鴨茅EST-SSR標(biāo)記在4種禾草上的可轉(zhuǎn)移性

王新宇，張新全，黃琳凱，聶 剛

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院草業(yè)科學(xué)系，四川 成都 611130)

鴨茅EST-SSR標(biāo)記在4種禾草上的可轉(zhuǎn)移性

王新宇，張新全，黃琳凱，聶 剛

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院草業(yè)科學(xué)系，四川 成都 611130)

為了檢驗鴨茅EST-SSR標(biāo)記在幾種禾本科植物上的可轉(zhuǎn)移性并篩選出可應(yīng)用于后續(xù)研究的引物，本研究用40對可在鴨茅(Dactylisglomerata)上擴(kuò)增產(chǎn)物的鴨茅EST-SSR引物，分析了6份多花黑麥草(Loliummultiflorum)、6份高羊茅(Festucaarundinacea)、3份扁穗牛鞭草(Hemarthriacompressa)和3份牛鞭草(H.altissima)共18份材料的轉(zhuǎn)移率、遺傳多樣性和親緣關(guān)系。結(jié)果表明，多年生黑麥草和高羊茅可轉(zhuǎn)移率為60%，扁穗牛鞭草和牛鞭草轉(zhuǎn)移率最低，均為50%，26對引物共獲得條帶128條，多態(tài)性條帶121條,多態(tài)性比(PPB)為94.53%，平均擴(kuò)增出多態(tài)性條帶4.92條，平均多態(tài)性信息量0.952。18份材料遺傳相似系數(shù)范圍為0.208～0.974，在遺傳系數(shù)為0.68時，4個物種分別獨(dú)自聚為一大類。本研究證實利用鴨茅EST序列開發(fā)的EST-SSR在有一定親緣關(guān)系的物種間轉(zhuǎn)移是可行的，可轉(zhuǎn)移的引物對未來禾本科遺傳育種研究有一定的參考價值。

鴨茅；多花黑麥草；高羊茅；扁穗牛鞭草；牛鞭草；EST-SSR；轉(zhuǎn)移性

SSRs即簡單重復(fù)序列(simple sequence repeat)，又稱微衛(wèi)星DNA，是一種由1～6個堿基為重復(fù)單位的DNA序列[1]，不論真核生物還是原核生物都有廣泛且隨機(jī)的分布。SSR標(biāo)記與其它分子標(biāo)記相比有明顯的優(yōu)勢：SSRs有較高的豐度、較高的信息含量、較高的多態(tài)性、較多的共顯性遺傳和較多的重復(fù)性[2]。所以，其已被廣泛用于SSR遺傳連鎖圖譜構(gòu)建[3]、 DNA指紋圖譜的構(gòu)建[4]、遺傳多樣性的研究[5]、標(biāo)記輔助選擇育種[6]和品種鑒定[7]等。EST(Expressed Sequence Tag)-SSRs即表達(dá)序列標(biāo)簽是基于EST序列開發(fā)的新型分子標(biāo)記，EST處在表達(dá)區(qū)域，可以通過對比EST序列信息和蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫推斷基因功能[8-9]。相比SSRs，EST-SSRs更保守，所以在相關(guān)物種上EST-SSRs有更強(qiáng)的轉(zhuǎn)移性[10]。設(shè)計多花黑麥草(Loliummultiflorum)、高羊茅(Festucaarundinacea)、扁穗牛鞭草(Hemarthriacompressa)和牛鞭草(H.altissima)等非模式植物的SSR引物成本相對高一些，但也可以增加這4個物種的標(biāo)記種類。SSR能在物種之間轉(zhuǎn)移是因為其側(cè)翼序列的保守性，但是SSR一般來自于非編碼區(qū)，物種之間SSR的差異大，而EST序列來自于編碼區(qū)，EST-SSR的側(cè)翼序列高度保守，所以EST-SSR能在物種之間有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)移能力。基于這個優(yōu)勢，EST-SSR在基因組學(xué)上有大量的應(yīng)用。Wang等[11]用苜蓿(Medicagosativa)和大豆(Clycinemax)的28個EST-SSR將百合屬(Lilium)4個種26個品種成功聚為4類。忻雅等[12]研究白菜(Brassicapekinensis)EST-SSR對油菜(B.campestris)的轉(zhuǎn)移性時發(fā)現(xiàn)，28對引物有24對能在油菜上擴(kuò)增出產(chǎn)物，其中又有18對顯示多態(tài)性。禾本科作物間轉(zhuǎn)移性也有比較深入的應(yīng)用：Tang等[13]研究小麥(Triticumaestivum)EST-SSR引物在大麥(Hordeumvulgare)、水稻(Oryzasotiva)和玉米(Zeamays)上的轉(zhuǎn)移性發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)移性隨親緣關(guān)系變遠(yuǎn)而降低；Saha等[14]研究高羊茅EST-SSR在其它幾種草上的可轉(zhuǎn)移性，并將同一引物擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增片段有很高的相似性；Xie等[15]用小麥EST-SSR和鴨茅(Dactylisglomerata)SSR研究了74份來自世界各地鴨茅的多樣性和遺傳關(guān)系，結(jié)果表明鴨茅遺傳多樣性豐富。羅小燕等[16]使用柱花草(Stylosanthes)EST-SSR標(biāo)記在山螞蝗(Desmodiumracemosum)上研究其遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)兩者有比較高的親緣性，柱花草EST-SSR可以使用在山螞蝗的后續(xù)研究中。隨著大量測序結(jié)果在網(wǎng)上公開，開發(fā)EST-SSR能力得到極大地提升，大量的植物可以利用已知EST序列信息開發(fā)引物，并在自身和有親緣性的物種上運(yùn)用。但鴨茅EST的開發(fā)和運(yùn)用目前還未見報道，本研究利用鴨茅EST-SSR標(biāo)記對黑麥草、高羊茅、扁穗牛鞭草和牛鞭草的轉(zhuǎn)移性進(jìn)行分析，并嘗試應(yīng)用于這4種禾草親緣關(guān)系和遺傳多樣性分析中，為4種禾本科植物與鴨茅比較基因組學(xué)提供分子生物學(xué)依據(jù)，并發(fā)掘優(yōu)質(zhì)基因，為遺傳育種提供幫助，同時豐富這4個物種的分子標(biāo)記數(shù)量。

1 材料與方法

1.1供試材料

本研究共用18份材料，其中多年生黑麥草6份(編號1-6)，高羊茅6份(編號10-15)，扁穗牛鞭草(編號7-9)和牛鞭草(編號16-18)各3份，但部分來自美國基因庫的PI種質(zhì)無法獲得來源地信息，具體情況如表1所示。供試材料葉片均采于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)研究基地，采集后干燥保存。

1.2DNA提取

每份種質(zhì)隨機(jī)選取健康幼嫩葉片，采用試劑盒法(天根生化科技有限公司)提取DNA。最后用1%的瓊脂糖凝膠電泳對提取的DNA濃度與純度進(jìn)行檢測。符合實驗要求的DNA樣品放置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3引物篩選與PCR擴(kuò)增

引物由Huang等開發(fā)[17]，再經(jīng)南京金斯瑞生物科技有限公司合成，詳細(xì)信息如表2所示。引物首先在‘金?！?‘阿索斯’、 ‘01472’、 ‘Intensiv’4個形態(tài)差異明顯的鴨茅上進(jìn)行篩選，共選取40對擴(kuò)增條帶清晰、有一定多態(tài)性的引物用于鴨茅親源物種上轉(zhuǎn)移性分析。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)總體積為15 μL，包括PCR-Mix(北京天根生化公司)7.5 μL、模板DNA等1.5 μL(10 ng·μL-1)、正反向引物各0.6 μL(10 pmol·μL-1)、Taq酶0.3 μL (2.5 U·μL-1)，ddH2O補(bǔ)足15 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性1 min，退火溫度1 min，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)，72 ℃下10 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物在6%聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行檢測。樣孔中每個樣品點(diǎn)6 μL，以博瑞克公司的D50Marker為對照。330 V下電泳160 min。再用0.1%的AgNO3進(jìn)行銀染色和在NaOH液中顯色，凝膠在燈光下用數(shù)碼相機(jī)照相保存以供分析。

表1 供試的禾草Table 1 Four grass plant species examined in this study

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

根據(jù)電泳結(jié)果，在同一擴(kuò)增位置，有條帶記為1，無條帶記為0，建立0、1矩陣。數(shù)據(jù)由Office Excel標(biāo)準(zhǔn)化統(tǒng)計，利用NTSYS-PC2.1中similarity程序計算相似系數(shù)，以clustering程序中SHAN 進(jìn)行UPGMA (un-weighted pair-group method with arithmetic means， 非加權(quán)組平均法)聚類分析。利用Popgen32計算多態(tài)信息含量(PIC)、Nei’s遺傳多樣性指數(shù)(He)及Shannon 信息指數(shù)(I)。

2 結(jié)果

2.1鴨茅EST-SSR引物可轉(zhuǎn)移性

本試驗中40對鴨茅EST-SSR引物中在所有材料中擴(kuò)增(圖1，圖2)。其中有13對未擴(kuò)增出條帶(DGSSR 23、DGSSR 33、DGSSR 35、DGSSR 53、DGSSR 63、DGSSR 85、DGSSR 105、DGSSR 107、DGSSR 114、DGSSR 122、DGSSR 128、DGSSR 139、 DGSSR148)；另外27對引物可以在這4個物種上擴(kuò)增出產(chǎn)物，轉(zhuǎn)移率達(dá)到67.5%。有17對引物在試驗的每個的物種上均擴(kuò)增出條帶，可轉(zhuǎn)移率達(dá)到42.5%，占可轉(zhuǎn)移引物的63%。其中多花黑麥草可轉(zhuǎn)移率為60%(24/40)，高羊茅可轉(zhuǎn)移率為60%(24/40)，扁穗牛鞭草和牛鞭草轉(zhuǎn)移率最低，均為50%(20/40)。

2.2擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性分析

26對(其中DGSSR82只在牛鞭草上出現(xiàn)擴(kuò)增情況，且無多態(tài)性)可轉(zhuǎn)移的鴨茅EST-SSR引物共在4個物種上擴(kuò)增出128條條帶，其中多態(tài)性條帶為121條，多態(tài)性條帶比率為94.53%，每對引物擴(kuò)增出條帶數(shù)為3～9條,平均為4.92，平均多態(tài)性條帶數(shù)為4.65(表3)。每條引物多態(tài)性信息含量為0.75～1,平均為0.951 6。4個物種的18份材料平均Nei’s遺傳多樣性指數(shù)為0.306，而平均Shannon信息指數(shù)為0.462。就各位點(diǎn)而言，Nei’s遺傳多樣性指數(shù)最大為0.390，最小為0.141,Shannon 信息指數(shù)最大為0.577， 最小為0.228。

表2 本研究中采用的鴨茅EST-SSR引物信息Table 2 Dactylis glomerata EST-SSR primers used in the present study

圖1 引物DGSSR66在18份禾草擴(kuò)增情況Fig. 1 Amplified patterns of 18 grass species with primer pair DGSSR66

圖2 引物DGSSR140在18份禾草擴(kuò)增情況Fig. 2 Amplified patterns of 18 grass species with primer pair DGSSR140

2.3聚類分析

運(yùn)用NTSYS-PC2.1對數(shù)據(jù)進(jìn)行遺傳相似性分析，結(jié)果表明，4個物種18份材料遺傳系數(shù)范圍為0.208～0.974，平均0.490(圖3)。其中，遺傳相似系數(shù)最大的是雅安和廣益(同為扁穗牛鞭草)，為0.974；其次是PI520749和PI578712(同為高羊茅)，為0.937。這說明它們之間遺傳關(guān)系很近。遺傳相似系數(shù)最小的是安格斯1號(多花黑麥草)和H203(牛鞭草)，為0.191。4個物種18份材料遺傳差異明顯，遺傳多樣性豐富。

基于遺傳相似系數(shù)，對4個物種18份材料進(jìn)行聚類分析，在遺傳系數(shù)為0.680處可以將4個物種分成4類，第Ⅰ類為多花黑麥草，第Ⅱ類為高羊茅，第Ⅲ類扁穗牛鞭草，第Ⅳ類為高牛鞭草。從聚類分析圖可以看出，6個高羊茅品種的遺傳相似系數(shù)較大，親緣關(guān)系較大；其次是3個扁穗牛鞭草品種，再次是6個多年生黑麥草品種，最后是3個高牛鞭草品種。

表3 鴨茅EST-SSR標(biāo)記在4種禾草中的多態(tài)性Table 3 Polymorphism of Dactylis glomerata EST-SSR markers in four grass species

圖3 4種禾草EST-SSR聚類分析圖Fig. 3 UPGMA dendrogram of the four grasses species based on Dice’s similarity coefficient according to orchardgrass EST-SSR markers

3 討論

EST來自表達(dá)序列，與非編碼區(qū)域相比，它們在近緣物種上有更強(qiáng)的保守性，所以EST-SSR比genomic-SSR存在更大的跨物種潛力[18]。而國內(nèi)外大量的試驗也證明，EST-SSR在物種間比較作圖和比較基因組學(xué)上更有優(yōu)勢[19-20]。近年來，隨著測序技術(shù)的發(fā)展以及成本的降低，可以輕易地在各大數(shù)據(jù)庫上得到大量的EST序列信息，基于EST序列信息開發(fā)引物變得更加高效，而EST-SSR引物在近緣種屬間的轉(zhuǎn)移性優(yōu)勢可以大大降低開發(fā)自身引物的成本，彌補(bǔ)分子標(biāo)記的不足，豐富標(biāo)記數(shù)量。本研究所用引物在4個物種上最低的轉(zhuǎn)移率都達(dá)到50%，證明利用鴨茅EST開發(fā)的引物運(yùn)用在有一定親緣性物種上的可行性，本研究所用引物可以為以后與鴨茅有一定親緣性的物種遺傳多樣性分析、品種鑒定、分子標(biāo)記輔助育種、構(gòu)建遺傳圖譜等提供新引物，也為鴨茅與這4個有親緣性的物種提供比較基因組學(xué)信息。

引物的轉(zhuǎn)移性高低與兩個物種間的親緣關(guān)系有關(guān)。簡而言之，物種之間親緣性越近，引物轉(zhuǎn)移性就越高；反之，親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，引物轉(zhuǎn)移性就越低[21]。Fan等[22]用新開發(fā)的梨(Pyrus)SSR標(biāo)記在部分薔薇科物種上研究轉(zhuǎn)移性，發(fā)現(xiàn)在同屬蘋果亞科的蘋果(Maluspumila)的轉(zhuǎn)移性達(dá)到58.2%，在同屬蘋果亞科的枇杷(Eriobotryajaponica)的轉(zhuǎn)移性達(dá)到32.8%，而在與它親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的桃子(Amygdaluspersica)上的轉(zhuǎn)移性為14.1%，在櫻桃(Cerasuspseudocerasus)上為15.5%，而在杏(Armeniacavulgaris)上為12.7%。Varshney等[23]研究發(fā)現(xiàn)，165條大麥EST-SSR引物，78.2%可在小麥中轉(zhuǎn)移，75.2%可在黑麥(Secalecereale)中轉(zhuǎn)移，而只有42.4%可在水稻中轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移性隨著其種系關(guān)系距離增加而降低。鴨茅和高羊茅同屬早熟禾亞科(Pooideae)，親緣關(guān)系在4個物種中最近，但在本研究中，引物在多花黑麥草和高羊茅上的轉(zhuǎn)移率均為60%，試驗結(jié)果不完全符合4個物種與鴨茅的親緣關(guān)系情況。雖然轉(zhuǎn)移率有差異，但實際上可轉(zhuǎn)移的引物數(shù)量差并不大。EST-SSR是否擴(kuò)增產(chǎn)物也與DNA有關(guān)，DNA存在大量內(nèi)含子或者SSR一端或者兩端引物位于內(nèi)含子、外顯子剪切位點(diǎn)都會造成無效擴(kuò)增，估計高羊茅的的擴(kuò)增率低于多花黑麥草是由以上兩個原因造成的，還有本研究所用引物數(shù)不多，若引物達(dá)到一定數(shù)量，高羊茅的轉(zhuǎn)移率會有高于多花黑麥草的可能。

研究中18份材料可以被成功聚為4類，證明轉(zhuǎn)移性良好的引物對物種進(jìn)化分析和物種鑒定都有重要意義。但是試驗結(jié)果與黃婷等[24]和黃秀等[25]在多年生黑麥草、扁穗牛鞭草和高牛鞭草的聚類上和遺傳相似性上均存在部分差異。黃婷等[24]的試驗表明阿德納和邦德的親緣關(guān)系最近，而本研究表明二者的親緣關(guān)系很遠(yuǎn)。這可能是因為多年生黑麥草的遺傳背景比較復(fù)雜，而兩次試驗時間有近兩年的距離，材料會存在一定的差異，且黃婷等使用30株單株DNA和30株混合DNA作為試驗材料，這兩種混合方式產(chǎn)生的條帶數(shù)會不同于單株材料的試驗結(jié)果；并且黃婷等[24]統(tǒng)計時條帶也不是全部統(tǒng)計，而是統(tǒng)計高于某一頻率的條帶，這會忽略部分頻率不是太高的條帶；兩個試驗的引物也不相同，這些試驗材料、統(tǒng)計方法和引物上的不同會直接導(dǎo)致聚類差異。黃秀等[24]的試驗表明，聚類結(jié)果完全和材料的生長地有關(guān)，但本研究表明，聚類結(jié)果不完全和材料的生長地有關(guān)。扁穗牛鞭草和高牛鞭草廣泛地使用無性繁殖，可以穩(wěn)定地保持遺傳特性，試驗材料沒有太多的差異。兩個試驗都是EST-SSR引物，但是黃秀等[25]使用的是禾本科通用引物，而本研究使用的引物是基于鴨茅抗旱基因開發(fā)出來的，這種具有一定功能的基因在有一定親緣性地物種之間肯定會更加保守，保守性會使條帶多態(tài)性下降，這在一定程度上也影響了聚類結(jié)果。本研究選用的引物數(shù)量較少，不能完全說明4個物種的進(jìn)化關(guān)系。本研究中多態(tài)性條帶比率高達(dá)94.53%，遠(yuǎn)高于板栗(Castaneamollissima)EST-SSR在栲樹(Castanopsisfargesii)上的分析結(jié)果(56.6%)[26]和小麥在7種能源植物的分析結(jié)果(76.7%)[27]，說明本研究開發(fā)的引物可以利用在與鴨茅近緣物種上的親緣性分析。

到目前為止，CNBI共收錄EST序列信息7 600萬條，植物大概占1/3，其中主要集中在水稻、小麥、玉米、大豆等作物，而鴨茅等草類植物的EST信息相對較少。本研究結(jié)果進(jìn)一步證明，EST序列有較高的保守性，根據(jù)這一特性，EST信息可以更多的利用在重要基因定位以及重要基因開發(fā)利用上，這對我國牧草分子育種大有裨益，黑麥草、高羊茅、扁穗牛鞭草和牛鞭草屬于優(yōu)質(zhì)草種，在畜牧和草坪建植上都有廣泛的使用，經(jīng)濟(jì)價值也比較高[28-29]。因此，可以加大在鴨茅等草類植物EST相關(guān)研究。

4 結(jié)論

利用40對鴨茅EST-SSR引物對本科4個物種18份材料進(jìn)行轉(zhuǎn)移性分析發(fā)現(xiàn)，鴨茅EST-SSR引物的轉(zhuǎn)移性隨著與試驗材料之間的親緣關(guān)系變遠(yuǎn)而降低。本研究開發(fā)的鴨茅EST-SSR引物可以將18份材料按物種分為4類，且擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性高，可用于鴨茅與有一定親緣性的物種之間的后續(xù)研究。

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(責(zé)任編輯 王芳)

TransferabilityofDactylisglomerataEST-SSRmarkerstofourgrassspecies

Wang Xin-yu, Zhang Xin-quan, Huang Lin-kai, Nie Gang
(Department of Grassland Science,Animal Science and Technology College,Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China)

In order to test the transferability of orchardgrass EST-SSR in several grass species in Gramineae and select some reliable markers used in followed-up studies, 40 orchardgrass EST-SSR, which can amplify products successfully in orchardgrass, were analysed to determine the transferability, genetic diversity and relationship of 18 materials including 6Loliummultiflorum, 6Festucaarundinacea, 3HemarthriacompressaandH.altissima. The cross-transferability of these markers was found to be 60% inL.multiflorumandF.arundinacea, while 50% inH.compressaandH.altissima. Together, the 25 EST-SSRs detected 128 bands. In these 128 bands, 121 were polymorphic (94.53%) and the average number was 4.92 per primer, and the polymorphic information content (PIC) ranged from 0.75 to 1 with an average of 0.952. The similarity coefficient of the 18 materials ranged from 0.208 to 0.974, with an average of 0.490, and UPGMA cluster analysis grouped them into four groups at the similarity level of 0.68. This study confirmed that it was feasible that the EST-SSRs developed from orchardgrass EST sequences can cross to some related species. Those transferable markers will give some reference to breeding work in Gramineae.

Orchardgrass;Loliummultiflorum;Festucaarundinacea;Hcompressacompressa;H.altissima; EST-SSR; transferability

Zhang Xin-quan E-mail:zhangxq@sicau.edu.cn

S543+.303

：A

：1001-0629(2017)09-1815-09

10.11829/j.issn.1001-0629.2016-0563

王新宇，張新全，黃琳凱，聶剛.鴨茅EST-SSR標(biāo)記在4種禾草上的可轉(zhuǎn)移性.草業(yè)科學(xué),2017,34(9)：1815-1823.

Wang X Y,Zhang X Q,Huang L K,Nie G.Transferability ofDactylisglomerataEST-SSR markers to four grass species.Pratacultural Science，2017,34(9)：1815-1823.

2016-11-04接受日期：2017-03-29

：國家自然科學(xué)基金(31372363)；國家現(xiàn)代牧草產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-35-05)

：王新宇(1991-)，男，四川成都人，在讀碩士生,主要從事草種質(zhì)資源創(chuàng)新及育種。E-mail:wxysicauDg@163.com

：張新全(1965-)，男，教授，博導(dǎo)，博士，主要從事草種資源創(chuàng)新及育種研究。 E-mail:zhangxq@sicau.edu.cn