草莓膠孢炭疽菌CFEM候選效應(yīng)子的生物信息學(xué)鑒定及其侵染過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄分析

張麗勍, 段 可, 鄒小花, 何成勇, 高清華

(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院林木果樹(shù)研究所, 上海 201403)

草莓膠孢炭疽菌CFEM候選效應(yīng)子的生物信息學(xué)鑒定及其侵染過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄分析

張麗勍, 段 可, 鄒小花, 何成勇, 高清華*

(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院林木果樹(shù)研究所, 上海 201403)

病原真菌通常分泌效應(yīng)子到寄主組織中調(diào)控寄主的生理過(guò)程,從而有利于其侵染。CFEM(common in several fungal extracellular membrane)蛋白是真菌所獨(dú)有的,且與致病性密切相關(guān)。本研究利用Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)草莓膠孢炭疽菌全基因組進(jìn)行搜索,鑒定獲得22個(gè)CFEM蛋白。對(duì)CFEM蛋白的信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)域和亞細(xì)胞定位進(jìn)行分析,結(jié)果表明僅有8個(gè)CFEM蛋白為分泌蛋白。對(duì)CFEM分泌蛋白在不同侵染階段的轉(zhuǎn)錄情況進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)及RT-PCR分析,結(jié)果顯示8個(gè)CFEM蛋白在侵染后不同時(shí)期均有表達(dá)。其中,1個(gè)CFEM分泌蛋白于附著胞形成期特異表達(dá),2個(gè)于活體寄生階段特異表達(dá),2個(gè)于死體寄生階段特異表達(dá)。綜合上述分析結(jié)果,預(yù)測(cè)這8個(gè)分泌蛋白可能為草莓膠孢炭疽菌的效應(yīng)子。本研究為深入解析植物病原真菌CFEM效應(yīng)子提供了理論依據(jù)。

膠孢炭疽菌; 效應(yīng)子; CFEM蛋白

由炭疽菌屬Colletotrichum真菌引起的草莓炭疽病是草莓上的一種重要病害。草莓炭疽病危害嚴(yán)重年份草莓死苗率達(dá)80%,草莓減產(chǎn)達(dá)50%以上[1]。膠孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides是草莓炭疽病的主要病原之一,為半活體營(yíng)養(yǎng)型真菌。

在植物病原真菌與寄主植物共進(jìn)化的過(guò)程中,病原真菌的致病性與寄主的抗性之間一直發(fā)生著相互作用[2]。病原真菌通過(guò)分泌一系列的效應(yīng)子來(lái)調(diào)控寄主植物的抗性[3]。效應(yīng)子是一類(lèi)分泌蛋白,必須被分泌并轉(zhuǎn)運(yùn)到寄主細(xì)胞的特定部位才能發(fā)揮其功能。真菌的效應(yīng)子具有以下特點(diǎn): 序列特異性高,不同物種間序列相似性小;氨基酸序列短,一般不超過(guò)300 個(gè)氨基酸殘基;含有信號(hào)肽,同時(shí)不含跨膜區(qū); 富含半胱氨酸[4]。效應(yīng)子依據(jù)其功能不同可以分為兩類(lèi),一類(lèi)效應(yīng)子通過(guò)抑制植物的抗性來(lái)促進(jìn)病原真菌的侵染(稱(chēng)為效應(yīng)子誘發(fā)的感病性);另一類(lèi)效應(yīng)子則能夠間接或直接地被寄主植物識(shí)別,導(dǎo)致效應(yīng)子觸發(fā)的免疫。2006年,一篇關(guān)于卵菌(oomycete)全基因組的文獻(xiàn)中提出了一個(gè)概念,即真菌類(lèi)生物或真菌本身可能有成百上千種效應(yīng)子。自此開(kāi)始,大量的真菌全基因組數(shù)據(jù)被發(fā)掘,各種不同的生物信息學(xué)手段被用于精確的分析和定義效應(yīng)子[5]。

2013年,膠孢炭疽菌的全基因組測(cè)序工作完成。Gan等[6]對(duì)膠孢炭疽菌基因組的分泌蛋白進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,預(yù)測(cè)其含有2 042個(gè)分泌蛋白,其中755個(gè)為少于300個(gè)氨基酸的小分泌蛋白(small secretory proteins,SSP)。汪倩等[7]利用生物信息學(xué)手段發(fā)現(xiàn)膠孢炭疽菌基因組中存在稻瘟菌效應(yīng)子BASP2的同源蛋白CgBASP2。對(duì)該蛋白編碼基因進(jìn)行功能研究發(fā)現(xiàn),與野生型相比CgBASP2基因缺失突變株不能對(duì)寄主產(chǎn)生致病性,說(shuō)明其在致病過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。何芬[8]對(duì)利用生物信息學(xué)篩選到的膠孢炭疽菌LysMs (Lysin Motifs)型候選效應(yīng)子CgLysM,進(jìn)行了亞細(xì)胞定位,發(fā)現(xiàn)CgLysM在分生孢子萌發(fā)過(guò)程中有向芽管頂端(或附著胞)富集的傾向。這些報(bào)道表明,高通量測(cè)序和生物信息學(xué)手段結(jié)合功能學(xué)試驗(yàn)?zāi)軌蛴行ьA(yù)測(cè)并鑒定出真菌效應(yīng)子。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的革新、生物信息學(xué)的快速發(fā)展以及膠孢炭疽菌全基因組信息的公布,膠孢炭疽菌-草莓的互作研究工作將被極大地推動(dòng)。

CFEM(common in several fungal extracellular membrane)是真菌獨(dú)有的一種蛋白結(jié)構(gòu)域,含有8個(gè)半胱氨酸[9]。CFEM蛋白結(jié)構(gòu)域最初是在稻瘟病菌Magnaporthegrisea中發(fā)現(xiàn)的,含有該結(jié)構(gòu)域的ACI1蛋白在稻瘟病菌致病過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。此外,在白假絲酵母Candidaalbicans中發(fā)現(xiàn)的含CFEM結(jié)構(gòu)域的CSA1和稻瘟病菌中的Pth11蛋白均與致病性相關(guān)[10]。目前在膠孢炭疽菌中尚未見(jiàn)CFEM效應(yīng)子的相關(guān)報(bào)道。本研究利用NCBI網(wǎng)站(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)公布的膠孢炭疽菌基因組數(shù)據(jù)和注釋信息,從全基因組水平上鑒定膠孢炭疽菌中含有CFEM蛋白結(jié)構(gòu)域的成員,采用生物信息學(xué)手段進(jìn)行分析,并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)及RT-PCR分析結(jié)果,預(yù)測(cè)膠孢炭疽菌CFEM的候選效應(yīng)子,為進(jìn)一步研究CFEM效應(yīng)子的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

膠孢炭疽菌C.gloeosporioides的全基因組蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)來(lái)自NCBI網(wǎng)站。試驗(yàn)所用草莓為栽培草莓品種‘久香’,取自上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院林木果樹(shù)研究所草莓種質(zhì)資源圃。

1.2 方法

1.2.1 CFEM 蛋白的生物信息學(xué)分析

利用蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫(kù)Pfam (http:∥pfam.xfam.org/family/)對(duì)膠孢炭疽菌基因組編碼的CFEM蛋白進(jìn)行分析,E-value 設(shè)為0.001。

通過(guò)SignalP 4.1(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測(cè)各CFEM蛋白的N端信號(hào)肽;通過(guò)TMHMM Server v. 2.0(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測(cè)各CFEM蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域;通過(guò)TargetP 1.1 Server(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)預(yù)測(cè)各CFEM蛋白的亞細(xì)胞定位。

1.2.2 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

通過(guò)ClustalX 軟件對(duì)炭疽屬真菌蛋白CFEM氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對(duì),利用MEGA 6.0中的鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),bootstrap值設(shè)置為1 000。

1.2.3 CFEM蛋白在膠孢炭疽菌侵染草莓葉片不同階段中的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

取生長(zhǎng)健壯、長(zhǎng)勢(shì)一致的草莓植株于人工氣候培養(yǎng)箱培養(yǎng)。試驗(yàn)設(shè)置處理組和對(duì)照組,每組5株草莓植株,設(shè)3次重復(fù)。處理組采用孢子濃度為1×106個(gè)/mL的孢子懸浮液噴霧法接種草莓葉片,對(duì)照組采用純培養(yǎng)膠孢炭疽菌。將對(duì)照組及接種后三個(gè)階段:附著胞形成階段(inplantaappressoria)、活體營(yíng)養(yǎng)階段(biotrophic phase)及死體營(yíng)養(yǎng)階段(necrotrophic phase)的葉片分別取樣[9],提取RNA。RNA提取方法參見(jiàn)OMEGA Plant RNA Kit試劑盒使用說(shuō)明。提取的RNA樣本經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳及 Thermo Scientific NanoDrop 2000分光光度計(jì)檢測(cè)。檢測(cè)合格的 RNA 樣品送上海瀚宇生物技術(shù)有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.2.4 基因編碼CFEM蛋白的轉(zhuǎn)錄分析

對(duì)這三個(gè)階段受侵染的草莓葉片和陰性對(duì)照(接種等量無(wú)菌水的草莓葉片)分別提取RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反轉(zhuǎn)錄參見(jiàn)PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒使用說(shuō)明。擴(kuò)增引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。RT-PCR方法擴(kuò)增得到侵染時(shí)期三個(gè)不同階段的編碼CFEM蛋白基因。CFEM蛋白基因克隆片段均構(gòu)建至pMD18-T(購(gòu)自寶生物工程有限公司)并送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)果與CFEM蛋白基因序列完全一致。

2 結(jié)果與分析

2.1 草莓膠孢炭疽菌CFEM 蛋白的鑒定

Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)是一個(gè)包含了大量多重序列校準(zhǔn),以及“隱藏式馬爾科夫模型”的巨大集合,涵蓋了許多蛋白質(zhì)家族。草莓膠孢炭疽菌基因組基因共編碼15 381個(gè)蛋白,利用蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫(kù)Pfam (http:∥pfam.xfam.org/)對(duì)膠孢炭疽菌基因組編碼的CFEM蛋白進(jìn)行分析,共獲得22個(gè)CFEM蛋白(表1)。

表1草莓膠孢炭疽菌CFEM蛋白

Table1TheinformationofCFEMproteinsinColletotrichumgloeosporioidesonstrawberry

2.2 草莓膠孢炭疽菌CFEM 蛋白信號(hào)肽分析

效應(yīng)子由真菌分泌到胞外后,由信號(hào)肽引導(dǎo)其進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。因此,本文首先對(duì)膠孢炭疽菌中所有的CFEM 蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè),初步確定草莓膠孢炭疽菌CFEM分泌蛋白的組成。由SignalP 4.1 Server在線(xiàn)軟件對(duì)CFEM蛋白進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析的結(jié)果顯示,22個(gè)CFEM蛋白中有21個(gè)CFEM蛋白N端氨基酸序列具有信號(hào)肽,其信號(hào)肽序列為N 端16～25個(gè)氨基酸(表2)。一些內(nèi)在膜蛋白、膜結(jié)合蛋白和各種胞內(nèi)的細(xì)胞器蛋白同樣含有信號(hào)肽,但不是效應(yīng)子。因此,需進(jìn)一步對(duì)CFEM蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析,以排除上述蛋白。

表2草莓膠孢炭疽菌各CFEM蛋白信號(hào)肽分析1)

Table2BioinformaticanalysisofsignalpeptidesofCFEMproteinsinColletotrichumgloeosporioides

蛋白序列號(hào)ProteinID信號(hào)肽Signalpeptide信號(hào)肽切割位點(diǎn)Cleavagesite蛋白序列號(hào)ProteinID信號(hào)肽Signalpeptide信號(hào)肽切割位點(diǎn)CleavagesiteCGGC5＿2461．1 +21/22CGGC5＿1173．1-CGGC5＿13949．1+19/20CGGC5＿10073．1+20/21CGGC5＿1956．1 +17/18CGGC5＿9409．1+24/25CGGC5＿13478．1+18/19CGGC5＿5966．1+22/23CGGC5＿13200．1+16/17CGGC5＿5833．1+16/17CGGC5＿11628．1+19/20CGGC5＿621．1 +26/27CGGC5＿1525．1 +19/20CGGC5＿7948．1+20/21CGGC5＿11293．1+22/23CGGC5＿908．1 +19/20CGGC5＿11153．1+20/21CGGC5＿9429．1+21/22CGGC5＿11062．1+16/17CGGC5＿1574．1+19/20CGGC5＿10469．1+20/21CGGC5＿15026．1+21/22

1) “+” 表示該蛋白具有信號(hào)肽;“-”表示該蛋白不具有信號(hào)肽。 “+” indicates the protein with signal peptide sequences; “-” indicates the protein without signal peptide sequences.

2.3 草莓膠孢炭疽菌CFEM蛋白亞細(xì)胞定位分析

本文利用TargetP軟件對(duì)21個(gè)具有信號(hào)肽的CFEM蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析。分析結(jié)果表明,21個(gè)CFEM蛋白通過(guò)分泌途徑分泌至胞外的得分值≥0.677。其中,除CGGC5_11628.1、CGGC5_11293.1和CGGC5_15026.1定位可信度略低(RC=3)外,其余18個(gè)CFEM蛋白的定位預(yù)測(cè)可信度皆較高(RC≤2)。因此,21個(gè)具有信號(hào)肽的CFEM均為分泌蛋白,可通過(guò)草莓膠孢炭疽菌分泌途徑分泌至胞外(表3)。

表314個(gè)具信號(hào)肽的CFEM蛋白的亞細(xì)胞定位分析1)

Table3SubcellularlocalizationpredictionofCFEMproteinsinColletotrichumgloeosporioides

蛋白序列號(hào)ProteinID細(xì)胞器定位得分值SubcellularlocalizationpredictionvaluemTPSPOtherLocRC蛋白序列號(hào)ProteinID細(xì)胞器定位得分值SubcellularlocalizationpredictionvaluemTPSPOtherLocRCCGGC5＿2461．10．0510．9670．026S1CGGC5＿10073．10．0450．9170．057S1CGGC5＿13949．10．0950．9180．027S1CGGC5＿9409．10．0780．9200．022S1CGGC5＿1956．10．0230．9650．080S1CGGC5＿5966．10．0330．9560．029S1CGGC5＿13478．10．0210．9470．130S1CGGC5＿5833．10．0650．8830．087S2CGGC5＿13200．10．0250．9520．070S1CGGC5＿621．10．0600．9640．014S1CGGC5＿11628．10．2540．8400．017S3CGGC5＿7948．10．1120．8950．062S2CGGC5＿1525．10．0220．9890．017S1CGGC5＿908．10．0400．9650．022S1CGGC5＿11293．10．1550．6770．119S3CGGC5＿9429．10．0710．9390．021S1CGGC5＿11153．10．0330．8670．095S2CGGC5＿1574．10．0160．9700．058S1CGGC5＿11062．10．0480．8470．155S2CGGC5＿15026．10．2440．8050．011S3CGGC5＿10469．10．0320．8460．091S2

1) mTP:線(xiàn)粒體定位;S:分泌途徑;SP:該蛋白含有信號(hào)肽,可通過(guò)分泌途徑分泌至胞外,為分泌蛋白;Other:其他定位;Loc:預(yù)測(cè)定位結(jié)果。RC:可信度等級(jí)從1～5,估算亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)最大值和次值之間的差距(diff)。1:diff≥0.800;2:0.800>diff≥0.600;3:0.600>diff≥0.400;4:0.400>diff≥0.200;5:diff<0.200。RC值越低,定位越準(zhǔn)確,RC=1定位預(yù)測(cè)最可靠。 mTP: Mitochondrion localization; S: Secretion pathway; SP: Signal peptide; Other: Any other localization; Loc: Prediction of localization.RC: Reliability class, from 1 to 5, where 1 indicates the strongest prediction.RCis a measure of the size of the difference (diff) between the highest (winning) and the second highest output scores. There are 5 reliability classes, defined as follows: 1:diff≥0.800; 2: 0.800>diff≥0.600; 3: 0.600>diff≥0.400; 4: 0.400>diff≥0.200; 5:diff<0.200. Thus, the lower the value ofRC, the safer the prediction.

2.4 草莓膠孢炭疽菌CFEM分泌蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域分析

由于分泌蛋白和跨膜蛋白均含有疏水區(qū)域,因此很難將兩者區(qū)分開(kāi)來(lái)。因此,為了避免跨膜蛋白和分泌蛋白相混淆,選用TMHMM軟件對(duì)21個(gè)含信號(hào)肽的CFEM蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè),剔除跨膜結(jié)構(gòu)域>1的蛋白。結(jié)果表明21個(gè)含信號(hào)肽的CFEM蛋白中有13個(gè)CEFM蛋白均含有跨膜結(jié)構(gòu)域,說(shuō)明其為跨膜蛋白。而其余8個(gè)CEFM蛋白不含有跨膜結(jié)構(gòu)域,說(shuō)明它們屬于CFEM分泌蛋白(表4)。

表4草莓膠孢炭疽菌CFEM蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域分析

Table4BioinformaticanalysisoftransmembraneofCFEMproteinsinColletotrichumgloeosporioides

蛋白序列號(hào)ProteinID跨膜結(jié)構(gòu)域數(shù)目NumberofpredictedTMHs跨膜結(jié)構(gòu)域位置PositionoftransmembranedomainTM1TM2TM3TM4TM5TM6TM7TM8CGGC5＿2461．16113～132152～174187～209219～241262～284299～321CGGC5＿13949．187～29 104～126139～161181～203215～237265～287300～322342～364CGGC5＿1956．10CGGC5＿13478．10CGGC5＿13200．10CGGC5＿11628．17103～120135～157177～199209～231252～274294～316329～351CGGC5＿1525．17100～122135～157179～201214～236260～282295～317337～359CGGC5＿11293．10CGGC5＿11153．10CGGC5＿11062．10CGGC5＿10469．10CGGC5＿10073．12101～123187～206

續(xù)表4Table4(Continued)

蛋白序列號(hào)ProteinID跨膜結(jié)構(gòu)域數(shù)目NumberofpredictedTMHs跨膜結(jié)構(gòu)域位置PositionoftransmembranedomainTM1TM2TM3TM4TM5TM6TM7TM8CGGC5＿9409．187～24110～128141～163183～205218～240265～287300～322342～364CGGC5＿5966．175～22102～119139～156171～193219～241256～278290～312CGGC5＿5833．10CGGC5＿621．16149～171191～213233～255270～292305～327342～364CGGC5＿7948．17108～130143～162186～208220～242266～288301～323343～365CGGC5＿908．182～2195～117130～152172～194214～236256～275288～310325～347CGGC5＿9429．1599～118131～153173～195208～230290～308CGGC5＿1574．1793～115128～147172～194207～229253～275288～306321～343CGGC5＿15026．174～2134～5379～101114～136159～181193～215235～257

2.5 炭疽菌屬CFEM蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析

MEGA建樹(shù)結(jié)果表明,盡管以8個(gè)CFEM為靶標(biāo)蛋白繪制的進(jìn)化樹(shù)總體來(lái)說(shuō)有較高的相似性,但各自之間仍存在差異。進(jìn)化樹(shù)大體上分為2個(gè)大分支,其中分支一由C.simmondsii、C.fioriniae、C.nymphaeae、C.salicis和本研究中的C.gloeosporioides組成,分支二由C.tofieldiae、C.incanum、C.higginsianum、C.sublineola和C.graminicola組成。有趣的是,在分支一中,C.simmondsii、C.fioriniae、C.nymphaeae和C.salicis同源性較高,被劃分到一個(gè)小分支;而本研究中的C.gloeosporioides則與上述4種炭疽菌同源性相對(duì)較低,被獨(dú)立分到另一小分支。

圖1 CFEM蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 The phylogenetic tree of CFEM proteins

2.6 CFEM基因在膠孢炭疽菌侵染草莓葉片不同階段中的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

效應(yīng)子由病原真菌在侵染過(guò)程中泌出,因此,在侵染階段表達(dá)的分泌蛋白更有可能與病菌的致病性密切相關(guān),為此,本研究以純培養(yǎng)和在植物組織內(nèi)侵染的3個(gè)不同階段的膠孢炭疽菌為研究對(duì)象,利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)進(jìn)行分析,比較8個(gè)CFEM分泌蛋白編碼基因在不同環(huán)境下的差異表達(dá)。圖2為轉(zhuǎn)錄組測(cè)序各樣本總RNA 的提取質(zhì)量檢測(cè):28S rRNA和18S rRNA條帶較清晰,滿(mǎn)足測(cè)序需要。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果表明,8個(gè)CFEM蛋白編碼基因中,CGGC5_13478.1和CGGC5_11153.1在侵染后3個(gè)階段均上調(diào)表達(dá),其中CGGC5_13478.1在侵染后3個(gè)時(shí)間點(diǎn)上調(diào)均大于80倍。CGGC5_13200.1在附著胞形成階段表達(dá)顯著上調(diào),在活體營(yíng)養(yǎng)階段和死體營(yíng)養(yǎng)階段表達(dá)量則有一定程度下調(diào)。相較之下,CGGC5_11293.1和CGGC5_10469.1在活體和死體營(yíng)養(yǎng)階段均有表達(dá)。在活體營(yíng)養(yǎng)階段特異性上調(diào)表達(dá)的基因有CGGC5_11602.1和CGGC5_5833.1,其中CGGC5_5833.1上調(diào)倍數(shù)達(dá)90倍。而僅有一個(gè)CFEM蛋白編碼基因,CGGC5_1956.1,在死體營(yíng)養(yǎng)階段上調(diào)表達(dá),與對(duì)照組相比上調(diào)約34倍(圖3)。這些結(jié)果說(shuō)明,盡管8個(gè)CFEM蛋白編碼基因在膠孢炭疽菌侵染均有上調(diào)表達(dá),但表達(dá)的時(shí)間點(diǎn)和程度有較大差異,說(shuō)明這些CFEM分泌蛋白在膠孢炭疽菌侵染過(guò)程中發(fā)揮不同的作用。

圖2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序RNA樣本瓊脂糖凝膠檢測(cè)Fig.2 Agarose gel electrophoresis of total RNA

圖3 CFEM分泌蛋白編碼基因差異表達(dá)熱圖Fig.3 Heat map showing expression levels of CFEM protein-coding genes

2.7 草莓膠孢炭疽菌CFEM分泌蛋白的RT-PCR分析

采用RT-PCR方法對(duì)8個(gè)CFEM分泌蛋白在膠孢炭疽菌在不同侵染階段的表達(dá)情況進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證,結(jié)果顯示,8個(gè)CFEM分泌蛋白在侵染的3個(gè)不同階段均有表達(dá)(表5)。其中,CGGC5_13200.1在附著胞形成階段特異表達(dá);CGGC5_11602.1和CGGC5_5833.1在活體營(yíng)養(yǎng)階段特異表達(dá),在此階段,膠孢炭疽菌在寄主體內(nèi)形成初級(jí)菌絲;CGGC5_1956.1在死體營(yíng)養(yǎng)階段特異表達(dá),此階段,次級(jí)侵染菌絲形成并誘導(dǎo)寄主細(xì)胞死亡。CGGC5_13478.1和CGGC5_11153.1在3個(gè)階段均有表達(dá)。CGGC5_11293.1和CGGC5_10469.1在活體和死體營(yíng)養(yǎng)階段均有表達(dá),與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致。因此,8個(gè)CFEM分泌蛋白皆可在膠孢炭疽菌侵染階段表達(dá),預(yù)測(cè)其均為膠孢炭疽菌CFEM效應(yīng)子。

表5CFEM分泌蛋白的轉(zhuǎn)錄分析1)

Table5TranscriptionalanalysisofColletotrichumgloeosporioidessecretoryproteins

蛋白序列號(hào)ProteinID3個(gè)侵染階段Allthreephases附著胞形成階段Inplantaappressoriumphase活體營(yíng)養(yǎng)階段Biotrophicphase死體營(yíng)養(yǎng)階段Necrotrophicphase陰性對(duì)照NegativecontrolCGGC5＿1956．1+CGGC5＿13478．1+CGGC5＿13200．1+CGGC5＿11293．1++CGGC5＿11153．1+CGGC5＿11062．1+CGGC5＿10469．1++CGGC5＿5833．1+

1) “+” 表示CFEM候選效應(yīng)子在該階段表達(dá)。 “+” indicates that this CFEM candidate effector is expressed in this phase.

3 討論

目前有關(guān)半活體營(yíng)養(yǎng)型真菌如何應(yīng)對(duì)寄主植物的免疫反應(yīng)及其如何調(diào)控活的寄主植物細(xì)胞的機(jī)制尚不明確[13]。然而近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn),與植物和動(dòng)物致病細(xì)菌一樣,植物病原真菌也能夠產(chǎn)生和分泌效應(yīng)子。這些效應(yīng)子能夠與寄主植物互作且在病原真菌致病的過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用[14-15]。

自從在粗球孢子菌Coccidioidesimmitis中首次發(fā)現(xiàn)CFEM蛋白以來(lái),一些新的CFEM蛋白也從不同的真菌中鑒定出來(lái)。這些含有CFEM蛋白的真菌分別為稻瘟病菌Magnaporthegrisea、白假絲酵母C.albicans、近平滑假絲酵母C.parapsilosis、煙曲霉Aspergillusfumigatus和尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum[9,17-19]。對(duì)CFEM蛋白的功能研究發(fā)現(xiàn),這類(lèi)蛋白在真菌的某些生理過(guò)程中起作用,可能與致病性相關(guān)。Ling等[20]將尖孢鐮刀菌F.oxysporum中12個(gè)不同的專(zhuān)化型進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)每個(gè)專(zhuān)化型平均含有16個(gè)CFEM蛋白,其中某些CFEM蛋白含有DR基序。包含DR基序的CFEM蛋白(CFEM_DR蛋白)在尖孢鐮刀菌菌株間非常保守,相比其他真菌,CFEM_DR蛋白的數(shù)量在尖孢鐮刀菌中更多。對(duì)CMEF_DR蛋白的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn),編碼CMEF_DR蛋白基因在孢子和菌絲階段表達(dá)量明顯高于其他階段,且在接種寄主3 d后,表達(dá)量顯著升高。由此說(shuō)明CMEF_DR蛋白在定殖和侵染寄主過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。井忠英等[9]對(duì)禾谷炭疽菌C.graminicola中的CFEM蛋白進(jìn)行了生物信息及轉(zhuǎn)錄分析。結(jié)果表明,禾谷炭疽菌含有32個(gè)CFEM蛋白,且其中22個(gè)為分泌蛋白。這22個(gè)分泌蛋白在病菌侵染時(shí)期的3個(gè)階段均有表達(dá)。預(yù)測(cè)這22個(gè)CFEM分泌蛋白為禾谷炭疽菌致病相關(guān)的效應(yīng)子。

高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展及全基因組測(cè)序真菌數(shù)量的大幅增加,為在病原真菌中鑒定效應(yīng)子提供了有力的保障。有關(guān)草莓膠孢炭疽菌效應(yīng)子的報(bào)道十分有限[21],其尚無(wú)CFEM效應(yīng)子的相關(guān)研究。由于缺乏一致的序列特征或結(jié)構(gòu)折疊,真菌的效應(yīng)子預(yù)測(cè)是一個(gè)難題。

本文利用Pfam數(shù)據(jù)庫(kù),對(duì)膠孢炭疽菌的基因組進(jìn)行分析,獲得22個(gè)含有CFEM結(jié)構(gòu)域的蛋白。效應(yīng)子通常經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體分泌,由此需要疏水的N末端信號(hào)肽[22]。迄今為止,經(jīng)研究證實(shí)的真菌效應(yīng)子均含有該信號(hào)肽[23]。本文采用SignalP、TargetP及TMHMM軟件對(duì)22個(gè)CFEM蛋白進(jìn)行了分析,綜合結(jié)果分析預(yù)測(cè),8個(gè)CFEM蛋白為膠孢炭疽菌的分泌蛋白。對(duì)其利用MEGA進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建,結(jié)果表明,膠孢炭疽菌CFEM蛋白不屬于分支二,在分支一中又單獨(dú)成一支,與已報(bào)道的禾谷炭疽菌中的CFEM分泌蛋白親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。說(shuō)明與其他炭疽菌相比,膠孢炭疽菌CFEM蛋白有其自身的特點(diǎn)。由于效應(yīng)子與病原真菌侵染相關(guān),因此,本文采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和RT-PCR技術(shù)對(duì)8個(gè)CFEM分泌蛋白在3個(gè)不同侵染時(shí)期的轉(zhuǎn)錄表達(dá)進(jìn)行了研究,結(jié)果表明,8個(gè)CFEM分泌蛋白均在膠孢炭疽菌的侵染階段表達(dá),但表達(dá)的階段和程度有較大差異。其中CGGC5_13478.1在侵染后3個(gè)時(shí)間點(diǎn)上調(diào)均大于80倍,說(shuō)明其可能在膠孢炭疽菌整個(gè)侵染過(guò)程中都發(fā)揮重要作用。除此之外,CGGC5_5833.1在活體營(yíng)養(yǎng)階段上調(diào)表達(dá)高達(dá)90倍,說(shuō)明其可能在活體營(yíng)養(yǎng)階段發(fā)揮重要作用。除此之外,其他CFEM基因在不同時(shí)間點(diǎn)均有上調(diào)表達(dá)。綜合以上結(jié)果預(yù)測(cè),8個(gè)CFEM分泌蛋白有可能是膠孢炭疽菌的效應(yīng)子。本實(shí)驗(yàn)室將在后續(xù)試驗(yàn)中,對(duì)這些推測(cè)加以求證,明確CFEM蛋白效應(yīng)子的功能,為抗病育種奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯： 田 喆)

BioinformaticidentificationandtranscriptionalanalysisofColletotrichumgloeosporioidescandidateCFEMeffectorproteins

Zhang Liqing, Duan Ke, Zou Xiaohua, He Chengyong, Gao Qinghua

(ResearchInstituteofForestryandFruitTrees,ShanghaiAcademyofAgriculturalSciences,Shanghai201403,China)

Plant pathogens secrete effector proteins into host tissues to regulate host physiological processes and promote its infection. Common in several fungal extracellular membrane (CFEM) proteins is unique to fungi and plays an important role in pathogenesis. In our study, we obtained 22 CFEM proteins ofColletotrichumgloeosporioidesby searching Pfam database. Then, we conducted a bioinformatics analysis on signal peptide, transmembrane domain and protein subcellular localization of these 22 CFEM proteins. The results showed that only 8 of them were secreted proteins. The transcriptome and RT-PCR analysis of these 8 CFEM proteins at different stages of infection were performed. Among them, one protein was expressed ininplantaappressorium stage, two were expressed in biotrophic stage and one was expressed in necrotrophic stage. Collectively, the 8 CFEM proteins were predicted to be the candidate effectors ofC.gloeosporioides. Our findings provide a theoretical basis for in-depth analysis for the function of CFEM effectors in plant pathogenic fungi.

Colletotrichumgloeosporioides; effector; CFEM protein

S 436.639

： ADOI： 10.3969/j.issn.0529-1542.2017.05.006

2016-10-08

： 2017-01-05

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金(31501592);上海市科委自然科學(xué)基金項(xiàng)目(14ZR1436800);上海市科委現(xiàn)代農(nóng)業(yè)領(lǐng)域重點(diǎn)科技項(xiàng)目(16391901400);上海市科委基礎(chǔ)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(14JC1405400);上海市瓜果產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(滬農(nóng)科產(chǎn)字(2017)第1號(hào))

* 通信作者 E-mail: qhgao20338@sina.com