植物底盤：天然產(chǎn)物合成生物學(xué)研究的新熱點(diǎn)

邵 潔，李建華，王凱博，3，王 勇

(1．中國(guó)科學(xué)院 上海生命科學(xué)研究院 植物生理生態(tài)研究所 中國(guó)科學(xué)院分子植物科學(xué)

卓越創(chuàng)新中心中國(guó)科學(xué)院合成生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032;2．中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049;3．河南大學(xué) 植物逆境生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 開封 475000)

植物底盤：天然產(chǎn)物合成生物學(xué)研究的新熱點(diǎn)

邵 潔1，2，李建華1，王凱博1，3，王 勇1

(1．中國(guó)科學(xué)院 上海生命科學(xué)研究院 植物生理生態(tài)研究所 中國(guó)科學(xué)院分子植物科學(xué)

卓越創(chuàng)新中心中國(guó)科學(xué)院合成生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032;2．中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049;3．河南大學(xué) 植物逆境生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 開封 475000)

天然產(chǎn)物廣泛地存在于植物體內(nèi)，是藥物、食品添加劑和新型生物燃料等開發(fā)的主要來源，具有重要的商業(yè)價(jià)值，該類化合物也一直是合成生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。隨著研究的深入，近年來以植物為底盤的天然產(chǎn)物研究日益興起。本文中，筆者綜述了近年來以植物為底盤的天然產(chǎn)物合成生物學(xué)研究的進(jìn)展，包括該類代謝物代謝途徑的解析、以植物為底盤的遺傳操作技術(shù)和方法等，為相關(guān)研究者提供參考。

天然產(chǎn)物;合成生物學(xué);植物底盤

天然產(chǎn)物由自然界長(zhǎng)期進(jìn)化而來，是生物活性物質(zhì)和藥物發(fā)現(xiàn)的重要源泉。植物來源的天然產(chǎn)物具有抗腫瘤、抗過敏及抗菌等多種生物活性［1］，在食品、日化和醫(yī)療等領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注，展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力和廣闊的市場(chǎng)前景。但是該類化合物成分復(fù)雜，且在自然界的含量往往極低，傳統(tǒng)的研究和開發(fā)方法已不能滿足人們的需求［2］。近年來，合成生物學(xué)為天然產(chǎn)物的開發(fā)提供了新的思路，基于該思想建立的微生物細(xì)胞工廠已實(shí)現(xiàn)了多種天然化合物的高效合成，有效提高了天然產(chǎn)物總體的生產(chǎn)水平［3］。

隨著科研工作者的努力，合成生物學(xué)研究的對(duì)象已從最初的單細(xì)胞原核微生物體系逐漸涉足到復(fù)雜的多細(xì)胞真核體系，其中以植物為底盤的合成生物學(xué)研究逐漸為人矚目［4］。與單細(xì)胞的微生物相比，植物富含各種內(nèi)膜系統(tǒng)和細(xì)胞器，復(fù)雜的空間特性，為不同代謝物的合成提供了所需的最適環(huán)境，也為合成生物學(xué)研究提供了絕佳的模式體系［5］。本文中，筆者將綜述近年來以植物為底盤的天然產(chǎn)物合成生物學(xué)研究的進(jìn)展，包括該類代謝物代謝途徑的解析、以植物為底盤的遺傳操作技術(shù)和方法等。

1 植物次生代謝物合成基因簇的發(fā)現(xiàn)

微生物產(chǎn)生的次生代謝物，如在放線菌和真菌中，其編碼基因往往成簇存在于基因組中。但近年來，隨著植物基因組學(xué)研究的深入，特別是一些模式植物基因組測(cè)序的完成，人們注意到植物次生代謝相關(guān)的基因也會(huì)成簇排列［6］。這一發(fā)現(xiàn)為植物次生代謝物合成途徑的解析及其合成生物學(xué)設(shè)計(jì)提供了便利。目前已經(jīng)在植物中發(fā)現(xiàn)了一些負(fù)責(zé)天然化合物合成的基因簇［7］，例如番茄中的單萜α-蒎烯(α-pinene)、β-羅勒烯(β-ocimene)，水稻中的二萜類化合物稻殼酮A(momilactone A)及植物卡生(phytocassanes)，燕麥中的三萜類化合物燕麥根皂苷(avanacin)。Boutanaev等［8］對(duì) 17種不同模式植物來源的萜類化合物的多樣性進(jìn)行系統(tǒng)分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，萜類合成的兩類關(guān)鍵基因萜類合酶(TPS)的基因和細(xì)胞色素氧化酶(CYP)的基因通常也是成簇存在的。在對(duì)十字花科植物的牻牛兒基法呢基焦磷酸合酶(GFPPS)結(jié)構(gòu)與功能的研究過程中，Wang等［9］也發(fā)現(xiàn)GFPPS的基因通常與TPS的基因串聯(lián)形成一個(gè)基因簇，這與先前在茄科植物單萜和倍半萜合成途徑中發(fā)現(xiàn)共同存在的異戊烯基轉(zhuǎn)移酶(CPT)-TPS現(xiàn)象［10］很是類似。筆者所在課題組利用萜類代謝途徑改造的大腸桿菌底盤細(xì)胞，對(duì)其中來自擬南芥的基因簇的代謝產(chǎn)物進(jìn)行了研究，成功獲得了兩個(gè)結(jié)構(gòu)新穎的二倍半萜基本碳?xì)涔羌芑衔?(+)-thalianatriene 和 (-)-retigeranin B［11］，首次完成對(duì)植物來源的二倍半萜合成基因簇及其功能性代謝產(chǎn)物的研究。King等［12］通過對(duì)蓖麻基因組數(shù)據(jù)的分析發(fā)現(xiàn)，有8個(gè)細(xì)胞色素P450酶、2個(gè)乙醇脫氫酶、1個(gè)乙酰轉(zhuǎn)移酶和1個(gè)單萜合成酶位于同一個(gè)基因簇上。經(jīng)鑒定，其中3個(gè)細(xì)胞色素P450酶(CYP726A14、CYP726A17和 CYP726A18)能催化蓖麻烯生成5-羥基蓖麻烯或5-酮基蓖麻烯。隨著更多植物天然產(chǎn)物合成基因簇的發(fā)現(xiàn)，基于基因組測(cè)序的基因簇發(fā)掘已成為這些天然產(chǎn)物合成途徑解析的主要方法之一。

2 以植物為底盤的合成生物學(xué)研究

以微生物為底盤的天然產(chǎn)物合成生物學(xué)研究已經(jīng)取得了巨大的成功：青蒿酸在酵母中的異源合成是該領(lǐng)域的標(biāo)志性成果。2013年，Keasling實(shí)驗(yàn)室的Paddon等［13］以釀酒酵母為底盤，實(shí)現(xiàn)了青蒿酸的微生物合成，產(chǎn)量達(dá)到25 g/L。隨后賽諾菲公司收購(gòu)了該項(xiàng)專利并宣布將基于該成果啟動(dòng)大規(guī)模生產(chǎn)半合成青蒿素的產(chǎn)業(yè)化研究。但是這一合成生物學(xué)商業(yè)化應(yīng)用的里程碑事件的發(fā)展并不像預(yù)期那樣順利，2015年賽諾菲并未生產(chǎn)任何“半合成”青蒿素，該公司卻出售位于意大利的青蒿素加工廠。這主要是由于黃花蒿供過于求，植物來源的青蒿素每公斤銷售額不到250美元，低于賽諾菲“不盈利-不損失”標(biāo)準(zhǔn)下每公斤350～400美元的銷售價(jià)格。所以Keasling教授也認(rèn)為如果價(jià)格已經(jīng)足夠低，有大量產(chǎn)青蒿素的植物，就沒必要再利用發(fā)酵設(shè)備來生產(chǎn)青蒿酸［14］。這說明，與微生物底盤細(xì)胞相比，植物底盤仍有其天然優(yōu)勢(shì)，如植物僅以CO2和水為原料，經(jīng)光合作用就可以合成各類復(fù)雜的天然產(chǎn)物，而無需高耗能、高耗氧的發(fā)酵過程;植物底盤可以突破微生物底盤對(duì)細(xì)胞色素P450酶表達(dá)性差、對(duì)活性產(chǎn)物的耐受性差的局限性;同時(shí)，作為具有復(fù)雜分化的多細(xì)胞生物，植物底盤本身的復(fù)雜分區(qū)化、不同器官的精細(xì)化分工和協(xié)作也為實(shí)現(xiàn)復(fù)雜功能人工設(shè)計(jì)提供了可能。因此，以植物為底盤進(jìn)行天然產(chǎn)物的合成生物學(xué)研究(圖1)有其優(yōu)越性和必要性，并已取得了一些進(jìn)展。2011年Farhi等［15］將紫穗槐-4，11-二烯合酶(ADS)、細(xì)胞色素P450還原酶(CPR)、細(xì)胞色素 P450羥化酶 CYP71AV1(CYP71AV1)以及青蒿醛 Δ11(13)雙鍵還原酶(DBR2)4個(gè)基因構(gòu)建在pSAT載體上，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化技術(shù)首次實(shí)現(xiàn)了青蒿素在煙草中的異源合成。再進(jìn)一步通過過表達(dá)甲羥戊酸(MVA)途徑限速酶3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMGR)，運(yùn)用信號(hào)肽ADS定位到線粒體上的方式，使煙草中青蒿素含量達(dá)到 6．8 μg/g(以1 g煙草干質(zhì)量計(jì))。2016年Lv等［16］使用RNA干擾技術(shù)在黃花蒿中導(dǎo)入cDNA反義鏈，分別下調(diào)β-石竹烯合成酶(CPS)、β-法呢基焦磷酸合成酶(BFS)和角鯊烯合成酶(SQS)等萜類生物合成途徑中影響青蒿素生物合成競(jìng)爭(zhēng)支路上的關(guān)鍵基因，結(jié)果和對(duì)照組相比，所有轉(zhuǎn)基因黃花蒿中，青蒿素的含量均明顯上升，達(dá)70%左右。接下來，他們通過基因共表達(dá)分析策略和轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序分析策略，先后篩選出了能正調(diào)控青蒿素生物合成的轉(zhuǎn)錄因子 AaMYC2［17］、AaNAC1［18］和 AaHD1［19］，并在此基礎(chǔ)上培育出可在廢棄的鹽堿地生長(zhǎng)，具有抗除草劑性能，適合規(guī)?；?、基地化種植，青蒿素含量達(dá)到1．5%～2%的新一代黃花蒿產(chǎn)品。

葉綠體是植物細(xì)胞和真核藻類細(xì)胞所特有的進(jìn)行光合作用的場(chǎng)所，其中存在大量的代謝途徑，通常被形象地稱為“植物細(xì)胞生物合成中心”。葉綠體基因組具有與原核微生物類似的表達(dá)多順反子的潛力。Fuentes等［20］將青蒿酸的完整合成途徑的基因整合到煙草葉綠體的基因組中，同時(shí)引入一些使系統(tǒng)更加穩(wěn)定的基因，最終獲得了120 mg青蒿酸(以1 kg生物量計(jì))。

天然產(chǎn)物在植物細(xì)胞內(nèi)不同的細(xì)胞器或組織中合成，催化反應(yīng)合成的酶定位于不同的細(xì)胞器中可以降低中間體對(duì)細(xì)胞的毒害作用。通過細(xì)胞區(qū)分化設(shè)計(jì)可以有效提高產(chǎn)物的產(chǎn)量。Malhotra等［21］在煙草細(xì)胞中進(jìn)行了青蒿素合成途徑分區(qū)化設(shè)計(jì)：通過信號(hào)肽cox4融合將ADS定位在線粒體中，通過質(zhì)體導(dǎo)肽將CYP71AV1、CPR、DBR2定位在葉綠體內(nèi)，同時(shí)在葉綠體中引入酵母的整條MVA途徑來增加萜類前體供應(yīng)，最終獲得了0．8 mg/g(以細(xì)胞干質(zhì)量計(jì))的青蒿素。煙草因其生物安全性和遺傳轉(zhuǎn)化易操作性，已經(jīng)成為植物合成生物學(xué)研究的常用底盤。上述青蒿素的植物異源合成研究均是在煙草中開展的。

圖1 植物底盤的天然產(chǎn)物合成生物學(xué)研究思路Fig.1 Research on natural product synthetic biology of plant chassis

其他植物甚至藻類也具有成為植物底盤的潛力。小立碗蘚是一種低等苔蘚植物，它的基因組僅有500 Mb，而且全基因組信息已經(jīng)公布。清晰的遺傳背景也方便對(duì)其進(jìn)行基因組編輯和外源基因?qū)?。Anterola等［22］在小立碗蘚中表達(dá)紅豆杉來源的紫杉二烯合酶，獲得了紫杉二烯5 μg/g(以1 g干細(xì)胞質(zhì)量計(jì))。類似的工作在擬南芥［23］、番茄［24］和人參毛狀根［25］等中也有報(bào)道。Tohge等［26］在番茄中引入金魚草來源的轉(zhuǎn)錄因子Delila和Rosea1后，檢測(cè)到花青素和苯丙類黃酮衍生物的含量都有所增加。隨后該團(tuán)隊(duì)通過在番茄中引入擬南芥來源的黃酮特異性調(diào)控因子AtMYB12后，檢測(cè)到黃酮類化合物和對(duì)羥基肉桂酸乙酯的含量達(dá)到了果實(shí)干質(zhì)量的10%。此外，AtMYB12的表達(dá)不僅可以促進(jìn)黃酮類化合物的合成，還能增加初級(jí)代謝源碳、能量和還原力的供應(yīng)，這可能是AtMYB12的表達(dá)會(huì)刺激莽草酸和苯丙氨酸途徑，為次生代謝提供更多的芳香族氨基酸。通過表達(dá)AtMYB12并增加系統(tǒng)的前體、能量和還原力可用于在番茄中生產(chǎn)高含量的苯丙類化合物，這也為生產(chǎn)其他有價(jià)值的天然化合物提供了新的思路［27-28］。

3 應(yīng)用于植物底盤的使能技術(shù)

表1 應(yīng)用于植物底盤的合成生物學(xué)技術(shù)Table 1 The synthetic biology technology applied in plant chassis

與微生物中的情況類似，各類針對(duì)植物底盤合成生物學(xué)的使能技術(shù)研究方興未艾(表1)。Engler等［29-30］報(bào)道了基于II S型限制性內(nèi)切酶的Golden Gate克隆方法，II S型限制性內(nèi)切酶可以特異性地識(shí)別DNA上的靶點(diǎn)，并在靶點(diǎn)下游非特異性地切割DNA序列，利用II S型限制內(nèi)切酶的這一特性可以靈活設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，即通過引物設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)前一個(gè)片段的C端與后一個(gè)片段的N端的II S型限制內(nèi)切酶位點(diǎn)尾巴是相同的，經(jīng)過II S型限制內(nèi)切酶酶切之后就可以用連接酶把多個(gè)片段按照既定的順序?qū)崿F(xiàn)無縫拼接。Shih等［31］報(bào)道了基于酵母同源重組的jStack方法，該方法將紫色桿菌素的整個(gè)合成途徑中包括的5個(gè)基因裝配到pYB載體上，已經(jīng)在煙草葉片中表達(dá)成功，可以檢測(cè)到紫色桿菌素和一些中間體。同時(shí)，該團(tuán)隊(duì)還嘗試將此方法應(yīng)用于植物基因簇的研究并成功裝配了10個(gè)10．6～20．5 kb的基因簇相關(guān)片段。

除了一些DNA拼接方法的改進(jìn)，基因組編輯方法也有很大進(jìn)步。2016年，高彩霞研究員團(tuán)隊(duì)的Zhang等［32］在小麥中建立了基于CRISPR/Cas9瞬時(shí)表達(dá)的基因組編輯系統(tǒng)。該研究通過CRISPR/Cas9 DNA或RNA瞬時(shí)表達(dá)，在六倍體小麥和四倍體小麥中進(jìn)行了基因的定點(diǎn)敲除，并在T0代得到了不含外源基因的小麥純合敲除突變體，突變效率為1．0%～9．5%，且無脫靶效應(yīng)。另外此系統(tǒng)的瞬時(shí)表達(dá)CRISPR/Cas9 RNA的方法中不涉及外源DNA，避免了植物中基因組編輯導(dǎo)致的生物安全問題。但是，CRISPR/Cas9 DNA進(jìn)入到細(xì)胞以后仍然有可能會(huì)降解產(chǎn)生小的DNA片段整合到基因組中，而CRISPR/Cas9 RNA瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)操作較為嚴(yán)格，但生產(chǎn)成本較高。為了克服這一缺陷，該研究團(tuán)隊(duì)于2017年1月又報(bào)道了在小麥中的DNA-free基因組編輯方法研究新進(jìn)展［33］，通過將CRISPR/Cas9蛋白和gRNA在體外組裝成核糖核蛋白復(fù)合體(RNP)，再利用基因槍法將CRISPR/Cas9 RNP轉(zhuǎn)入小麥細(xì)胞中，研究人員在2個(gè)六倍體小麥品種中分別對(duì)2個(gè)不同基因進(jìn)行定點(diǎn)編輯，成功地在小麥中建立了全程無外源DNA的基因組編輯系統(tǒng)。相比于CRISPR/Cas9的DNA或RNA瞬時(shí)表達(dá)體系，CRISPR/Cas9的RNP可以明顯降低脫靶效應(yīng)(DNA-free)。這種DNA-free的基因組編輯方法具有精準(zhǔn)度和特異性高、操作簡(jiǎn)單、成本低廉的優(yōu)勢(shì)，并且成功避免了外源DNA片段整合到基因組中的潛在風(fēng)險(xiǎn)，使得在植物底盤中高效地進(jìn)行基因編輯成為可能。

植物中表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)化也有很大進(jìn)展，Sainsbury等［34］建立了基于CPMV-HT的高效瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，可在植物侵染后5 d內(nèi)獲得高水平的重組蛋白;而Kanagarajan等［35］利用這套系統(tǒng)成功地在本氏煙草中純化到了有活性的青蒿素生物合成途徑中的ADS蛋白。

與微生物細(xì)胞相比，植物細(xì)胞中存在復(fù)雜的膜結(jié)構(gòu)和細(xì)胞器，代謝途徑中的酶經(jīng)常分布在不同的內(nèi)膜系統(tǒng)中，基于這些因素，在植物底盤中進(jìn)行代謝途徑設(shè)計(jì)的時(shí)候應(yīng)該進(jìn)行定位化設(shè)計(jì)。2016年，德國(guó)馬普所的Fuentes等［20］開發(fā)了一種新的合成生物學(xué)方法，即COSTREL(combinatorial supertransformation of transplastomic recipient lines)，他們以此方法將青蒿酸的完整合成途徑基因整合定位到煙草葉綠體的基因組中，篩選出最優(yōu)的轉(zhuǎn)化煙草后，在細(xì)胞核DNA中再導(dǎo)入一系列可調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝的其他基因，最終從每千克生物量中獲得了120 mg青蒿酸。此研究不僅可以滿足大批量廉價(jià)生產(chǎn)抗瘧疾藥物的需要，而且所用的定位化設(shè)計(jì)也為在植物底盤中生產(chǎn)有價(jià)值的天然產(chǎn)物提供了思路。

4 生物合成途徑的解析仍是難點(diǎn)和瓶頸

生物合成途徑的解析是合成生物學(xué)工程化設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)。迄今為止，植物來源的天然產(chǎn)物得到完整解析的還很少。雖然植物的基因組龐大，但目前僅有部分植物物種的基因組公布(表2)。因此，如何高效地從這些基因組資源中挖掘鑒定到參與天然產(chǎn)物合成的基因，特別是參與后修飾的基因(如細(xì)胞色素P450酶基因、糖基轉(zhuǎn)移酶基因和氧化還原酶基因)仍是現(xiàn)階段的工作難點(diǎn)。

表2 已完成基因組測(cè)序的植物信息匯總Table 2 Summary of plants that have been sequenced

目前，鑒定這些未知基因的主要方法包括候選基因的異源表達(dá)和體外酶促反應(yīng)，而由于植物底盤在天然產(chǎn)物合成方式和蛋白翻譯后修飾上與候選基因來源的植物具有更多的相似性，因此如何鑒定出上述的這些關(guān)鍵酶，會(huì)直接影響植物底盤的進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用。

長(zhǎng)期以來，天然產(chǎn)物的合成途徑主要根據(jù)已知的化學(xué)結(jié)構(gòu)、化學(xué)反應(yīng)及合成機(jī)制等進(jìn)行推測(cè)。這些推測(cè)的合理性與準(zhǔn)確性會(huì)直接影響未知功能基因的發(fā)現(xiàn)?，F(xiàn)在，同位素示蹤法［39］已經(jīng)用于跟蹤植物體內(nèi)代謝物，以此可以進(jìn)一步驗(yàn)證推測(cè)的途徑是否準(zhǔn)確。次丹參酮二烯作為丹參酮合成的中間體，其后修飾過程及下游途徑的解析在先前研究得較少。Guo等［40］將丹參類貝殼杉烯合酶(SmKSL)、丹參柯巴基焦磷酸合酶(SmCPS)和牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶(GGPPS)基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌中進(jìn)行共表達(dá)，在培養(yǎng)過程中通過添加13C標(biāo)記的葡萄糖，獲得了被標(biāo)記的次丹參酮二烯。在后續(xù)培養(yǎng)丹參毛狀根時(shí)，加入13C標(biāo)記的次丹參酮二烯，可以檢測(cè)到相應(yīng)標(biāo)記的鐵銹醇和隱丹參酮，由此證明了兩個(gè)關(guān)鍵中間體的存在，為進(jìn)一步的解析奠定基礎(chǔ)。

高通量測(cè)序的快速發(fā)展，使獲得一個(gè)物種的基因信息成為可能。最近黃三文團(tuán)隊(duì)通過基因組學(xué)的研究，在黃瓜苦味素的形成機(jī)制上取得了突破，Shang等［41］研究發(fā)現(xiàn)負(fù)責(zé)催化合成葫蘆素(Cucurbitacin C)的?；D(zhuǎn)移酶(ACT)、氧化鯊烯環(huán)化酶(OSC)和 3個(gè) P450酶基因 CYP81Q58、CYP89A140、CYP97D19成簇于6號(hào)染色體中，而負(fù)責(zé)進(jìn)一步羥基化修飾的 CYP712D8、CYP88L2和CYP88L3成簇在3號(hào)染色體，CYP87D2單獨(dú)存在于1號(hào)染色體中。同時(shí)他們還發(fā)現(xiàn)這9個(gè)基因由兩個(gè)“開關(guān)”基因Bl和Bt負(fù)責(zé)控制黃瓜不同組織的苦味，Bl控制葉片苦味，而Bt控制果實(shí)苦味。

但是限于植物基因組和性狀的復(fù)雜性以及高昂的測(cè)序成本，現(xiàn)階段完全獲得一個(gè)物種的基因組信息還較為困難。針對(duì)特定代謝產(chǎn)物途徑的解析，物種的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)往往更有幫助，且也更容易獲得。從數(shù)萬個(gè)基因中篩選可能參與特定天然產(chǎn)物合成的候選基因具有很大的挑戰(zhàn)性。通過在植物底盤中進(jìn)行誘導(dǎo)信號(hào)刺激使之產(chǎn)生代謝物成分或種類差異，或挖掘具有代謝物差異的植物突變株，對(duì)差異樣本進(jìn)行差異轉(zhuǎn)錄分析，從而獲得候選基因序列，并進(jìn)一步進(jìn)行功能分析，從而鑒定出特定基因成為可能。如諾斯卡品(Noscapine)是來源于罌粟，具有抗癌活性的生物堿。Winzer等［42］對(duì)含Noscapin的HN1和不含該生物堿的HM1、HT1 3個(gè)品種進(jìn)行轉(zhuǎn)錄分析，發(fā)現(xiàn)10個(gè)基因僅在HN1中表達(dá)，通過對(duì)這10個(gè)基因的功能驗(yàn)證解析出Noscapin的生物合成途徑。

代謝途徑中酶促反應(yīng)順序的難以確定以及真實(shí)代謝中間體的難以獲得也是天然產(chǎn)物合成途徑解析中的難題之一?，F(xiàn)在，可以通過植物表達(dá)載體共同瞬時(shí)表達(dá)，將候選基因分別構(gòu)建成植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中后進(jìn)行組合表達(dá)候選蛋白，以此策略通過分析最終代謝產(chǎn)物進(jìn)而來表征未知基因的功能。如鬼臼毒素是抗癌藥物依托泊苷的前體，其生物合成途徑?jīng)]有得到完全解析，Lau等［43］通過分析盾葉鬼臼葉片損傷之后轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)差異，得出29個(gè)候選基因，將這29個(gè)候選基因在煙草里組合共表達(dá)，鑒定出6個(gè)有功能的基因，其中包括2個(gè)甲基轉(zhuǎn)移酶、3個(gè)P450酶和1個(gè)雙加氧酶。再將鑒定的6個(gè)基因和之前明晰功能的4個(gè)基因在煙草里面共表達(dá)，成功地在煙草葉片中檢測(cè)到了依托泊苷的前體糖苷配基。

由于無法獲得準(zhǔn)確的代謝物中間體進(jìn)行體外的功能驗(yàn)證，因此在植物體內(nèi)建立功能驗(yàn)證方法顯得尤為重要。目前，植物體內(nèi)功能驗(yàn)證的主要思路是通過基因刪除或基因表達(dá)抑制全部或部分缺失酶的功能，然后檢測(cè)植物體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物含量的變化，以此來鑒定特定基因在原植物體內(nèi)的生物功能。目前應(yīng)用較為廣泛的是病毒誘導(dǎo)的基因沉默(virus induced gene silencing，VIGS)技術(shù)和 RNA 干擾(RNAi)技術(shù)。Salim等［44］在長(zhǎng)春花的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選到參與環(huán)烯醚萜類合成的候選基因，利用VIGS技術(shù)和代謝分析，鑒定到了 1個(gè)羥化酶CrDL7H，能夠參與裂環(huán)馬錢子苷的第三步到最后一步合成。Zhao等［45］在解析人參皂苷的合成途徑時(shí)，利用RNAi鑒定到的β-香樹素(β-amyrin)合成酶基因;當(dāng)該基因表達(dá)被抑制，β-香樹素含量下降，同時(shí)齊墩果烷型人參皂苷R0含量上升，表明其具有重要作用。Wang等［46］將西洋參中克隆到的1個(gè)原人參三醇合酶基因(CYP6H)進(jìn)行了過表達(dá)和RNAi研究，通過RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)：在過表達(dá)的西洋參毛狀根中該基因表達(dá)量顯著增加，毛狀根中原人參二醇型皂苷含量下降，原人參三醇型皂苷含量上升，結(jié)合RNAi實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明在西洋參中CYP6H能對(duì)原人參二醇的6位進(jìn)行羥基化，將原人參二醇轉(zhuǎn)化為原人參三醇。

5 結(jié)論與展望

植物中含有的天然產(chǎn)物類型多樣，其合成途徑也十分復(fù)雜。以植物為底盤進(jìn)行復(fù)雜的工程化設(shè)計(jì)，是合成生物學(xué)研究由簡(jiǎn)單到復(fù)雜、由單細(xì)胞到多細(xì)胞的必然，這不僅有助于我們了解復(fù)雜生命體再造的工程化原理，也有望變革傳統(tǒng)的種植業(yè)，實(shí)現(xiàn)醫(yī)藥、食品等傳統(tǒng)行業(yè)的革命性升級(jí)。

但這一領(lǐng)域仍有許多瓶頸亟待突破：代謝途徑的解析仍是最大的瓶頸。盡管植物天然產(chǎn)物基因簇的發(fā)現(xiàn)為植物天然產(chǎn)物代謝途徑的設(shè)計(jì)提供了便利，但是這對(duì)于大量尚未闡明合成機(jī)制的天然產(chǎn)物來說僅是冰山一角。許多參與天然產(chǎn)物生物合成的基因僅部分成簇存在，負(fù)責(zé)結(jié)構(gòu)修飾的基因仍有可能存在于染色體的其他位置［47］。植物天然產(chǎn)物積累方式具有時(shí)空特異性，表明合成基因的表達(dá)受到植物體內(nèi)或外部生長(zhǎng)環(huán)境的嚴(yán)格調(diào)控。這些現(xiàn)象使得植物源天然產(chǎn)物的途徑解析變得更加棘手。新一代的基因組學(xué)及多組學(xué)技術(shù)的結(jié)合是今后發(fā)展的重要方向。除此之外，開發(fā)新的植物底盤以應(yīng)對(duì)不同的需求也是今后一個(gè)值得關(guān)注的方向?；谥参锏妆P的遺傳操作技術(shù)和方法仍然不夠完善。可應(yīng)用于植物底盤的新一代基因組合成及基因組編輯的技術(shù)有待開發(fā)。植物是相對(duì)復(fù)雜的系統(tǒng)，代謝途徑高度區(qū)域化的特點(diǎn)使得在進(jìn)行底盤的復(fù)雜設(shè)計(jì)、定量描述和數(shù)學(xué)建模的時(shí)候面臨更為復(fù)雜的局面，這些也都待開發(fā)新的方法。

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(責(zé)任編輯 荀志金)

Plant chassis：new hotspots of natural product synthetic biology

SHAO Jie1，2，LI Jianhua1，WANG Kaibo1，3，WANG Yong1
(1．Key Laboratory of Synthetic Biology，CAS Center for Excellence in Molecular Plant Sciences，Institute of Plant Physiology and Ecology，Shanghai Institutes for Biological Sciences，Chinese Academy of Sciences，Shanghai 200032，China;2．University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China;3．Key Laboratory of Stress Plant Biology，Henan University，Kaifeng 475000，China)

Natural products are widely produced in plants and become major source of pharmaceuticals，aromatics and potential next-generation biofuels，with great commercial value．These compounds have also been the hotspots of synthetic biology．With deeper investigation，plant chassis have been increasingly applied to natural product biosynthesis research．In this paper，we reviewed the recent advances and achievements of synthetic biology based on plant chassis，including metabolic pathway elucidation，genetic manipulation technology and methods．

natural product;synthetic biology;plant chassis

Q819;TQ041

A

1672-3678(2017)05-0024-08

10．3969/j．issn．1672-3678．2017．05．003

2017-06-29

中國(guó)科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心部署項(xiàng)目(CEMPS2016004);國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)(2012CB721104);國(guó)家自然科學(xué)基金(31170101)

邵 潔(1993—)，女，江蘇南通人，博士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物合成生物學(xué);王 勇(聯(lián)系人)，研究員，E-mail：yongwang@sibs．a(chǎn)c．cn