miR-155表達變化對TGF-β1損傷足細胞蛋白podocin、CD2AP、synaptopo?din的影響①

凌霄雁 林 栩 鄭心彤 黃海庭 古賢君 梁 釗 覃 卿 杜秀日 唐志明 王 晨 韋美理

（右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院，百色533000）

足細胞已成為治療腎臟疾病的直接靶點，幾乎腎小球疾病都涉及足突（foot procfesses，F(xiàn)Ps）回縮消失、足細胞脫落或凋亡等足細胞損傷，最終引起蛋白尿、腎小球硬化［1］。而足細胞的正常結構和功能是由許多足細胞基因及其產(chǎn)物相互作用來維持的，例如裂孔隔膜相關蛋白nephrin、podocin、CD2AP和synaptopodin，它們在穩(wěn)定腎小球濾過系統(tǒng)中共同發(fā)揮作用。相關研究發(fā)現(xiàn)足細胞基因的突變、缺乏會引起或加劇足細胞損傷，但是至今其中的分子病理生理機制尚未完全闡明［2-3］。

miRNA已被證明對足細胞的穩(wěn)態(tài)至關重要，它是一種能靶向調(diào)節(jié)特定基因的非編碼小RNA，足細胞中miRNA的兩種必需酶Dicer或Drosha特異性損失則導致小鼠FPs消失、足細胞凋亡，出現(xiàn)明顯的蛋白尿并迅速發(fā)展為腎衰竭［4］。TGF-β1作為常用于誘導腎細胞損傷的因子，前期課題組已在TGF-β1誘導的足細胞損傷模型中發(fā)現(xiàn)miR-155表達增加，其表達水平可能與CD2AP、synapto?podin具有相關性，然而miR-155是否參與TGF-β1誘導的足細胞損傷，其中關系如何未明確，本實驗進一步深入研究miR-155與足細胞蛋白的調(diào)控關系，為miR-155在足細胞損傷中的作用提供理論和實驗依據(jù)［5］。

1 材料與方法

1.1 材料 腎小球足細胞株（MPC5，上海復旦大學細胞中心）；RPMI1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；胎牛血清（以色列BI-04-002-1A）；胰蛋白酶（美國Gibco公司）；miR-155-5p模擬物（miR-155 mimics）、miR-155-5p抑制劑（miR-155 inhibitor）、miR-155 NC陰性對照（廣州RiboBio公司）；脂質體2000轉染試劑（美國Invitrogen公司）；Opti-MEM無血清培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；重組人TGF-β1（美國PeproTech公司）；RT-PCR試劑盒（日本TaKaRa公司）；Mir-X miRNA FirstStrand Synthesis Kit（美國Clontech公司）；PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設計并合成（引物序列見表1）；Podocin、CD2AP、synaptopodin、GAPDH兔抗小鼠一抗和HRP標記的羊抗兔二抗（美國Proteintech公司）；磷酸酶抑制劑混合物、蛋白酶抑制劑混合物（北京康為世紀公司）；BCA蛋白定量試劑盒（中國碧云天公司）；蛋白質提取試劑盒、ECL發(fā)光顯影液（美國Millipore公司）；4%多聚甲醛（上海Absin公司），Alexa Fluor 594熒光素標記兔抗IgG（美國CST公司）；熒光定量PCR儀（瑞士Roche公司）；凝膠成像系統(tǒng)（上海天能公司）；免疫熒光顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 培養(yǎng)方法參考本課題組的前期研究［5］。在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞長滿至80%～90%時用胰蛋白酶消化傳代，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。用細胞免疫熒光染色鑒定足細胞是否分化成熟。

1.2.2 細胞轉染與藥物處理 以0.4×105～1×105個細胞種于6孔板中，待各組細胞融合至50%～70%后分別將Cy3 miR-155 NC、miR-155 mimics/mimics NC、miR-155 inihibitor/inhibitor NC及Lipo?fectamineTM2000加入Opti-MEM無血清培養(yǎng)基中混勻，靜置5 min，然后相對應混合，輕輕吹打混勻，室溫靜置20 min后加入6孔板細胞中，在培養(yǎng)箱孵育4～6 h。①用免疫熒光倒置顯微鏡隨機取3個高倍鏡視野，觀察Cy3 miR-155 NC紅色熒光的細胞數(shù)占總細胞數(shù)的百分比（轉染細胞率=熒光表達細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%），取其平均值作為轉染效率。②6孔板細胞中加入TGF-β1干預，終濃度為12 ng/ml，繼續(xù)培養(yǎng)進行后續(xù)實驗。

表1 熒光定量PCR引物序列Tab.1 Primers of RT-PCR

1.2.3 細胞分組 ①檢測正常組、TGF-β1組miR-155及蛋白CD2AP表達量；②分為miR-155 mimics+TGF-β1組、miR-155 mimics NC+TGF-β1組和miR-155 inhibitor+TGF-β1組、miR-155 inhibitor NC+TGF-β1組，在轉染（0 h、24 h、48 h、72 h）收集細胞檢測miR-155表達量；③分為正常組、TGF-β1組、TGF-β1+mimics組、TGF-β1+mimics NC組、TGF-β1+inhibitor組、TGF-β1+inhibitor NC組，給予TGF-β1干預48～72 h收集細胞進行檢測。

1.2.4 RT-PCR檢測足細胞miRNA-155、Podo?cin、CD2AP、Synaptopodin mRNA的表達 按1.2.3進行干預后，用TRIzol提取各實驗組細胞的總RNA，用紫外分光光度計進行總RNA的濃度和純度檢測，按照TaKaRa試劑盒說明書進行反轉錄和qRT-PCR，以GAPDH作為內(nèi)參，miRNA內(nèi)參為U6，反應條件：變性95℃30 s，反應95℃5 s，延伸60℃30 s，共40個循環(huán)，以2-ΔΔCt法計算相對表達量。

1.2.5 Western blot檢測足細胞Podocin、CD2AP、Synaptopodin蛋白的表達 各組細胞按1.2.3進行干預后用RIPA裂解液充分裂解細胞，提取各組細胞總蛋白，并用BCA法測定蛋白濃度。將蛋白質樣品與蛋白質上樣緩沖液混勻，100℃下反應3～5 min充分變性，冷卻至室溫，取30～50μg蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，300 mA恒流濕轉至PVDF膜，封閉液室溫封閉1 h，加一抗（Podocin 1∶400，CD2AP 1∶1 000，synaptopodin 1：1 000，GAPDH 1∶10 000），4℃孵育搖勻過夜。TBST洗膜3次，加入HRP標記的二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h。TBST洗膜3次，用化學發(fā)光液進行顯影，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.2.6 細胞免疫熒光法 用PBS洗細胞3次，4%多聚甲醛室溫下固定15 min，PBS洗3次，0.3%Tri?tonX-100室溫破膜10 min，PBS洗3次，山羊血清室溫封閉1 h，加入一抗（CD2AP，1∶100），4℃搖床過夜，PBS洗3次，加入熒光二抗（1∶500）室溫避光孵育1 h，滴加DAPI復染5 min后防熒光淬滅劑封片，免疫熒光顯微鏡下觀察、攝片，Image Pro Plus圖像分析軟件分析熒光強度。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)性分布的資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗；多組間比較用單因素方差分析（Oneway ANOVA），兩兩比較用LSD-t檢驗；轉染后miR-155表達隨時間變化的比較采用兩因素重復測量方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 足細胞分化鑒定 應用細胞免疫熒光染色檢測足細胞特異性蛋白CD2AP，熒光顯微鏡觀察顯示染色明顯，CD2AP分布于胞漿、細胞周邊、次級突起（圖1），此為分化足細胞CD2AP的分布的特征。用于實驗的細胞均為分化成熟的足細胞。

圖1 CD2AP在足細胞中的表達和分布（×200）Fig.1 Expression and distribution of CD2AP in podocytes（×200）

圖2 miR-155和CD2AP在TGF-β1誘導的足細胞中的表達Fig.2 Expressions of miR-155 and CD2APin podocyte in?duced by TGF-β1

2.2 TGF-β1誘導足細胞miR-155和蛋白CD2AP表達改變 用TGF-β1處理足細胞72 h后提取細胞，與正常組相比，TGF-β1處理可使足細胞中miR-155的表達顯著升高，CD2AP的蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05，圖2）。這與本課題組前期實驗TGF-β1誘導足細胞損傷結果一致［5］。

2.3 miR-155轉染足細胞后不同時間的miR-155表達變化 轉染成功指示劑Cy3 miR-155 NC轉染入足細胞，24 h后用倒置熒光顯微鏡觀察轉染熒光情況，紅色熒光明顯分布于細胞內(nèi)，轉染效率為90%左右（圖3A）。轉染miR-155 mimics或miR-155 in?hibitor 0 h、24 h、48 h、72 h，用RT-PCR檢測miR-155的表達。重復測量方差分析結果顯示：對照組NC+TGF-β1的0 h和24 h miR-155表達水平無明顯差異（P＞0.05）；mimics+TGF-β1組24 h和0 h相比，miR-155表達水平增加（P＜0.05）；inhibitor+TGF-β1組24 h和0 h相比，miR-155表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。轉染24 h、48 h、72 h：①不同的時間點miR-155表達差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；②不同組間miR-155表達差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；③不同轉染組和觀察時間之間存在交互作用（P＜0.05）。miR-155 mimics+TGF-β1組在轉染48 h、72 h后miR-155表達水平上升（P＜0.05），NC+TGF-β 1組轉染48 h、72 h后miR-155水平稍上調(diào)（P＜0.05），但mimics+TGF-β1組與mimics NC+TGF-β1組比，miR-155表達水平增加（P＜0.05），而miR-155 inhibitor+TGF-β1組在轉染miR-155 inhibitor 48、72 h后miR-155表達水平下降（P＜0.05），inhibitor NC+TGF-β1組miR-155的表達水平上調(diào)（P＜0.05），inhibitor+TGF-β1組與inhibitor NC+TGF-β1組比，miR-155表達水平降低（P＜0.05），miR-155 inhibitor可能抑制了TGF-β1誘導的足細胞miR-155水平的表達（圖3）。以上說明miR-155可能參與了TGF-β1對足細胞的作用。

圖3 miR-155在足細胞中的轉染效果Fig.3 Transfection effects of miR-155 in podocytes

2.4 轉染miR-155 mimics和miR-155 inhibitor后TGF-β1誘導的足細胞miR-155表達水平的變化 各組與正常組比，miR-155的表達量差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），與TGF-β1組相比，miR-155 mimics的轉染顯著上調(diào)miR-155的表達量（P＜0.05），而轉染miR-155 inhibitor后miR-155表達下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），TGF-β1+mimics NC、TGF-β 1+inhibitor NC組與TGF-β1處理組相比miR-155的表達水平無明顯變化（表2）。結果進一步表明，miR-155 mimics可上調(diào)TGF-β1誘導的足細胞miR-155表達，miR-155 inhibitor則抑制TGF-β1誘導的足細胞miR-155表達。

表2 miR-155 mimics/miR-155 inhibitor轉染后miR-155表達水平的變化（xˉ±s，n=3）Tab.2 Changes in miR-155 expression level after miR-155 mimics/miR-155 inhibitor transfection（xˉ±s，n=3）

表3 miR-155表達水平對TGF-β1誘導足細胞損傷中podocin/CD2AP/synaptopodin mRNA表達的影響（±s）Tab.3 Effects of miR-155 expression level on expression of podocin/CD2AP/synaptopodin mRNA in TGF-β1 induced podocyte injury（±s）

表3 miR-155表達水平對TGF-β1誘導足細胞損傷中podocin/CD2AP/synaptopodin mRNA表達的影響（±s）Tab.3 Effects of miR-155 expression level on expression of podocin/CD2AP/synaptopodin mRNA in TGF-β1 induced podocyte injury（±s）

Note：Compared with normal group，1）P＜0.05；compared with TGF-β1 group，2）P＜0.05.

Groups Normal TGF-β1 TGF-β1+miR-155 mimics TGF-β1+mimics NC TGF-β1+miR-155 inhibitor TGF-β1+inhibitor NC Podocin mRNA 1.000±0.000 0.817±0.0311）0.127±0.0041）2）0.847±0.040 1）1.133±0.049 2）0.838±0.017 1）CD2APmRNA 1.000±0.000 0.786±0.0531）0.597±0.0371）2）0.790±0.0591）1.003±0.0682）0.771±0.060 1）Synaptopodin mRNA 1.000±0.000 0.679±0.0391）0.443±0.0491）2）0.686±0.0321）0.943±0.0282）0.647±0.0391）

2.5 miR-155轉染后對TGF-β1損傷足細胞podo?cin、synaptopodin、CD2APmRNA表達的影響 與正常對照組相比，TGF-β1組足細胞中podocin、CD2AP、synaptopodin mRNA的表達下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），與TGF-β1組相比，TGF-β1+miR-155mimics組中podocin、CD2AP、synaptopodin mRNA的表達明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），而TGF-β1+miR-155 inhibitor組中podocin、CD2AP、syn?aptopodin mRNA的表達升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），TGF-β1+miR-mimics NC、TGF-β1+miR-155inhibitor NC組與TGF-β1處理組相比無統(tǒng)計學意義（表3）。結果表明，miR-155 mimics可促進TGF-β1誘導的足細胞podocin、CD2AP、synaptopodin表達下降，miR-155 inhibitor可逆轉TGF-β1對足細胞蛋白的損傷作用。

圖4 miR-155高表達對podocin、CD2AP、synaptopodin蛋白表達的影響Fig.4 Effects of miR-155 overexpression on expressions of podocin，CD2APand synaptopodin protein

圖5 miR-155低表達對podocin、CD2AP、synaptopodin蛋白表達的影響Fig.5 Effects of miR-155 low expression on expressions of podocin，CD2APand synaptopodin proteins

2.6 miR-155轉染后對TGF-β1損傷足細胞podo?cin、CD2AP、synaptopodin蛋白表達的影響 West?ern blot結果顯示，miR-155 mimics或miR-155 inhibi?tor轉染足細胞后，各組細胞之間podocin、CD2AP、synaptopodin蛋白水平的差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），miR-155 mimics高表達可促進podocin、syn?aptopodin、CD2AP蛋白表達下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖4），而miR-155 inhibitor則下調(diào)足細胞miR-155水平，進而抑制3種蛋白的水平降低（P＜0.05，圖5），TGF-β1+miR-155 mimics NC、TGF-β1+miR-155inhibitor NC組與TGF-β1組相比無統(tǒng)計學差異。結果進一步表明，miR-155的表達變化可影響TGF-β1誘導 的 足 細 胞podocin、synaptopodin、CD2AP蛋白損傷。

2.7 miR-155轉染后免疫熒光染色觀察蛋白CD2AP表達與分布 CD2AP蛋白的表達與Western blot、RT-PCR結果一致。分化成熟的正常足細胞，CD2AP蛋白主要分布胞漿、周邊、次級突起（例如白色實心箭頭）；TGF-β1處理的細胞，CD2AP蛋白熒光減弱，部分向核周分布（例如空心粗箭頭）；miR-155 mimics轉染足細胞后CD2AP蛋白熒光比TGF-β1組較弱，且主要向核周分布（例如空心粗箭頭）；miR-155 inhibitor抑制TGF-β1引起的CD2AP蛋白改變。見圖6。

圖6 各組細胞CD2AP蛋白的分布與表達（×400）Fig.6 Expression of CD2AP protein in each group（×400）

3 討論

隨著蛋白質組學、生物信息學、分子生物學技術的發(fā)展，越來越多的足細胞超微結構、基因和功能被鑒定，足細胞與足細胞之間相互交叉作用，又通過足突附著于腎小球基底膜（glomerular base?ment membrane,GBM）［6］。由足細胞頂膜、裂孔隔膜（slit diaphragm,SD）、FPs、GBM組成了具有濾過功能的沙漏結構，其中的基因蛋白發(fā)生變化可引起足細胞結構功能改變，最終導致腎小球濾過功能下降和腎臟疾病，因此被認為是足細胞損傷的標志蛋白［7-8］。SD蛋白CD2AP缺乏的小鼠中活性氧增多，進而促使足細胞凋亡，抑制SHIP2使活性氧下降也不能阻止CD2AP缺乏引起的足細胞凋亡，而CD2AP過表達可減少足細胞凋亡［2］。其他的SD蛋白nephrin、podocin，突觸蛋白synaptopodin的突變和缺少都會引起足細胞的損傷，這與課題組實驗結果相一致，在TGF-β1干預的足細胞中，CD2AP與podocin、synaptopodin表達均降低［9］。研究還發(fā)現(xiàn)，與免疫炎癥密切相關的miR-155對足細胞蛋白CD2AP、podocin、synaptopodin具有靶向作用，miR-155高表達可負性調(diào)節(jié)podocin、synapto?podin、CD2AP的表達，miR-155低表達可使podo?cin、synaptopodin、CD2AP表達上調(diào)。

越來越多證據(jù)表明，miRNA在腎臟發(fā)育和腎臟生理穩(wěn)態(tài)中起著重要的作用，很多腎臟疾病存在miRNA的失調(diào)［4］。近年來，miR-155在腎臟疾病中的作用不斷被發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病患者血液、尿液中miR-155的表達發(fā)生改變，miR-155還可能參與調(diào)節(jié)肥胖相關腎病腎臟組織和內(nèi)皮細胞、狼瘡腎炎系膜細胞的損傷［10-13］。但是，目前miR-155對足細胞損傷的調(diào)控尚不清楚。有文獻表明腎上皮細胞、內(nèi)皮細胞、基底膜、外基質和系膜細胞之間存在串擾，miRNA旁分泌和自分泌介導腎小球細胞，例如miR-143可能是足細胞和腎小球內(nèi)皮細胞損傷串擾的介質，miR-378a-3p可抑制基底膜中細胞外基質蛋白nephronectin（NPNT）的表達水平，引起足細胞podocin表達下降［14-16］。因此，miR-155是否參與調(diào)節(jié)足細胞的損傷，且串擾其他腎細胞的損傷，對腎臟疾病而言具有一定研究價值。

miRNA是基因表達的中心協(xié)調(diào)器，可同時調(diào)節(jié)多個功能相關的靶基因，有的研究認為miRNA主要是在翻譯水平調(diào)節(jié)靶蛋白，對mRNA的影響可能不大。成功轉染miR-155 mimics或miR-155 inhibitor后，在不同時間點觀察了TGF-β1損傷足細胞模型中miR-155表達水平的變化及相應足細胞蛋白的表達，miR-155的表達在48、72 h后明顯上調(diào)或下調(diào)，隨后，在轉染48 h～72 h提取細胞，分別用RT-PCR和Western blot檢測CD2AP、podocin、synaptopodin的mRNA和蛋白表達變化，結果發(fā)現(xiàn)，miR-155 mimics可使TGF-β1誘導的足細胞miR-155表達增加，同時促進足細胞CD2AP、podo?cin、synaptopodin mRNA的下調(diào)，3種蛋白的蛋白表達量也一致下降，而miR-155 inhibitor可以與TGFβ1誘導足細胞增加的miR-155競爭結合，下調(diào)TGF-β1引起的miR-155表達，從而抑制miR-155對足細胞的作用，CD2AP、podocin、synaptopodin的mRNA和蛋白表達均上調(diào)，這說明miR-155可能同時靶向了足細胞的3種蛋白，從而參與調(diào)節(jié)TGF-β1誘導的足細胞損傷。有研究表明，CD2AP、podocin和nephrin可通過磷酸肌醇3-OH激酶連接，被認為是SD復合物［17］。CD2AP作為銜接蛋白通過其羧基端與骨架蛋白結合，將nephrin、podocin、syn?aptopodin與細胞骨架肌動蛋白連接起來，從而在功能上相互作用，影響CD2AP在足細胞中的定位和表達則破壞SD的穩(wěn)定性和細胞骨架［18-19］。用免疫熒光觀察CD2AP蛋白的表達與Western blot和PCR結果一致，其分布也發(fā)生了相應改變，再次證明了miR-155對足細胞蛋白的作用。

綜上所述，miR-155的表達變化影響TGF-β1誘導的足細胞損傷，在蛋白和mRNA層面都是有作用的，轉染inhibitor可抑制miR-155對CD2AP、podocin和synaptopodin的靶向作用，改善足細胞的損傷。因此，miR-155有很大的潛力成為足細胞損傷新的藥物靶標，本課題組也提出假設，miR-155可以靶向足細胞、系膜細胞、內(nèi)皮細胞、基底膜等腎細胞之間的串擾，緩解腎臟疾病，但具體的信號通路機制需要進一步深入研究。