生物法合成雙乙酰的研究進展

崔真真，毛雨豐，陳 聰，袁倩倩，王智文，陳 濤

(1．天津大學(xué) 化工學(xué)院教育部系統(tǒng)生物工程重點實驗室，天津 300345;2．天津化學(xué)化工協(xié)同創(chuàng)新中心，天津 300345;3．中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所中國科學(xué)院系統(tǒng)微生物技術(shù)重點實驗室，天津 300308)

生物法合成雙乙酰的研究進展

崔真真1，2，毛雨豐1，2，陳 聰1，2，袁倩倩3，王智文1，2，陳 濤1，2

(1．天津大學(xué) 化工學(xué)院教育部系統(tǒng)生物工程重點實驗室，天津 300345;2．天津化學(xué)化工協(xié)同創(chuàng)新中心，天津 300345;3．中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所中國科學(xué)院系統(tǒng)微生物技術(shù)重點實驗室，天津 300308)

隨著對雙乙酰生物合成途徑的深入研究，利用代謝工程的方法定向改良菌株，優(yōu)化雙乙酰的代謝途徑，成為提高雙乙酰生產(chǎn)水平的新思路。本文總結(jié)了雙乙酰的生產(chǎn)菌株和相關(guān)代謝途徑，綜述了改造雙乙酰生產(chǎn)菌株的代謝工程策略，提出了未來的研究方向。

雙乙酰;生物法;代謝工程

雙乙酰(diacetyl)，又稱2，3-丁二酮，廣泛存在于天然植物中，如：郁金香、草莓和薰衣草等，同時也存在于酸奶、食醋和啤酒等發(fā)酵產(chǎn)品中。雙乙酰常作為食品添加劑來提高黃油口味，它同3-羥基-2-丁酮(乙偶姻)一樣，在食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)/食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)GB2760—2011中列為允許使用的食品用合成香料;雙乙酰還可作為干酪和糖果的增白劑、明膠的硬化劑以及用于合成醫(yī)藥、農(nóng)藥和精細化學(xué)品的中間體［1］。

雙乙酰的合成方法主要有提取法、化學(xué)法和生物法，練敏等［2］對其合成方法進行了比較詳盡地綜述。提取法制備雙乙酰的成本高、效益低，而化學(xué)法有污染重、工藝復(fù)雜且生產(chǎn)的雙乙酰難以達到食品級的安全要求等問題。生物法制備雙乙酰具有安全、環(huán)保等特點，能夠有效減少資源和環(huán)境壓力，因此，國內(nèi)外研究者對應(yīng)用生物法生產(chǎn)雙乙酰進行了廣泛的研究［3-7］。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，人們對微生物生理機能和代謝途徑有了更加深入的認識，應(yīng)用生物法生產(chǎn)雙乙酰在經(jīng)濟、技術(shù)和安全性上都具有可行性。本文中，筆者綜述了國內(nèi)外利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)雙乙酰的研究現(xiàn)狀，簡述了雙乙酰的生產(chǎn)菌株和相關(guān)途徑，重點介紹利用代謝工程的原理和方法對雙乙酰生產(chǎn)菌株的代謝網(wǎng)絡(luò)進行設(shè)計和改造的策略，并對未來的研究方向進行展望。

1 雙乙酰的生產(chǎn)菌株及代謝途徑

自然界中存在很多能夠天然代謝生產(chǎn)雙乙酰的微生物，如乳酸菌屬(Lactobacilus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、腸桿菌屬(Enterobacter)以及酵母(yeast)等［8］，主要生產(chǎn)菌株及其研究水平如表1所列。生產(chǎn)雙乙酰的菌株主要包括乳酸菌［9］、乳酸乳球菌［10-11］、陰溝腸桿菌［12］和乳鏈球菌［8，13］。乳酸菌等利用檸檬酸生產(chǎn)雙乙酰，檸檬酸在轉(zhuǎn)變?yōu)楸岬倪^程中沒有還原力的產(chǎn)生，抑制了依賴于還原力的反應(yīng)的發(fā)生，因此可減少副產(chǎn)物的生成［14-16］，能大量積累丙酮酸;但只以檸檬酸為底物時，菌體生長慢，產(chǎn)量低。近來，研究人員開始運用代謝工程方法改造微生物以葡萄糖為底物生產(chǎn)雙乙酰，如Candida glabrata［5］、Escherichia coli［17］和 Bacillus subtilis［18］等。目前報道的雙乙酰產(chǎn)量最高的菌株是B．subtilis，在分批補料發(fā)酵中，雙乙酰產(chǎn)量可達8．69 g/L，但得率不理想，僅為 26%(以 1 mol葡萄糖計)。Liu等［7］利用 L．lactis代謝工程合成雙乙酰，得率高達87%(即最大理論得率的87%)。

表1 雙乙酰的生產(chǎn)菌株及其研究水平Table 1 Strains for diacetyl production and research level

雙乙酰合成途徑如圖1所示。由圖1可知：當(dāng)以檸檬酸為底物時，檸檬酸在檸檬酸裂解酶的作用下裂解為草酰乙酸和乙酸，其中乙酸分泌到胞外，草酰乙酸在草酰乙酸脫羧酶的作用下脫羧形成丙酮酸。丙酮酸再經(jīng)過脫羧反應(yīng)生成2-羥乙基-硫胺素焦磷酸(HETPP)，然后HETPP與丙酮酸反應(yīng)形成α-乙酰乳酸。α-乙酰乳酸經(jīng)過非酶催化脫羧(nonenzymatic decarboxylation，NOD)生成雙乙酰，同時此途徑中會有乙偶姻和2，3-丁二醇等副產(chǎn)物的產(chǎn)生。以葡萄糖為底物時，葡萄糖經(jīng)過糖酵解途徑生成重要的代謝中間產(chǎn)物丙酮酸，丙酮酸在α-乙酰乳酸合成酶的催化下生成α-乙酰乳酸，然后α-乙酰乳酸在酸性條件下經(jīng)過非酶氧化脫羧生成雙乙酰。在此代謝途徑中伴有副產(chǎn)物甲酸、乳酸、乙酸、乙醇、乙偶姻和2，3-丁二醇的產(chǎn)生。其中，由丙酮酸生成α-乙酰乳酸和雙乙酰的途徑存在爭論，以下綜述α-乙酰乳酸合成途徑和雙乙酰合成途徑。

圖1 雙乙酰的生物合成途徑Fig.1 The diacetyl biosynthetic pathway

1.1 α-乙酰乳酸的合成途徑

丙酮酸可能通過這兩條途徑合成α-乙酰乳酸：1)2分子丙酮酸在硫胺素焦磷酸(TPP)和Mg2+的存在下，經(jīng)α-乙酰乳酸合成酶催化縮合成1分子α-乙酰乳酸，并釋放出1分子CO2［22］;2)丙酮酸在TPP存在下經(jīng)丙酮酸脫羧酶催化，生成1分子HETPP(有些研究者又稱乙醛-TPP)，并釋放出 1分子CO2，1分子HETPP和1分子丙酮酸在α-乙酰乳酸合成酶的作用下合成 1分子 α-乙酰乳酸。但BRENDA 數(shù)據(jù)庫(http：//brenda-enzymes．org/)中并沒有確切的數(shù)據(jù)支持第2個觀點。此外，有研究表明，L．lactis subsp．lactis bv．diacetylactis的 α-乙酰乳酸合成酶并不具有催化HETPP和丙酮酸生成α-乙酰乳酸的活性［23］。因此，α-乙酰乳酸合成酶被認為是合成α-乙酰乳酸的關(guān)鍵酶。

1.2 雙乙酰合成途徑

現(xiàn)在研究報道的雙乙酰合成途徑有兩條：第一條途徑為丙酮酸合成α-乙酰乳酸后，α-乙酰乳酸經(jīng)過NOD合成雙乙酰，這個觀點已經(jīng)被證實［24］，且在很多菌中發(fā)現(xiàn)存在這條途徑［25-27］。第二條途徑為丙酮酸生成的HETPP復(fù)合體可與乙酰-CoA在雙乙酰合成酶的作用下生成雙乙酰［13，28］，但至今未發(fā)現(xiàn)雙乙酰合成酶的存在［29］。近年來，越來越多的研究表明，NOD反應(yīng)是生成雙乙酰主要途徑［5-7］。

2 生物法合成雙乙酰的改造策略

目前，生物法合成雙乙酰，主要是以檸檬酸鹽或葡萄糖為底物進行微生物發(fā)酵。雙乙酰的代謝途徑如圖1所示，由圖1可知：增大雙乙酰合成途徑的代謝通量，阻斷雙乙酰還原為乙偶姻和2，3-丁二醇的途徑，失活雙乙酰競爭途徑相關(guān)基因是構(gòu)建雙乙酰高產(chǎn)菌株的可行策略。同時，通過調(diào)節(jié)輔因子解決細胞內(nèi)還原力過剩的問題，并結(jié)合發(fā)酵條件優(yōu)化手段可以進一步實現(xiàn)雙乙酰的高產(chǎn)。雙乙酰是合成乙偶姻和2，3-丁二醇的前體物質(zhì)，因此，乙偶姻和2，3-丁二醇合成的改造策略與雙乙酰生產(chǎn)菌株的改造策略具有相通之處。筆者所在課題組對乙偶姻和2，3-丁二醇合成的改造策略有較為深入的研究［30-32］以及相關(guān)綜述［33-34］，對雙乙酰的代謝工程改造具有一定的指導(dǎo)意義。

2.1 增大雙乙酰合成途徑的代謝通量

2．1．1 增強α-乙酰乳酸合成酶基因的表達

目前，針對丙酮酸到α-乙酰乳酸主要有兩種推論(圖1)，其中由丙酮酸一步脫羧生成α-乙酰乳酸的途徑更多地被研究者們采信。通過代謝工程在天然可生產(chǎn)雙乙酰菌株中過表達α-乙酰乳酸合成酶編碼基因或過表達外源基因，增加雙乙酰合成途徑的通量，可有效地提高雙乙酰的產(chǎn)量。Benson等［14］在 Lactococcus lactis中編碼 α-乙酰乳酸合成酶的ilvBN基因，以質(zhì)粒形式進行多拷貝表達，使其表達量提高了3．6倍，從而在以葡萄糖為底物的發(fā)酵中檢測到了雙乙酰的生成。Swindell等［35］在L．lactis中過表達 α-乙酰乳酸合成酶編碼基因ilvBN，乙偶姻產(chǎn)量由 0．85 mmol/L 增加到 3．08 mmol/L，顯著提高了乙偶姻的產(chǎn)量，說明丙酮酸到α-乙酰乳酸的代謝通量得到有效加強。Nadal等［36］將L．lactis的α-乙酰乳酸合成酶編碼基因ilvBN插入至Lactobacillus casei的乳糖操縱子位點，工程菌株的雙乙酰/乙偶姻產(chǎn)量比野生菌提高21倍。Gao等［5］在高產(chǎn)丙酮酸的Candida glabrata中，比較了自身的α-乙酰乳酸合成酶(ILV2)和來自B．subtilis的α-乙酰乳酸合成酶(ALS)的過表達對雙乙酰合成的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達ALS的菌株具有更高的雙乙酰合成能力(0．57 g/L vs 0．23 g/L)。2017 年，Hao等［18］利用高產(chǎn)乙偶姻和 2，3-丁二醇的 Bacillus sp．DL01，通過質(zhì)粒形式過表達自身的α-乙酰乳酸合成酶編碼基因alsS，積累了4．02 g/L的α-乙酰乳酸，雙乙酰產(chǎn)量也由1．53 g/L增至1．94 g/L。

截至目前，研究者普遍使用強啟動子過表達或者質(zhì)粒形式過表達的方式提高α-乙酰乳酸合成酶的表達量來實現(xiàn)雙乙酰的高產(chǎn)，而涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面的研究尚未見報道。但在很多天然具備2，3-丁二醇/乙偶姻生產(chǎn)能力的菌株中，alsSD操縱子一般受到alsR編碼的LysR型轉(zhuǎn)錄激活子AlsR的調(diào)控［37-38］。例如，在 B．subtilis中，適量的乙酸鹽、較低的溶解氧和低pH可以作用于AlsR，從而提高alsSD操縱子的表達水平。該研究思路同樣適用于雙乙酰菌株的改造，相應(yīng)研究有待進一步開展。

2．1．2 NOD 途徑的優(yōu)化

雙乙酰主要是由α-乙酰乳酸經(jīng)過NOD反應(yīng)生成［39-41］，優(yōu)化 NOD途徑反應(yīng)的條件，促進NOD反應(yīng)的發(fā)生，有助于雙乙酰的積累。Gollop等［41］利用純化的α-乙酰乳酸合成酶(ALAS)，以丙酮酸為底物，在添加 Mg2+、黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和TPP的磷酸鹽緩沖液中，反應(yīng)合成α-乙酰乳酸，經(jīng)過氣相檢測到雙乙酰的生成;同時，作者提出α-乙酰乳酸可經(jīng)過FeII-O2復(fù)合體(FeII-oxygen complex)或處于高度氧化態(tài)的金屬離子催化生成雙乙酰。Mohr等［42］發(fā)現(xiàn)，在 pH 6．5 時，28%的 α-乙酰乳酸可轉(zhuǎn)化為雙乙酰，但在相同條件下，加入 1．5 mmol/L CuSO4可使α-乙酰乳酸全部轉(zhuǎn)化為雙乙酰。Gao等［5］發(fā)現(xiàn)，外加 20 mmol/L Fe3+可使雙乙酰的產(chǎn)量提高 1倍。Zhang等［6］在 Enterobacter cloacae(ΔbutAΔbudC)培養(yǎng)12 h 后加入 20 mmol/L Fe3+，雙乙酰的質(zhì)量濃度最終達到1．37 g/L。Liu等［7］提出了α-乙酰乳酸生成雙乙酰的可能分子機制(圖2)：α-乙酰乳酸脫羧生成烯醇離子，烯醇離子在金屬離子和O2的存在下轉(zhuǎn)變?yōu)殡p乙酰。Liu等［7］對Cu2+、Fe2+和Fe3+對雙乙酰生產(chǎn)的影響進行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，30 mmol/L Fe3+顯著提高了轉(zhuǎn)化率，在加入Fe3+4 h后，雙乙酰達到最大產(chǎn)量為8．2 g/L，得率達到87%(以 1 mol葡萄糖計)。2017 年，Hao等［18］在最終發(fā)酵工程菌株培養(yǎng)12 h后添加20 mmol/L Fe3+，α-乙酰乳酸和雙乙酰的產(chǎn)量增加1倍，在最適條件下分批發(fā)酵，雙乙酰產(chǎn)量達到8．69 g/L。值得注意的是，雖然金屬離子的添加促進NOD反應(yīng)的發(fā)生，但在發(fā)酵過程中，還要考慮到金屬離子對細胞生長、丙酮酸積累和雙乙酰生產(chǎn)途徑中關(guān)鍵酶的影響。

圖2 NOD的可能分子機制［7］Fig.2 The proposed mechanism for NOD

2.2 阻斷雙乙酰還原途徑

乙偶姻與2，3-丁二醇是雙乙酰生產(chǎn)過程中的主要副產(chǎn)物。乙偶姻可由α-乙酰乳酸在α-乙酰乳酸脫羧酶的作用下經(jīng)脫羧反應(yīng)生成，也可由雙乙酰在雙乙酰還原酶的作用下經(jīng)還原反應(yīng)生成。乙偶姻進一步在乙偶姻還原酶(又名2，3-丁二醇脫氫酶)的作用下可被還原為2，3-丁二醇。值得注意的是，通常雙乙酰還原酶和乙偶姻還原酶由同一基因編碼，因此，失活菌株中的α-乙酰乳酸脫羧酶和雙乙酰/乙偶姻還原酶是降低乙偶姻/2，3-丁二醇產(chǎn)量、提高雙乙酰產(chǎn)量的有效方法。

Aymes等［43］將菌株 L．lactis subsp．lactis biovar diacetylactis CNRZ483 用 N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍進行隨機突變，選出α-乙酰乳酸脫羧酶失活的突變菌株483MI，其雙乙酰產(chǎn)量顯著提高。Gasson等［11］失活 α-乙酰乳酸脫羧酶的編碼基因 aldB，α-乙酰乳酸和雙乙酰的產(chǎn)量分別由0和0．02 mmol/L提高到 0．52 和 0．32 mmol/L。Zhao 等［4］用 UV 線誘變Enterobacter aerogenes 10293，獲得 α-乙酰乳酸脫羧酶、乳酸脫氫酶和雙乙酰還原酶均高度弱化的突變菌株UV-3，其乙偶姻產(chǎn)量顯著降低。Gao等［5］敲除雙乙酰還原酶的編碼基因，限制雙乙酰的下游途徑，結(jié)果乙偶姻和2，3-丁二醇的產(chǎn)量顯著下降，且雙乙酰產(chǎn)量提高了30%。2015年，Zhang等［6］將2，3-丁二醇高產(chǎn)菌株E．cloacae中的2個雙乙酰還原酶編碼基因(gdh和budC)失活，最終雙乙酰的產(chǎn)量是出發(fā)菌株的7倍。值得注意的是，某些菌株即使失活了α-乙酰乳酸脫羧酶和雙乙酰/乙偶姻還原酶，仍有乙偶姻和 2，3-丁二醇的產(chǎn)生［5-7］，可能原因是菌株中存在未被發(fā)現(xiàn)的乙偶姻還原酶或α-乙酰乳酸脫羧酶。最近，Hao等［18］利用 2，3-丁二醇脫氫酶BDH(即雙乙酰還原酶)失活的突變株Bacillus sp．DL01，敲除了 α-乙酰乳酸脫羧酶的編碼基因alsD，有效去除乙偶姻的積累，雙乙酰的產(chǎn)量從0．24 g/L 提升到 1．53 g/L。

2.3 阻斷雙乙酰競爭途徑

在雙乙酰發(fā)酵過程中，從丙酮酸出發(fā)的旁路副產(chǎn)物主要有甲酸、乙酸、乳酸和乙醇，副產(chǎn)物的產(chǎn)生造成碳源的浪費。通過阻斷這些途徑，可以提高雙乙酰的產(chǎn)量和得率。Boumerdassi等［44］篩選出乳酸脫氫酶活性顯著降低的突變株L．lactis subsp．lactis biovar diacetylactis CNRZ 483，以葡萄糖為底物發(fā)酵檢測到雙乙酰的生成，且乳酸濃度由45．7 mmol/L降至2．6 mmol/L。Gasson 等［11］將 L．lactis中的乳酸脫氫酶失活使代謝通量發(fā)生了顯著的改變，乳酸產(chǎn)量由53 mmol/L降至2．2 mmol/L，乙偶姻濃度由4 mmol/L升至17 mmol/L，說明流向α-乙酰乳酸的代謝通量得以提高。Nadal等［36］失活乳酸脫氫酶基因ldh，以葡萄糖為底物時，雙乙酰/乙偶姻產(chǎn)量提高了84 倍。Liu 等［7］將 L．lactis subsp．cremoris MG1363 的乳酸和乙酸生成途徑以及雙乙酰的下游途徑失活，在好氧條件下，無乳酸積累，雙乙酰得率達到65%(以1 mol葡萄糖計)。

α-乙酰乳酸參與某些氨基酸的合成，如纈氨酸和亮氨酸等(圖1)。過表達乙酰醇酸還原異構(gòu)酶可抑制 α-乙酰乳酸的生成［45-46］。2014 年，Gao 等［5］敲除α-乙酰乳酸的旁路乙酰醇酸還原異構(gòu)酶編碼基因ilv5，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雙乙酰產(chǎn)量比其上一步工程菌株提高了28%，α-乳酸的積累量提高了37%。但值得注意的是，即使供給足量的氨基酸，敲除ilv5的菌株的比生長速率仍然比出發(fā)菌低20%。

2.4 調(diào)節(jié)輔因子NADH/NAD+的比例

雙乙酰生產(chǎn)菌株的構(gòu)建過程中，副產(chǎn)物乙偶姻、2，3-丁二醇、乳酸和乙酸等途徑的阻斷會引起胞內(nèi)的NADH/NAD+比例的大幅提高，造成NAD+再生困難，胞內(nèi)還原力不平衡，從而影響細胞的生長和代謝。利用各種代謝或輔因子工程手段，調(diào)節(jié)NADH/NAD+比例，平衡胞內(nèi)還原力，可使雙乙酰高產(chǎn)菌維持正常的生長和代謝水平。

增大NADH氧化酶酶活和呼吸作用的強度是平衡還原力的主要方法。NADH氧化酶編碼基因的過表達，使 NADH氧化酶的表達量提高，胞內(nèi)NADH/NAD+的比例下降，依賴于NADH的副反應(yīng)，如乳酸的代謝通量下降。呼吸作用的加強不僅可以平衡還原力，還可增加生物量。Lopez等［15］將Streptococcus mutans的NADH氧化酶編碼基因nox-2整合到L．lactis上，使得NADH氧化酶的表達量為出發(fā)菌株的150倍，明顯降低了好氧條件下的NADH/NAD+的比例，最后成功地將胞內(nèi)丙酮酸幾乎全部轉(zhuǎn)化為乙偶姻或雙乙酰。Hugenholtz等［47］在α-乙酰乳酸脫羧酶失活的 L．lactis中過表達NADH氧化酶，結(jié)果發(fā)現(xiàn)80%的丙酮酸重新被導(dǎo)流至α-乙酰乳酸。Guo等［48］為了平衡好氧條件下乳酸和雙乙酰的生產(chǎn)，建立了一個L．lactis水合NADH氧化酶基因的啟動子文庫。在該文庫中，篩選出NADH氧化酶活性高的工程菌進行發(fā)酵，結(jié)果顯示：隨著NADH/NAD+比例的降低，乳酸的產(chǎn)量由21．15 mmol/L 降至 9．94 mmol/L，而雙乙酰產(chǎn)量由 1．07mmol/L 升 至 4．16 mmol/L。Liu 等［7］在 L．lactis subsp．cremoris MG1363中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)供給 O2并表達NADH氧化酶時，α-乙酰乳酸、雙乙酰和乙偶姻的總得率為65%(以1 mol葡萄糖計);當(dāng)停止供給O2時，無雙乙酰積累;失活NADH氧化酶，雙乙酰得率降至5%。有研究表明，NADH氧化酶的活性嚴(yán)重受到雙乙酰的抑制［7，47］，這極大地限制了利用 NADH氧化酶提高雙乙酰產(chǎn)量的應(yīng)用?？紤]到這一點，Liu等［7］利用提高細胞色素氧化酶酶活的方法來調(diào)節(jié)NADH/NAD+的比例，有效地將α-乙酰乳酸、雙乙酰和乙偶姻的總得率提高至90%(以1 mol葡萄糖計)。

2.5 發(fā)酵條件的優(yōu)化

菌株的發(fā)酵條件如培養(yǎng)基、溫度、pH和通氧量等對發(fā)酵高產(chǎn)雙乙酰至關(guān)重要。Gupta等［12］對E．cloacae生產(chǎn)雙乙酰和乙偶姻進行發(fā)酵條件優(yōu)化，主要考察不同質(zhì)量濃度(10、15、20和50 g/L)的不同糖類(蔗糖、糖漿和葡萄糖)、接種量(體積分?jǐn)?shù)0．2%、0．5%、1．0%、2．0%和 5．0%)、培養(yǎng)溫度(20、25、30、35 和 40 ℃)及 pH(5、6、7、8 和 9)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在含20 g/L的蔗糖、pH為7的培養(yǎng)基中，接種量1%，28℃誘導(dǎo)，培養(yǎng)48 h后，雙乙酰和乙偶姻的產(chǎn)量最高。2003年，Jyoti等［3］研究 Lactobacillus rhamnosus在不同碳源培養(yǎng)基中生產(chǎn)雙乙酰的情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：以葡萄糖和檸檬酸同時為碳源的復(fù)合培養(yǎng)基中，其菌株生長和雙乙酰得率均高于單獨以二者之一為唯一碳源時的結(jié)果。2009年，Zhao等［4］利用中心復(fù)合設(shè)計-響應(yīng)面分析對培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，得到了最佳的培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖100、蛋白胨5、酵母抽提物 5、(NH4)2SO40．1、檸檬酸 1、MnSO42和MgSO42。一些添加物也能使雙乙酰的產(chǎn)量得到提高。Chuang等［8］對細菌和酵母的雙乙酰合成途徑進行研究，發(fā)現(xiàn)在Saccharomyces cerevisiae 299中，纈氨酸和亞砷酸鹽會抑制雙乙酰的合成，但泛酸會促進雙乙酰的合成。Monnet等［16］在好氧條件下，添加過氧化氫酶、血紅蛋白和酵母抽提物，使原來不能積累 α-乙酰乳酸的 L．lactis subsp．lactis biovar diacetylactis CNRZ 483突變株，大量積累了α-乙酰乳酸。Gao 等［5］在培養(yǎng)基中添加 0．08 mg/L VB1和2 mg/L煙酸，有效抑制了乙醇的生成，并使丙酮酸積累量增加，雙乙酰的產(chǎn)量達到4．7 g/L，比對照提高了約4倍。

很多研究表明，溶氧水平對雙乙酰的產(chǎn)量有很大的影響，一方面原因是O2為NOD反應(yīng)的電子供體，另一方面是因為溶氧水平會影響菌體的呼吸作用以及胞內(nèi)NADH氧化酶的酶活，從而影響菌體生長以及還原力的平衡。1993年，Bassit等［49］研究了初始氧濃度(0、21%、50%和 100%)對 L．lactis subsp．lactis biovar diacetylactis生產(chǎn)雙乙酰的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：隨著溶氧水平的提高，雙乙酰的濃度從0．01 mmol/L逐漸提高到18 mmol/L，且酶活數(shù)據(jù)顯示，高溶氧水平下的α-乙酰乳酸合成酶和NADH氧化酶的酶活也相對較高。1997年，Lopez de Felipe等［50］對L．lactis在好氧條件下以葡萄糖為底物時，不同溶氧水平和pH下NADH氧化酶的活性變化進行研究，發(fā)現(xiàn)高溶氧水平和偏酸條件有利于雙乙酰的積累。

雙乙酰的生產(chǎn)與細胞生長密切相關(guān)，通過優(yōu)化培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件有助于雙乙酰生產(chǎn)能力的提高，目前發(fā)現(xiàn)，較高的氧飽和度和較低的pH對雙乙酰的生產(chǎn)有利。此外，雙乙酰對細胞中某些酶酶活的影響和細胞生長的影響值得研究者的關(guān)注。

3 展望

近幾年，生物法制備雙乙酰的研究取得了較大的突破，但是雙乙酰的產(chǎn)量仍然較低。為了進一步滿足雙乙酰生產(chǎn)的安全性和環(huán)保性，克服雙乙酰生產(chǎn)的若干瓶頸，筆者認為應(yīng)該繼續(xù)利用微生物發(fā)酵法進行雙乙酰的生產(chǎn)。今后的研究過程可以在以下幾個方面展開：1)菌種的選擇。理性選擇潛在高產(chǎn)菌株，如選擇遺傳背景清晰、公認安全的高產(chǎn)乙偶姻的菌株作為宿主菌，進行代謝工程和合成生物學(xué)改造，得到高產(chǎn)雙乙酰的菌株。2)雙乙酰的耐受性。雙乙酰不僅影響菌體內(nèi)部分酶的酶活，還會對菌體生長有一定的毒性。通過物理、化學(xué)方法或者進化工程手段篩選耐受性較強的突變株。3)代謝途徑相關(guān)基因的表達調(diào)控。利用啟動子文庫等方式調(diào)控影響菌體生長的基因，如氨基酸合成支路的乙酰醇酸還原異構(gòu)酶的表達基因，平衡菌株生長與雙乙酰生產(chǎn)。4)兩階段生產(chǎn)。由于NOD途徑的最優(yōu)條件可能與細胞生長和重要前體物丙酮酸以及α-乙酰乳酸的積累相沖突，同時考慮到雙乙酰對于細胞生長和有關(guān)途徑酶的不利影響，可以將發(fā)酵過程分為兩個階段，第一階段大量積累α-乙酰乳酸，第二階段通過化學(xué)方法使α-乙酰乳酸最大限度地轉(zhuǎn)化為雙乙酰。

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(責(zé)任編輯 荀志金)

Recent advances for microbial production of diacetyl

CUI Zhenzhen1，2，MAO Yufeng1，2，CHEN Cong1，2，YUAN Qianqian3，WANG Zhiwen1，2，CHEN Tao1，2
(1．Key Laboratory of Systems Bioengineering of the Ministry of Education，School of Chemical Engineering and Technology，Tianjin University，Tianjin 300345，China;2．Collaborative Innovation Center of Chemical Science and Engineering，Tianjin 300345，China;3．Key Laboratory of Systems Microbial Biotechnology，Tianjin Institute of Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308，China)

With the knowledge of the biosynthetic pathway of diacetyl production，many novel strategies arise for the production of diacetyl．Most strategies focus on metabolic engineering of diacetyl production and optimization of its metabolic pathways．The strains and pathway of microbial production for diacetyl production are summarized，and the metabolic engineering strategies to improve diacetyl production are reviewed．Future directions in the research of diacetyl production are presented in light of current knowledge of biosynthesis of this molecule．

diacetyl;microbial production;metabolic engineering

TQ224．24

A

1672-3678(2017)05-0057-08

10．3969/j．issn．1672-3678．2017．05．007