重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子對人THP-1單核細(xì)胞抗阿薩希毛孢子菌活性增強(qiáng)作用的研究

叢 林，廖 勇，楊蓉婭，祝 賀

重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子對人THP-1單核細(xì)胞抗阿薩希毛孢子菌活性增強(qiáng)作用的研究

叢 林，廖 勇，楊蓉婭，祝 賀

目的 研究重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，rh GM-CSF）對單核細(xì)胞吞噬、殺傷阿薩希毛孢子菌（Trichosporon asahii, T. asahii）功能的影響。方法 不同濃度的rh GM-CSF（100 U/ml、200 U/ml及400U/ml）與人THP-1單核細(xì)胞預(yù)孵育48 h后，加入T.asahii臨床株共培養(yǎng)1 h，應(yīng)用瑞氏-姬姆薩染色，倒置顯微鏡下觀察人THP-1單核細(xì)胞對T. asahii的吞噬情況；菌落計數(shù)法評估人THP-1單核細(xì)胞對T. asahii的殺傷情況。結(jié)果 rh GM-CSF預(yù)孵育可使人THP-1單核細(xì)胞對T. asahii的吞噬率從20%提高到84%左右。人THP-1單核細(xì)胞對T. asahii的吞噬率隨rh GM-CSF濃度增高而升高，具有濃度依賴性。200 U/ml及400 U/ml的rh GM-CSF預(yù)孵育組，每毫升T. asahii菌落形成單位較對照組明顯減少（P＜0.05）。結(jié)論 rh GM-CSF可明顯增強(qiáng)人THP-1單核細(xì)胞對T. asahii的吞噬、殺傷活性。

單核細(xì)胞；阿薩希毛孢子菌；粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）

[J Pract Dermatol, 2017, 10(4):205-208]

阿薩希毛孢子菌（Trichosporon asahii, T. asahii）是一種酵母樣真菌，可導(dǎo)致播散性毛孢子菌病[1]。隨著糖皮質(zhì)激素的大量應(yīng)用及惡性腫瘤、血液病、艾滋病等免疫功能低下人群的增多，該病發(fā)病率逐年上升。研究表明，T. asahii感染人體的結(jié)局，主要與宿主的免疫防御狀態(tài)和菌株敏感性等因素相關(guān)。吞噬細(xì)胞是人類固有免疫系統(tǒng)的重要細(xì)胞，也是清除病原微生物的重要效應(yīng)細(xì)胞。吞噬細(xì)胞包括中性粒細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等。中性粒細(xì)胞占外周血白細(xì)胞比例的70%左右，在宿主抗真菌免疫中占有重要地位。不過，播散性毛孢子菌病主要發(fā)生于由于惡性血液病等導(dǎo)致中性粒細(xì)胞減少的患者，在這類患者中單核細(xì)胞就成為宿主抗T. asahii血源性感染的主要吞噬細(xì)胞。但單核細(xì)胞的吞噬功能明顯弱于巨噬細(xì)胞，且其數(shù)量只占外周血白細(xì)胞總數(shù)的3%～8%，這可能是其難以抵擋T. asahii入侵，導(dǎo)致血源性、播散性感染的原因之一。研究表明，應(yīng)用γ-干擾素可明顯增強(qiáng)單核/巨噬細(xì)胞吞噬、殺傷T. asahii的活性，提示可應(yīng)用γ-干擾素等細(xì)胞因子輔助治療播散性毛孢子菌病[2]。粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocytemacrophage colony-stimulating factor，GM-CSF） 作 為一種重要的集落刺激因子，可促進(jìn)造血干細(xì)胞向中性粒細(xì)胞和單核/巨噬細(xì)胞分化、增殖。研究表明，GM-CSF可增強(qiáng)單核/巨噬細(xì)胞殺傷白念珠菌、煙曲霉等多種病原真菌的活性[3,4]。GM-CSF既可刺激造血系統(tǒng)，使中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞數(shù)量增多，又可以增強(qiáng)其功能，理論上可增強(qiáng)宿主抗病原真菌感染的免疫防御功能。本實驗研究了GM-CSF對單核細(xì)胞吞噬、殺傷T. asahii活性的影響，探討應(yīng)用GM-CSF輔助治療T. asahii感染的可能性。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與菌株

人THP-1單核細(xì)胞株購自中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心。本研究采用的T. asahii臨床株（菌株號：BZP07005），分離自陸軍總醫(yī)院全軍皮膚損傷修復(fù)研究所收治的播散性毛孢子菌病患者皮損組織。該臨床株經(jīng)API20C系統(tǒng)生化鑒定及IGS1基因擴(kuò)增鑒定并確認(rèn)。

1.2 主要試劑

重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（recombinant hman granulocyte-macrophage colonystimulating factor，rh GM-CSF）凍干粉（≥ 1×107U/mg）（以色列ProSpec-Tany公司），SDA瓊脂培養(yǎng)基粉、YPD培養(yǎng)基粉、磷酸鹽緩沖液（PBS）、胎牛血清、RPMI 1640液體培養(yǎng)基（均為Hyclone公司），瑞氏-姬姆薩染液（南京建成科技有限公司），Trixon-100（sigma）、鏈霉素 100 μg /ml和青霉素 100 μg /ml （碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 人THP-1單核細(xì)胞株的培養(yǎng)、傳代人THP-1單核細(xì)胞用含10%胎牛血清及含鏈霉素（100 μg/ml）和青霉素（100 μg /ml）的RPMI 1640液體培養(yǎng)基，于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、傳代。在超凈工作臺中用吸管將培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞吹打均勻，移入10 ml離心管中，離心5 min（800 r/min），棄上清，加入適量新培養(yǎng)液，用吸管吹打成細(xì)胞懸液，移入培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、傳代。取對數(shù)生長期的THP-1細(xì)胞，用RPMI 1640液體培養(yǎng)基洗滌兩次，并重懸于RPMI 1640液體培養(yǎng)基、制備單細(xì)胞懸液。應(yīng)用細(xì)胞計數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106個/ml。臺盼藍(lán)拒染法檢測人THP-1單核細(xì)胞的活細(xì)胞數(shù)量＞95%。

1.3.2T. asahii的傳代、培養(yǎng)及菌液制備 將-80℃保存的T. asahii臨床株接種于SDA真菌培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，使其復(fù)蘇活化，然后轉(zhuǎn)種于YPD液體培養(yǎng)基中，置于搖床培養(yǎng)12 h（37℃、150 r/min），使其形成含95%孢子的菌懸液，離心5 min（6 000 r/min）收集T.asahii孢子，用PBS洗滌3次，在振蕩器上劇烈振蕩，使之形成單個孢子懸液，并重懸于RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液中。應(yīng)用細(xì)胞計數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整菌液濃度到 1×107CFU/ml。

1.3.3 GM-CSF儲存液及工作液的配制 ①將含有rh GM-CSF凍干粉的微量離心管高速離心（10 000 r/min）20 s，使黏在管蓋或管壁上的蛋白聚集于管底。②1 mg rh GM-CSF凍干粉溶于10 ml滅菌雙蒸水中（濃度為100 μg/ml）。-20℃保存?zhèn)溆?。③用?0%胎牛血清的RPMI 1640液體培養(yǎng)液倍比稀釋為0.1 μg/ml（1 000 U/ml）的工作液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 實驗分組 參照文獻(xiàn)[5]，實驗組共分為3組，實驗組1：RPMI 1 640液體培養(yǎng)基＋終濃度為100 U/ml的rh GM-CSF；實驗組2：RPMI 1640液體培養(yǎng)基＋終濃度為200 U/ml的rh GM-CSF；實驗組3：RPMI 1640液體培養(yǎng)基＋終濃度為400 U/ml的rh GM-CSF；對照組為不含rh GM-CSF的RPMI 1 640液體培養(yǎng)基。各組與人THP-1單核細(xì)胞預(yù)孵育48 h后加入T. asahii菌懸液，使人THP-1單核細(xì)胞與T. asahii菌懸液相互作用。

1.3.5 rh GM-CSF對人THP-1單核細(xì)胞吞噬T. asahii的影響 將1 cm×1 cm 大小的圓形蓋玻片置于24孔板，加入500 μl濃度為 1×105/ml 的人THP-1單核細(xì)胞。參照文獻(xiàn)[5]，實驗組加入終濃度為100、200、400 U/ml的rh GM-CSF，于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中預(yù)孵育48 h。對照組加入不含rh GM-CSF的RPMI 1640液體培養(yǎng)基。48 h后，每孔加入500 μl重懸于RPMI 1640液體培養(yǎng)基濃度為5×105CFU/ml的T. asahii菌懸液，37℃、5%CO2條件下共培養(yǎng)1 h，吸棄上清液，PBS輕柔洗滌2遍，取出圓形蓋玻片置于載玻片上，加入瑞氏-姬姆薩染液進(jìn)行染色、固定，自然風(fēng)干后在顯微鏡下觀察THP-1細(xì)胞對T. asahii的吞噬現(xiàn)象，每組計數(shù)100個細(xì)胞，設(shè)2個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。吞噬率=吞噬有T. asahii的THP-1細(xì)胞個數(shù)/THP-1細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.3.6 rh GM-CSF對人THP-1單核細(xì)胞殺傷T. asahii功能的影響 參照文獻(xiàn)[5]，96孔板每孔加濃度為1×105/ml的人THP-1單核細(xì)胞懸液100 μl，同時各實驗組分別加入終濃度為100、200、400 U/m的rh GMCSF，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育48 h，對照組加入不含rh GM-CSF的RPMI 1640液體培養(yǎng)基。48 h后，棄上清液，用RPMI 1640液體培養(yǎng)基洗滌2遍，每孔加濃度為5×106CFU/ml的T. asahii菌懸液100μl，37℃、5% CO2條件下共培養(yǎng)1 h。吸取上清液轉(zhuǎn)移到另一96孔板；原96孔板每孔加入100 μl 2%的TritonX-100[6]作用10 min，裂解THP-1細(xì)胞；取細(xì)胞裂解后釋放出的T. asahii的上清液與裂解前上清液混合，混勻后倍比稀釋100倍。吸取200 μl，加入15 ml 50℃的SDA真菌培養(yǎng)基中，凝固后于37℃真菌培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)48 h，觀察每個平皿形成的菌落數(shù)，計算每毫升的T. asahii菌落形成單位（CFU/ml）及對T. asahii的生長抑制率。T. asahiiCFU/ml=菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)（100）×5，T. asahii生長抑制率=（對照組平均CFU/ml－實驗組平均CFU/ml）/對照組平均CFU/ml×100%。每組設(shè)2個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行各組均數(shù)間的兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度rh GM-CSF對人THP-1單核細(xì)胞吞噬T.asahii的增強(qiáng)作用

實驗結(jié)果顯示，rh GM-CSF預(yù)孵育可使THP-1細(xì)胞對T. asahii的吞噬率（相互作用1 h）從20%左右提高到84%左右。THP-1細(xì)胞對T. asahii的吞噬率隨rh GM-CSF濃度增加而升高，具有濃度依賴性。各實驗組與對照組比較吞噬T. asahii的THP-1細(xì)胞數(shù)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。各實驗組之間兩兩比較差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。實驗分組及各組THP-1細(xì)胞對T. asahii的吞噬作用見表1。

2.2 不同濃度rh GM-CSF對人THP-1單核細(xì)胞殺傷T.asahii的增強(qiáng)作用

裂解與T.asahii相互作用1 h后的人THP-1單核細(xì)胞，釋放被其吞噬的T. asahii，接種至SDA培養(yǎng)基，觀察平皿上形成的菌落數(shù)。結(jié)果顯示，200 U/ml及400 U/ml rh GM-CSF預(yù)孵育組，每毫升T. asahii菌落形成單位較對照組明顯減少（P＜ 0.05），兩組對T. asahii的生長抑制率分別達(dá)到27.89%和55.46%。100 U/ml rh GM-CSF組每毫升T. asahii菌落形成單位較對照組亦有所減少，但無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。各實驗組之間兩兩比較亦有差異（P＜ 0.05）。實驗分組及各組菌落數(shù)見表2。

表1 rh GM-CSF對人THP-1單核細(xì)胞吞噬T. asahii的影響

3 討論

T. asahii感染所致的播散性毛孢子菌病主要發(fā)生于伴有中性粒細(xì)胞減少的血液病患者[1]。單核細(xì)胞只占外周血白細(xì)胞總數(shù)的3%～8%，數(shù)量較少[6]。在中性粒細(xì)胞減少的患者，少量的單核細(xì)胞可能難以抵擋T.asahii的入侵，這可能是導(dǎo)致T. asahii血源性、播散性感染的原因之一。研究表明，固有免疫細(xì)胞的吞噬功能是其發(fā)揮抗感染防御作用的重要機(jī)制，而單核細(xì)胞的吞噬功能明顯弱于巨噬細(xì)胞[7]。研究表明，人外周血中性粒細(xì)胞對T. asahii的吞噬作用弱于對白念珠菌的吞噬作用，中性粒細(xì)胞與T. asahii相互作用15 min的吞噬率僅有10%左右[8]。筆者前期的預(yù)實驗顯示，人THP-1單核細(xì)胞與T. asahii相互作用1h的吞噬率僅有20%左右，提示人THP-1單核細(xì)胞對T. asahii的吞噬作用較弱。延長THP-1細(xì)胞與T. asahii的相互作用時間可以提高單核細(xì)胞的吞噬率，人THP-1單核細(xì)胞與T. asahii相互作用3h的吞噬率可達(dá)80%左右。但是鏡下觀察發(fā)現(xiàn)T. asahii繁殖速度明顯快于THP-1細(xì)胞增殖速度，并使THP-1細(xì)胞的活力受到影響（活細(xì)胞數(shù)下降到80%以下）?？梢?，當(dāng)T. asahii大量繁殖時單核細(xì)胞將難以抵抗T. asahii感染。那么，能否通過藥物干預(yù)，增強(qiáng)宿主單核細(xì)胞對T. asahii的吞噬、殺傷活性，從而增強(qiáng)其抗感染能力呢？

本課題組的前期研究表明，γ干擾素可明顯增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬、殺傷T. asahii的活性[2]，提示可應(yīng)用γ干擾素等細(xì)胞因子輔助治療T. asahii所致的播散性感染疾病。Sasaki等[9]研究了巨噬細(xì)胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor，M-CSF） 對外周血單核細(xì)胞抗T. asahii活性的影響。結(jié)果顯示，M-CSF可明顯增強(qiáng)單核細(xì)胞對T. asahii的殺傷作用，提示M-CSF可作為播散性毛孢子菌病的輔助治療藥物。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)GM-CSF可明顯增強(qiáng)中性粒細(xì)胞對T. asahii的吞噬作用[8]。GM-CSF作為一種重要的集落刺激因子，可促進(jìn)造血干細(xì)胞向中性粒細(xì)胞和單核/巨噬細(xì)胞分化、增殖。GM-CSF既可刺激造血系統(tǒng)，使中性粒細(xì)胞和單核、巨噬細(xì)胞數(shù)量增多，又可以增強(qiáng)其功能，理論上可增強(qiáng)宿主吞噬細(xì)胞的免疫防御功能[10]。目前，國內(nèi)外少見GM-CSF對單核細(xì)胞抗T.asahii活性影響的相關(guān)報道。

表2 rh GM-CSF對人THP-1單核細(xì)胞殺傷T. asahii的影響

筆者的研究結(jié)果顯示，rh GM-CSF可濃度依賴性的增強(qiáng)人THP-1單核細(xì)胞對T. asahii的吞噬及殺傷作用。應(yīng)用rh GM-CSF與人THP-1單核細(xì)胞預(yù)孵育后，THP-1細(xì)胞對T. asahii的吞噬率可提高到84%左右。本研究通過裂解吞噬有T. asahii的THP-1細(xì)胞，應(yīng)用平皿培養(yǎng)法計算從THP-1細(xì)胞中釋放出的T. asahii能夠形成的菌落數(shù)，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用200 U/ml、400 U/ml的rh GM-CSF預(yù)孵育可明顯增強(qiáng)人THP-1單核細(xì)胞對T.asahii的殺傷作用。

目前，國內(nèi)外有大量關(guān)于GM-CSF增強(qiáng)中性粒細(xì)胞和（或）單核細(xì)胞對多種病原真菌（如白念珠菌、煙曲霉及新生隱球菌等）抗感染活性的實驗研究[10-13]。相關(guān)動物實驗也顯示，GM-CSF能夠明顯降低念珠菌病、曲霉菌病及進(jìn)行性隱球菌肺部感染等動物模型的真菌負(fù)荷量及生存率[14-16]。相對于GM-CSF增強(qiáng)宿主抗真菌感染免疫功能的大量體內(nèi)外實驗研究，GMCSF臨床用于抗真菌感染的文獻(xiàn)報道相對較少。rh GM-CSF于1991年由美國食品藥品管理局批準(zhǔn)上市[4,17]。有學(xué)者應(yīng)用rh GM-CSF輔助治療了急性白血病并發(fā)曲霉菌或念珠菌深部感染的8例患者。結(jié)果顯示，這些患者的病死率明顯低于未應(yīng)用rh GM-CSF的對照組[18]。Vazquez等[19]應(yīng)用rh GM-CSF輔助治療了11例艾滋病并發(fā)對氟康唑耐藥的口咽部念珠菌感染患者，其中7例患者病情明顯好轉(zhuǎn)，提示rh GM-CSF可作為一種免疫佐劑輔助治療艾滋病并發(fā)真菌感染者。Peter BG等[20]的研究顯示，應(yīng)用GM-CSF可降低大劑量化療后出現(xiàn)系統(tǒng)性真菌感染的風(fēng)險和真菌感染相關(guān)病死率。一項系統(tǒng)回顧分析研究顯示，GM-CSF等集落刺激因子可顯著降低化療所致中性粒細(xì)胞減少患者出現(xiàn)嚴(yán)重感染的發(fā)生率及病死率，從而改善患者的預(yù)后[21]。一項前瞻性多中心開放隨機(jī)研究比較了預(yù)防性應(yīng)用GM-CSF、G-CSF對異體造血干細(xì)胞移植患者侵襲性真菌病發(fā)病率及病死率的影響。結(jié)果顯示，與GM-CSF相比，預(yù)防性應(yīng)用GM-CSF在降低100 d移植相關(guān)病死率、100 d累計病死率和600 d侵襲性真菌感染病死率上更為有效，原因可能是GM-CSF可增強(qiáng)單核/巨噬細(xì)胞的吞噬功能，且在刺激外周血生成中性粒細(xì)胞/單核細(xì)胞的數(shù)量上優(yōu)于G-CSF[22]。研究者建議，在異體造血干細(xì)胞移植患者出現(xiàn)中性粒細(xì)胞減少期間，可預(yù)防性應(yīng)用GM-CSF，以降低侵襲性真菌感染的發(fā)生率及病死率[22]。

綜上所述， rh GM-CSF預(yù)孵育可明顯增強(qiáng)人THP-1單核細(xì)胞對T. asahii的吞噬、殺傷活性。提示應(yīng)用rh GM-CSF輔助治療T. asahii播散性感染可能是一種有效的治療策略。

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Effects of GM-CSF on the activities of human monocyte-like THP-1 cells againstT. asahiiinfection

CONG Lin，LIAO Yong，YANG Rong-ya，et al
Institute of Skin Damege and Repair, PLA Army General Hospital, Beijing, 100700, China

Objective To investigate the effects of recombinant human Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor (rh GMCSF) on the phagocytosis and fungicidal activities of human monocyte-like THP-1 cells againstTrichosporon asahii(T. asahii) infection.Methods Human monocyte-like THP-1 cells were incubated with various concentrations (100, 200, 400U/ml) of rh GM-CSF or medium alone for 48 h, then co-cultured withT. asahiifor 1 h. The phagocytosis activities of THP-1 cells againstT. asahiiwere observed by inverted microscope after stained with Wright-Giemsa stain. The fungicidal activities of THP-1 cells againstT. asahiiwere assessed by counting the number of colony forming units (CFU/ml). Results The phagocytic rate of THP-1 cells toT. asahii(1 h) increased from 20% to 84%after pre-incubated with rh GM-CSF. The phagocytosis rate of human THP-1 cells toT. asahiiincreased with the increase of rh GM-CSF concentration in a concentration dependent manner. For 200 U/ml and 400 U/ml rh GM-CSF preincubation groups, eachT. asahiicolony forming unit was signifcantly less than the control group. Conclusion GM-CSF can augment the phagocytosis and fungicidal activities of human monocyte-like THP-1 cells againstT. asahii. The application of rh GM-CSF may be helpful to overcome theT. asahiiinfections and represents as a useful therapeutic strategy.

Monocytes；Trichosporon asahii；Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor

R739.9

A

1674-1293(2017)04-0205-04

叢 林

2017-03-16

2017-06-03）

（本文編輯 祝賀）

10.11786/sypfbxzz.1674-1293.20170404

北京市科技新星項目（Z161100004916139）；全軍醫(yī)學(xué)科技青年培育項目（14QNP010）

100700北京，中國人民解放軍陸軍總醫(yī)院全軍皮膚損傷修復(fù)研究所（叢林，廖勇，楊蓉婭，祝賀）

叢林，博士，主治醫(yī)師，研究方向：真菌感染與感染免疫學(xué)，E-mail: conglin369@163.com

楊蓉婭，E-mail: yangrya@sina.com