CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞治療反復(fù)性流產(chǎn)的動物實驗研究

段 彪 王 璐 黃薇薇 王守紅 杜海燕

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖中心 (包頭，014010 )

·基礎(chǔ)研究·

CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞治療反復(fù)性流產(chǎn)的動物實驗研究

段 彪 王 璐 黃薇薇 王守紅 杜海燕*

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖中心 (包頭，014010 )

目的：通過動物實驗，探討CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞用于反復(fù)性流產(chǎn)免疫治療的效果。方法：密度梯度離心法從正常昆明白新生鼠的血液和能正常生育的BALB/c雄鼠血液中分別分離單核淋巴細胞，再用免疫磁珠法篩選出CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞；以CBA/J雌鼠×DBA/2J雄鼠交配組合作為反復(fù)自然流產(chǎn)的動物模型，于孕期給予鼠尾靜脈注射不同種類的淋巴細胞；采用獨立樣本t檢驗對各組得到的數(shù)據(jù)進行分析和處理。結(jié)果：注射CD4+CD25+T細胞組小鼠CD4+CD25+T細胞在CD4+T細胞中的占比為(17.49±0.60)%，高于注射單核淋巴細胞組的(14.68±0.83)%、無菌PBS組的(9.54±0.85)%和不注射組的(9.28±0.68)%(t=4.754，P<0.05；t=13.242，P<0.05；t=15.621，P<0.05)。CD4+CD25+調(diào)節(jié)T細胞中的Foxp3蛋白相對表達量(5.85±0.45)高于注射單核淋巴細胞組(2.86±0.54)、無菌PBS組(1.08±0.16)和不注射組(1.00±0.00)(t=7.276，P<0.05；t=17.227，P<0.05；t=18.635，P<0.05)。在第4天和第8天分別注射調(diào)節(jié)T細胞得到了較好的效果，胚胎吸收率為(4.92±0.08)%，低于注射單核淋巴細胞組的(13.07±0.06)%、注射無菌PBS組的(23.11±0.12)%和不注射組的(25.47±0.11)%(t=-2.603，P<0.05；t=-4.012，P<0.05；t=-4.700，P<0.05)。結(jié)論：給反復(fù)性流產(chǎn)小鼠于孕期進行多次CD4+CD25+T細胞注射，免疫治療效果好于傳統(tǒng)的注射單核淋巴細胞。

調(diào)節(jié)性T細胞；反復(fù)性流產(chǎn)；免疫治療；免疫耐受

針對同種免疫異常所致的反復(fù)自然流產(chǎn)(RSA)患者，臨床上采用父方或無關(guān)第三方個體外周血分離得到的淋巴細胞進行主動免疫治療。雖然主動免疫治療能提高封閉抗體陰性所致RSA患者的妊娠率[1]，但由于RSA發(fā)病因素復(fù)雜，傳統(tǒng)的治療方法存在局限性。一些證據(jù)表明，RSA患者體內(nèi)調(diào)節(jié)T細胞數(shù)量和功能明顯下降，使得Th1型免疫應(yīng)答過強和Th2型免疫應(yīng)答不足，從而導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生[2-3]。因此，通過人為補充體內(nèi)調(diào)節(jié)T細胞有可能成為治療RSA的一條新策略。CD4 +CD25+調(diào)節(jié)性T細胞是具有免疫負性調(diào)節(jié)功能的一類CD4+T輔助細胞，其表面特征性地表達IL-2 受體分子( CD25)[4]。目前，從成人的外周血中獲得調(diào)節(jié)性T細胞的比例較低(1%～2%)，阻礙了調(diào)節(jié)性T細胞用于免疫治療[5]。相反，從臍血中可以獲得較大比例的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞亞群，而且所得細胞處于相對原始狀態(tài)，不容易被體外刺激變成效應(yīng)T細胞[6]，為臨床的應(yīng)用研究提供了極大的方便。本研究通過動物實驗，探討CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞用于RSA患者的免疫治療，為治療RSA提供新的治療思路。

1 材料和方法

1.1材料

Ficoll-Hypaque為Amersham Bioscience公司生產(chǎn)；免疫磁珠分離試劑盒購自MiltenyiBiotec公司；RPMI1640培養(yǎng)液購自為Invitrogen-Gibco公司；磷酸緩沖液(PBS)購自Hyclone公司；8%多聚甲醛購自Electron Microscopy Sciences公司；Triton X-100和臺盼藍為Sigma公司生產(chǎn)；Tween 20和牛血清白蛋白BSA為Amresco公司生產(chǎn)；各種抗體為Abcam/jacksonimmunoResearch公司生產(chǎn)；昆明白雌鼠(6周齡、SPF級、22.7±2.2g)和雄鼠(8周齡、SPF級、28.9±2.6g)購自內(nèi)蒙古大學實驗動物中心；雌性CBA/J小鼠(6周齡、SPF級、19.3±1.8g)、雄性DBA/2J(8周齡、SPF級、24.3±2.4g)和雄性BALB/c小鼠(8周齡、SPF級、25.4±1.5g)均購自南京大學模式動物研究所。

1.2臍血來源的CD4+CD25+陽性調(diào)節(jié)T細胞的分離和篩選

抽取昆明白鼠血液10ml，置于15ml的抗凝無菌離心管中，用Ficoll-Hypaque密度梯度法[6]分離血液中的單核細胞。用無菌的PBS 1：1稀釋臍血，置于10ml Ficoll-Hypaque液上方；400×g, 25min離心，回收白色細胞層。CD4+T細胞用免疫磁珠分離試劑盒(含有CD8、CD11b、CD16、CD19、CD36和CD56的混合抗體)進行富集并過柱處理?？傟栃约毎偻ㄟ^抗CD25+的磁珠陽性分選，加入10μl 抗鼠CD25-PE/106單核細胞，30min冰孵, 300×g, 10min離心；250μl MACS緩沖液中重懸細胞，加入10μl 抗-PE MACS磁珠，30min冰孵，300×g, 10min離心；500μl MACS緩沖液中重懸細胞，過柱；回收陽性細胞。

1.3 BALB/c雄鼠外周血單核淋巴細胞的分離

為了模擬人類反復(fù)性流產(chǎn)的免疫治療，選擇能正常生育的BALB/c雄鼠作為無關(guān)第三方血液來源，用Ficoll-Hypaque密度梯度法分離血液中的單核淋巴細胞。

1.4反復(fù)性流產(chǎn)小鼠模型的建立

根據(jù)CBA/J雌鼠×DBA/2J雄鼠交配組合常作為反復(fù)自然流產(chǎn)的動物模型,流產(chǎn)率為20%～40%，相對恒定[7]。交配及妊娠確定：流產(chǎn)組為CBA/J雌鼠×DBA/2J雄鼠，對照組為CBA/J雌鼠×BALB/c雄鼠。兩組小鼠按雄:雌=1:2的比例于擬交配日17:30稱重后合籠，次日早、晚8:00各檢查陰道栓1次，見栓后分籠飼養(yǎng)(見栓日記為孕0.5d)。

1.5臍血調(diào)節(jié)T細胞注射RSA小鼠模型

將RSA孕鼠隨機分為7組，第1、2、3和7組的數(shù)量為15只，第4、5、6組數(shù)量為10只。第1、2、3組的孕鼠于孕第4天分別給予尾靜脈注射調(diào)節(jié)T細胞[細胞濃度(2～2.5)×106/ml，注射量50μl]、BALB/c雄鼠外周血來源單核淋巴細胞[細胞濃度(2～2.5)×106/ml，注射量50μl]和無菌PBS(空白對照)；第4、5和6組的孕鼠于孕第4天和第8天分別給予尾靜脈注射調(diào)節(jié)T細胞[細胞濃度(2～2.5)×106/ml，注射量50μl]、BALB/c雄鼠外周血來源單核淋巴細胞[細胞濃度(2～2.5)×106/ml，注射量50μl]和無菌PBS；第7組不注射。

1.6 CD4+CD25+T細胞的檢測

流式細胞術(shù)檢測脾臟CD4+CD25+T細胞。將上述1、2、3和7組的5只孕鼠處理后得到的脾臟單核細胞離心沉淀，加入無菌的PBS充分洗滌。計算細胞總數(shù)，每只小鼠(5～6)×107個細胞。細胞中分別加入10μg/ml FITC標記的抗CD4和5μg/ml PE標記的抗CD25單克隆抗體，充分混勻細胞后進行流式細胞分選。

1.7 CD4+CD25+T細胞中Foxp3表達的檢測

1.8胚胎發(fā)育情況的觀察

在妊娠第13天分別將各組的10只CBA/J孕鼠處死，計算各組吸收胚胎個數(shù)及存活胚胎個數(shù)，根據(jù)公式計算胚胎吸收率(被吸收胚胎數(shù)/總胚胎數(shù)×100%)。

1.9統(tǒng)計學分析采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析,采用獨立樣本t檢驗比較兩組小鼠的CD4+CD25+T細胞比例、FoxP3表達率的變化和不同注射方法的胚胎吸收率。檢驗度a=0.05(雙側(cè))。

2 結(jié)果

2.1 CD4+CD25+T細胞的占比

1組與2組、3組、7組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(t=4.754，P<0.05；t=13.242，P<0.05；t=15.621，P<0.05)。2組分別與3組、7組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(t=7.529，P<0.05；t=8.737，P<0.05)。3組與7組比較，差異無統(tǒng)計學意義(t=0.415、P>0.05)。見表1。

表1 各組CD4+T、CD4+CD25+T細胞檢測結(jié)果

*與1組比較#與2組比較P<0.05

2.2 CD4+CD25+T細胞中Foxp3的表達

使用Image J軟件對Western Blot結(jié)果(圖2)進行灰度分析，得出的灰度值與7組的灰度值進行倍性比較得出蛋白相對表達量。結(jié)果顯示，1組Foxp3的相對蛋白表達量(5.85±0.45)與2組(2.86±0.54)、3組(1.08±0.16)、7組(1.00±0.00)比較，差異均具有統(tǒng)計學意義(t=7.276,P<0.05；t=17.227,P<0.05；t=18.635，P<0.05)；2組與3組、7組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義(t=5.385，P<0.05；t=5.871，P<0.05)；3組與7組比較，差異無統(tǒng)計學意義(t=-0.846，P>0.05)。見圖1。

2.3胚胎發(fā)育情況的觀察

4組的胚胎吸收率與5組、6組、7組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(t=-2.603，P<0.05；t=-4.012，P<0.05；t=-4.700，P<0.05)。1組與2組、3組比較，差異無統(tǒng)計學意義；與7組比較，差異有統(tǒng)計學意義(t=-2.177，P<0.05)。見表2。

A：Foxp3的表達 B：-Actin作為內(nèi)參基因的表達

表2 各組胚胎吸收情況比較

*與7組比較P<0.05#與4組比較P<0.05

3 討論

在RSA發(fā)病中占據(jù)較大比例的是同種免疫型RSA，是在同一種屬之間針對不同的抗原成分發(fā)生的免疫反應(yīng)，約50%找不到明確病因的RSA患者屬于這個類別。妊娠相當于同種異體移植[8]，胎兒所攜帶的父系HLA抗原可刺激母體免疫活性細胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答；同時母體內(nèi)又存在有免疫抑制功能的細胞，在胚胎所攜帶的父系抗原刺激下，這種細胞也增加，從而維持免疫耐受狀態(tài)。免疫應(yīng)答和免疫抑制相平衡，才使胎兒成活直至分娩。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性 T 細胞具有免疫負性調(diào)節(jié)功能和低反應(yīng)性的特點，通過細胞間接觸抑制及分泌抑制性細胞因子等途徑發(fā)揮抗炎和維持自身免疫耐受。Forkhead box p3(Foxp3)是調(diào)節(jié)T細胞內(nèi)的標記分子，是特異性調(diào)節(jié)因子，對調(diào)節(jié)T細胞在胸腺內(nèi)的發(fā)育、在外周血的分布以及免疫抑制功能的維持具有重要作用。研究證實，新近發(fā)現(xiàn)的 IL-35 這種少見的免疫抑制分子正是由Foxp3+的調(diào)節(jié)T細胞分泌，通過調(diào)節(jié)效應(yīng)T細胞的活性達到免疫抑制的目的[9]。

本實驗比較了注射CD4+CD25+T細胞和傳統(tǒng)通過單核淋巴細胞用于反復(fù)性流產(chǎn)的免疫治療。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，CD4+CD25+T細胞注射組(1組)的CD4+CD25+T細胞在CD4+T細胞的占比均高于單核淋巴細胞注射組(2組)、注射PBS組(3組)和不注射組(7組)，說明注射CD4+CD25+T細胞比注射單核淋巴細胞會導(dǎo)致機體產(chǎn)生比例更多的調(diào)節(jié)T細胞。與空白對照組和不注射組相比，傳統(tǒng)的注射單核淋巴細胞也會導(dǎo)致調(diào)節(jié)T細胞占比的提高，這可能解釋了傳統(tǒng)方法有效的原因[10]。Western Blot檢測結(jié)果顯示，CD4+CD25+T細胞注射組CD4+CD25+T細胞表達的Foxp3蛋白量更多，而Foxp3是調(diào)節(jié)T細胞的特異性調(diào)節(jié)因子，注射CD4+CD25+T細胞似乎會導(dǎo)致機體表達更多的Foxp3蛋白，從而更有利于發(fā)揮免疫抑制功能[11]。本實驗結(jié)果顯示，第4天和第8天兩次注射CD4+CD25+T細胞組(4組)的胚胎吸收率均低于兩次注射單核淋巴細胞組(5組)、兩次注射PBS組(6組)和不注射組(7組)，說明妊娠后兩次注射調(diào)節(jié)T細胞組比傳統(tǒng)的注射單核淋巴細胞更適合RSA的治療[12]。妊娠單次注射CD4+CD25+細胞組與第4天注射單核淋巴細胞組和注射PBS相比沒有差別，說明單次注射CD4+CD25+調(diào)節(jié)T細胞沒有獲得治療上的優(yōu)勢。

結(jié)論：動物實驗結(jié)果提示， 通過人為補充體內(nèi)CD4+CD25+T調(diào)節(jié)T細胞有可能成為治療RSA的一條新策略。

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[責任編輯：張 璐]

AnimalstudyonCD4+CD25+regulatoryTcellsfortreatingfemalemousewithrecurrentspontaneousabortion

Duan Biao, Wang Lu, Huang Wewei, Wang Shouhong, Du Haiyan*

ReproductiveCenterofDepartmentofObstetricsandGynecology,ThirdAffiliatedHospital,InnerMongoliaMedicalUniversity,BaoTou,InnerMongolia, 014010

*Correspondingauthor: 13947268268@139.com

Objective: To explore immunotherapy effectiveness of the CD4+CD25+regulatory T cells for treating female mouse with recurrent spontaneous abortion (RSA) by animal experiments. Methods: Mononuclear lymphocytes were isolated from the blood (instead of cord blood) of new-born baby of KunMing Bai mouse or BALB / c male mouse with normal birth ability (as unrelated third party blood source) by density gradient centrifugation method. The CD4+CD25+regulatory T cells were selected by magnetic-activated cell sorting from mononuclear cells of cord blood cells. CBA/J female mouse copulated with DBA/2J male mouse was utilized as RSA animal model. Pregnant RSA mice were injected different types of lymphocytes through tail vein. Independent sample t-test was used to analyze the data from each group. Results: The proportion of CD4+CD25+T cells in CD4+T cells of injected CD4+CD25+regulatory T cells group was (17.49 ± 0.60) %, which was statistical significant higher than that of mononuclear lymphocyte injection group (14.68±0.83) %, sterile PBS group (9.54±0.85) % or no injection group (9.28±0.68)%, (P< 0.05, t values was 4.754, 13.24 and 15.62, respectively). The Foxp3 relative protein expression level of CD4+CD25+regulatory T cells injected group was 5.85±0.45, which was also significant higher than that of mononuclear lymphocyte injection (2.86±0.54), sterile PBS group (1.08±0.16) or no injection group (1.00±0.00) (P< 0.05, t values were 7.27、17.23 and 18.64, respectively). Finally, two times of CD4+CD25+T cell injected group at the 4th and 8th day had well effect for RSA mouse, and embryo sorption rate was 4.92±0.08%, which significant lower than that of two times of mononuclear lymphocyte injected group (13.07±0.06)%, sterile PBS group (23.11±0.12)%, or no injection group (25.47±0.11)%, (P< 0.05, t values was -2.60, -4.01 and -4.01, respectively,). Conclusion: Pregnant mouse with RSA injected CD4+CD25+T cells several times for immunotherapy can get better effectiveness than that of pregnant mouse injected traditional mononuclear cells.

Regulatory T cells; Recurrent spontaneous abortion; Immune therapy; Immune tolerance

10.3969/j.issn.1004-8189.2017.06.002

2016-12-16

2017-04-12

*通訊作者：13947268268@139.com