn)物即為細菌16S rDNA V3區(qū)。上述擴增體系為：細菌DNA模板2.0μL，上、游引物各1μL，TransTaqHiFiSuperMix 25 μL，補加 ddH2O 至50μL。擴增條件為：95℃ 5min；95℃ 30 s、66℃30 s、72.0 ℃ 12 s，32 個循環(huán)；72.0 ℃ 7min。

取第二輪PCR產(chǎn)物5μL，于1.5%瓊脂糖凝膠中電泳30min，觀察結(jié)果。

1.3.4DGGE電泳及產(chǎn)物處理

取第二輪PCR產(chǎn)物10μL，點樣于預(yù)先制備好的變性凝膠點樣孔，在60℃、300 V電壓下預(yù)電泳10min，再電泳7.0 h。取出凝膠，EB染色20min，觀察，拍照，分析。

紫外光下切取DGGE膠中明亮、清晰的條帶，沖洗3次至滅菌EP管中，以DNA片段快速純化回收試劑盒純化回收DNA片段。產(chǎn)物與pMETeasy載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，陽性克隆，送至深圳華大基因科技服務(wù)有限公司測序。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

將測序序列與GenBank上已登錄序列進行Blast比對，尋找相似度最高的同源性序列。用Quantity One v4.6.2構(gòu)建DGGE電泳譜圖進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌16S rDNA V3區(qū)擴增結(jié)果

上述樣品經(jīng)二輪擴增，產(chǎn)物大小約為200bp，與預(yù)計大小一致，見圖1。

圖1 大鼠胃內(nèi)細菌16S rDNA V3區(qū)擴增片段

2.2 細菌16S rRNA V3區(qū)DGGE電泳結(jié)果分析

用上述擴增的細菌16S rRNA V3區(qū)產(chǎn)物進行DGGE電泳，結(jié)果見圖2。

圖2 大鼠胃細菌菌群DGGE電泳圖

從圖2可見：大鼠飲用泰萬菌素后，細菌種類有所減少，如小劑量組A2、A6、A8等條帶消失，大劑量組A2、A3、A4等條帶消失；細菌數(shù)目下降，如小劑量組A5、A7條帶亮度降低，大劑量組A10條帶亮度減弱；有新的細菌出現(xiàn)，如小劑量組A9、A13條帶出現(xiàn)，大劑量組A9條帶出現(xiàn)。停藥后，相對于用藥期：細菌數(shù)目下降，如小劑量時的A1、A12、A13等條帶消失，大劑量時的A9、A12消失；而用藥時消失的細菌部分恢復(fù)，如停藥后A2、A10條帶重新出現(xiàn)。停藥后細菌種類沒有恢復(fù)到原來狀態(tài)，但有恢復(fù)趨勢。

2.3 優(yōu)勢條帶測序結(jié)果與分析

本實驗切取13條DGGE優(yōu)勢條帶，純化、回收，經(jīng)測序、比對后，選擇與之最相近菌種，結(jié)果見表1。

表1 DGGE回收條帶序列比對結(jié)果

從表1中可見：胃內(nèi)存在細菌有乳酸菌、糞芽孢桿菌、志賀氏桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌和巴氏梭菌等桿菌屬和梭菌屬，其相似度大97%以上。

結(jié)合圖2和表1，用藥后條帶發(fā)生了明顯的變化，一些細菌豐度降低，另一些細菌豐度升高，胃內(nèi)細菌多樣性降低,這一現(xiàn)象在高濃度作用時更顯著。停藥后細菌短時間內(nèi)未恢復(fù)到原來狀態(tài)，但有恢復(fù)傾向。這與陳鳳[1]（2015）研究：口服抗生素后腸道菌群發(fā)生改變，停藥3周后腸道菌群恢復(fù)到原來狀態(tài)結(jié)果相近。

3 討論

泰萬菌素導(dǎo)致胃內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)不同程度的改變，其潛在影響因素可能有如下幾種：

（1）泰萬菌素的抗菌作用，大環(huán)內(nèi)酯類抗生素對需氧革蘭陽性菌、部分革蘭陰性菌有很好的抑殺作用[2]。同時，一些抗生素可抑制消化道內(nèi)有害菌的生長，如諾氟沙星可干擾致病菌DNA復(fù)制來抑制致病菌生長。

（2）胃內(nèi)細菌形成相互競爭，相互制約的關(guān)系，當(dāng)一種細菌減少或消失時，另外一種細菌可能因為獲得其生態(tài)位或失去制約而瘋長。如：朱小翠認為，芽孢桿菌（Bacillus）能參與生物奪氧，降低腸道內(nèi)局部的氧分壓，維持腸道環(huán)境的穩(wěn)定，抑制某些細菌的生長[3]。

（3）胃內(nèi)微生態(tài)改變，在泰萬菌素的作用下胃內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)改變，引起其微生態(tài)發(fā)生變化。新的條件更適于一些細菌的生長，而不利于另外一些菌的生長。

（4）泰萬菌素在胃內(nèi)的吸收效果，胃由于胃酸的作用，同時大環(huán)內(nèi)酯類抗生素為弱堿性[4]，泰萬菌素在胃內(nèi)可能由于被中和而導(dǎo)致藥物濃度無法抑制某些細菌生長。

（5）腸道菌群的代謝功能，陳懷俠[5]（2007）等采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對阿托品在大鼠腸道菌群中的代謝產(chǎn)物進行了研究，發(fā)現(xiàn)了9種阿托品腸道菌群代謝產(chǎn)物，如脫水阿托品、脫品和脫品酸。藥物進入消化道后，可通過消化道內(nèi)細菌的代謝活化使之具備強大的藥理活性[6]，從而發(fā)揮更好療效，對某些細菌抑制作用加強。

無論是胃內(nèi)細菌增多或減少，結(jié)果表明泰萬菌素作用下，對胃腸道產(chǎn)生了一定影響，但未造成不可逆損傷，且停藥后胃內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)有恢復(fù)到原來狀態(tài)的趨勢。這預(yù)示著在養(yǎng)殖生產(chǎn)上合理使用泰萬菌素是安全的，但若過量使用可能會導(dǎo)致腸道菌群失衡，產(chǎn)生耐藥性細菌，故用藥時應(yīng)謹慎。

本實驗采用的DGGE技術(shù)克服了微生物難培養(yǎng)或不可培養(yǎng)兩方面的局限，不僅具有可大量檢測、能與其他方法結(jié)合使用等優(yōu)點，其在揭示自然界微生物多樣性方面具有獨特的優(yōu)越性。

[1]陳鳳.口服抗生素改變大鼠腸道菌群和大腦海馬腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達及其恢復(fù)[D].遼寧：大連醫(yī)科大學(xué),2015：13.

[2]李喆宇,崔玉彬,張靜霞,等.大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的研究新進展[J].國外醫(yī)藥（抗生素分冊）,2013,34(1)：6-15.

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S859.796

A

1006-4907（2017）04-0033-03

10.3969/j.issn.1006-4907.2017.04.017

2017-07-17

周應(yīng)培（1981～），男，漢族，湖南寧鄉(xiāng)人，助理獸醫(yī)師，主要從事動物疫病的防控和研究，E-mail：779977588@.com。