侵染芹菜的甜椒內(nèi)源RNA病毒鑒定及序列分析

趙興華, 于沛?zhèn)b, 陳麗君, 王德富, 牛顏冰*

(1. 河南省濟源市農(nóng)牧局園藝工作站,濟源459000; 2. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,太谷 030801)

侵染芹菜的甜椒內(nèi)源RNA病毒鑒定及序列分析

趙興華1, 于沛?zhèn)b2, 陳麗君2, 王德富2, 牛顏冰2*

(1. 河南省濟源市農(nóng)牧局園藝工作站,濟源459000; 2. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,太谷 030801)

本試驗利用雙鏈RNA(double-stranded RNA, dsRNA)提取技術(shù)和非序列依賴PCR擴增(sequence-independent amplification,SIA)方法對表現(xiàn)皺縮癥狀的芹菜進行分子鑒定,發(fā)現(xiàn)芹菜被甜椒內(nèi)源RNA病毒Bellpepperalphaendornavirus(BPEV)所侵染。為進一步明確山西芹菜BPEV分離物(BPEV-QC,GenBank登錄號為KY659226)的分類地位,根據(jù)SIA測序結(jié)果設(shè)計BPEV特異性引物進行RT-PCR檢測,并進行序列相似性比較和系統(tǒng)進化分析。序列同源性分析表明:BPEV-QC與BPEV分離物(IS、Maor、Kyosuzu、BPEV、lj、BPEV-YW)的同源性為80.0%～97.8%,與其他內(nèi)源RNA病毒科分離物的同源性僅為30.6%～37.6%,表明:BPEV-QC與BPEV分離物(IS、Maor、Kyosuzu、BPEV、lj)形成一個獨立分支,親緣關(guān)系最近。

芹菜; 病原鑒定; 甜椒內(nèi)源RNA病毒; 序列分析

芹菜Apiumgraveolens為傘形科植物,具有一定的藥用功效。近年來,隨著人們生活水平的提高和保健意識的增強,對芹菜的需求量也在不斷增加,種植規(guī)模不斷擴大引起的病毒病危害也愈發(fā)普遍,嚴(yán)重影響了芹菜的產(chǎn)量和品質(zhì)。目前芹菜主要受到黃瓜花葉病毒Cucumbermosaicvirus(CMV)[1]、煙草花葉病毒Tobaccomosaicvirus(TMV)、蠶豆萎蔫病毒Broad bean wilt virus (BBWV)、歐洲防風(fēng)花葉病毒Parsnipmosaicvirus(ParMV)[2]、芹菜花葉病毒Celerymosaicvirus(CeMV)[3]、苜?；ㄈ~病毒Alfalfamosaicvirus(AMV)[4]、花生矮化病毒Peanutstuntvirus(PSV)、南芥菜花葉病毒Arabismosaicvirus(ArMV)、草莓潛環(huán)斑病毒Strawberrylatentringspotvirus(SLRSV)、番茄不孕病毒Tomatoaspermyvirus(TAV)[5]、芹菜黃花葉病毒Celery yellow mosaic virus (CeYMV)和蕪菁花葉病毒Turnipmosaicvirus(TuMV)等病毒的單獨或復(fù)合侵染。

筆者于2014年9月對山西晉中地區(qū)芹菜進行病害調(diào)查時,發(fā)現(xiàn)許多芹菜植株表現(xiàn)出嚴(yán)重皺縮癥狀,有的田塊病株率甚至高達(dá)60%。為明確引起芹菜皺縮癥狀的病原,本試驗利用dsRNA技術(shù)[6]和SIA方法[7]對采集的疑似病毒病樣品進行分子鑒定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)芹菜受到BPEV侵染,將其命名為BPEV-QC,并對BPEV-QC的部分序列進行了克隆和系統(tǒng)進化分析,明確了其分類地位,這為進一步獲得甜椒內(nèi)源RNA病毒山西芹菜分離物(BPEV-QC)的基因組全序列奠定了一定的基礎(chǔ),也為芹菜病毒病的防治工作提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

表現(xiàn)皺縮癥狀的芹菜植株葉片病樣采自山西太谷韓村(圖1)。

圖1 芹菜田間發(fā)病癥狀Fig.1 Symptoms of diseased Apium graveolens in the field

1.2 方法

1.2.1 植物病原dsRNA的提取

參照牛顏冰等[8-9]和Tzanetakis等[6]的方法提取表現(xiàn)皺縮癥狀的芹菜病葉dsRNA。

1.2.2 樣品SIA和RT-PCR檢測

以提取的病樣dsRNA為模板,用XTN269引物反轉(zhuǎn)錄獲得病毒cDNA,再利用XTN177引物進行SIA檢測,反應(yīng)體系和程序參照牛顏冰等[10]的方法。明確芹菜病毒病原后,根據(jù)NCBI上已收錄的BPEV分離物保守區(qū)設(shè)計特異引物對病毒部分序列進行RT-PCR擴增,同時以健康植株為陰性對照。所使用的隨機引物序列與特異引物序列見表1。

表1PCR擴增所用引物序列

Table1SequencesofprimerpairsusedforSIAandRT-PCRamplification

引物名稱Primername引物序列(5′?3′)Primersequence(5′?3′)XTN269AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGNNNNNNXTN177AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGBPEV?FTGGTCACGAAACGGTATTGABPEV?RTTTGTAGCAAGGGGTGCTCT

1.2.3 PCR產(chǎn)物克隆及序列分析

PCR產(chǎn)物純化回收后進行連接和轉(zhuǎn)化,隨機選取3個經(jīng)菌落PCR鑒定為陽性的克隆進行測序。測序結(jié)果利用NCBI中的BLAST檢索同源序列;序列相似性采用DNAMAN 6.0軟件進行分析;利用MEGA 5.2軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品SIA檢測結(jié)果

以XTN177為引物,以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板進行SIA擴增,得到大小為799 bp的片段,而健康樣品未擴增出相應(yīng)大小的條帶(圖2)。測序結(jié)果經(jīng)BLAST同源性比較發(fā)現(xiàn)其與已報道的BPEV分離物的相似性最高,為80.0%～97.8%,初步證明芹菜被BPEV所侵染,并將其命名為BPEV-QC。

圖2 芹菜病樣SIA擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoresis of SIA products of diseased Apium graveolens leaves

2.2 樣品RT-PCR檢測

為進一步確定侵染芹菜的病毒病原,以cDNA為模板,以BPEV-F/BPEV-R為引物進行特異性擴增,獲得大小為1 092 bp的目的片段(圖3),而健康樣品中未擴增出相應(yīng)大小的片段,說明引起芹菜皺縮癥狀的病毒為BPEV。

2.3 BPEV-QC與內(nèi)源RNA病毒科其他分離物的序列相似性

利用DNAMAN 6.0軟件對BPEV-QC分離物和其他13個內(nèi)源RNA病毒科分離物(表2)進行核苷酸序列同源性分析,結(jié)果表明分離物BPEV-QC與其他內(nèi)源RNA病毒分離物的核苷酸同源性在30.6%～97.8%之間,其中與BPEV分離物IS、Maor、Kyosuzu、BPEV、lj、BPEV-YW的同源性較高,在80.0%～97.8%之間,與來自以色列IS的同源性最高,為97.8%,與來自美國的BPEV-YW同源性最低,為80.0%,而與其他內(nèi)源RNA病毒科分離物同源性比較低,為30.6%～37.6%。

圖3 芹菜病樣RT-PCR檢測結(jié)果Fig.3 Electrophoresis of RT-PCR products of Apium graveolens leaves

表2 BPEV-QC與已報道的13個內(nèi)源RNA病毒分離物核苷酸同源性比較1)

1) “-”表示未知。 “-” unknown.

2.4 BPEV-QC系統(tǒng)進化分析

為進一步明確BPEV-QC的起源與進化關(guān)系,使用MAGE 5.2軟件對該分離物和已報道的其他13個來源不同的內(nèi)源RNA病毒科分離物構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖4)。從系統(tǒng)進化樹中可以看出,BPEV-QC與其他BPEV分離物(IS、Maor、Kyosuzu、BPEV、lj)形成一個大的分支,聚為一簇,這進一步說明BPEV-QC屬于BPEV分離物。

3 討論

植物病毒素稱植物“癌癥”,作為傘形科蔬菜的主要病害之一,常常導(dǎo)致芹菜產(chǎn)量降低和品質(zhì)變劣。筆者2014年對山西晉中地區(qū)芹菜進行病害調(diào)查時發(fā)現(xiàn)田間病毒病害發(fā)生較為普遍,部分田塊病株率甚至高達(dá)70%。為明確其具體病毒病原,本研究利用雙鏈RNA技術(shù)和SIA檢測方法對芹菜病株進行了分子鑒定,發(fā)現(xiàn)感病芹菜受到甜椒內(nèi)源RNA病毒的侵染,該結(jié)果為芹菜病毒病害的有效防治提供了一定的依據(jù)。

內(nèi)源RNA病毒自第一次從蠶豆中發(fā)現(xiàn)以來,其寄主范圍在不斷擴大,包括植物[11]、真菌[12]和卵菌等。內(nèi)源RNA病毒的基因組大小在9.8～17.6 kb之間[13-14],能獨立于宿主的基因進行復(fù)制[15]。內(nèi)源RNA病毒屬Endornavirus是國際病毒分類委員會(ICTV)于2005年7月第八次病毒分類報告中新增的屬,其代表種是蠶豆內(nèi)源RNA病毒[16-17],2012年第九次病毒分類報告中將其升級為內(nèi)源RNA病毒科Endornaviridae[18],2016年國際病毒分類委員會又將Endornaviridae劃分為Alphaendornavirus和Betaendornavirus兩個屬(https://talk.ictvonline.org/taxonomy/)。甜椒內(nèi)源RNA病毒是Alphaendornavirus屬的一個重要成員，其編碼的蛋白從N端到C端依次為病毒的甲基轉(zhuǎn)移酶、解旋酶、UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶和依賴RNA的RNA聚合酶[19]。

圖4 BPEV-QC與已報道的其他13個內(nèi)源RNA病毒分離物系統(tǒng)進化樹構(gòu)建Fig.4 Phylogenetic tree of BPEV-QC and other 13 reported Endornaviridae isolates

大多數(shù)內(nèi)源RNA病毒對宿主不引起任何病癥[13]。在一般情況下,低拷貝數(shù)的內(nèi)源RNA病毒在植物宿主中依然可以通過種子高速率傳播[20-21]。然而,Ikeda等發(fā)現(xiàn)HmEV1是植物的弱毒力因子[22]。Osaki等發(fā)現(xiàn)VfEV與蠶豆雄性不育相關(guān)[23]?，F(xiàn)報道的BPEV宿主絕大部分為辣椒,Jo等通過辣椒轉(zhuǎn)錄組拼接出BPEV全長和部分片段,同時進行重組分析預(yù)測出BPEV-YW在4 852～5 363之間插入了Maor的部分片段[24]。本研究在芹菜上發(fā)現(xiàn)了BPEV,是否是由于重組導(dǎo)致侵染芹菜,還需進一步研究。

本研究從具有皺縮癥狀的芹菜中得到甜椒內(nèi)源RNA病毒山西芹菜分離物(BPEV-QC),利用部分?jǐn)U增序列進行了同源性比較和系統(tǒng)進化分析,發(fā)現(xiàn)BPEV-QC與BPEV IS、Maor、Kyosuzu、BPEV、lj、BPEV-YW分離物的同源性在80.0%～97.8%之間,而與其他內(nèi)源RNA病毒科分離物同源性較低,為30.6%～37.6%;系統(tǒng)進化分析表明BPEV-QC與BPEV IS、Maor、Kyosuzu、BPEV、lj分離物形成一個獨立分支,親緣關(guān)系最近。但本試驗的結(jié)果是基于BPEV-QC部分序列的比較,無法精確地確立其種屬分類地位和變異進化關(guān)系,要想獲得更全面的基因信息,還需進一步擴增其全長序列,明確其具體的基因組結(jié)構(gòu),進而研究其致病機理和病害流行規(guī)律。

[1] 夏俊強, 王清和, 嚴(yán)敦余, 等. 引起芹菜花葉的一個病毒分離物[J]. 上海農(nóng)業(yè)學(xué)報, 1986, 2(1): 53-58.

[2] 王述杉, 濮祖芹. 南京芹菜病毒病毒源鑒定[J]. 上海農(nóng)業(yè)學(xué)報, 1993, 9(3): 76-82.

[3] Xu Donglin, Liu H Y, Koike S T, et al. Biological characterization and complete genomic sequence ofApiumvirusY infecting celery [J]. Virus Research, 2011, 155(1): 76-82.

[4] Marco S.Occurrence and incidence ofCucumbermosaicvirusandAlfalfamosaicviruson celery in Israel [J]. Plant Disease Reporter, 1975, 59(11): 915-917.

[5] Hollings M. Some properties of five viruses of celery (ApiumgraveolensL.) in Britain [J]. Journal of Horticultural Science, 1964, 39: 130-142.

[6] Tzanetakis I E, Martin R R. A new method for extraction of double-stranded RNA from plants[J]. Journal of Virological Methods, 2008, 149(1): 167-170.

[7] 牛顏冰,時曉麗,趙慧琪, 等.白術(shù)矮化病毒病病原的分子鑒定和部分序列分析[J].植物病理學(xué)報,2014,44(4):357-362.

[8] 牛顏冰, 王德富, 姚敏, 等. 侵染苘麻的煙草花葉病毒鑒定[J]. 植物保護學(xué)報, 2011, 38(2): 187-188.

[9] 牛顏冰, 姚敏, 王德富, 等. 臭椿病毒病病原鑒定[J]. 植物病理學(xué)報, 2011, 41(4): 437-440.

[10] 牛顏冰, 時曉麗, 張西梅, 等. 侵染白術(shù)的蠶豆萎蔫病毒2號的分子檢測與序列分析[J]. 病毒學(xué)報, 2015, 31(1): 58-64.

[11] Fukuhara T, Koga R, Aoki N, et al. The wide distribution of endornaviruses, large double-stranded RNA replicons with plasmid-like properties [J]. Archives of Virology, 2006, 151(5): 995-1002.

[12] Roossinck M J. Lifestyles of plant viruses [J]. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences, 2010, 365(1548): 1899-1905.

[13] Okada R, Kiyota E, Sabanadzovic S, et al.Bellpepperendornavirus: molecular and biological properties, and occurrence in the genusCapsicum[J]. Journal of General Virology, 2011, 92: 2664-2673.

[14] Okada R, Kiyota E, Moriyama H, et al. A new endornavirus species infecting Malabar spinach (BasellaalbaL.)[J]. Archives of Virology, 2014, 159(4): 807-809.

[15] Urayama S, Moriyama H, Aoki N, et al. Knock-down of OsDCL2 in rice negatively affects maintenance of the endogenous dsRNA virus,Oryzasativaendornavirus[J]. Plant Cell Physiology, 2010, 51(1): 58-67.

[16] Fauquet C M, Mayo M A, Maniloff J, et a1. Virus taxonomy: Eighth report of the international committee on taxonomy of viruses [M]. San Diego: Elsevier Academic Press, 2005.

[17] 洪健, 周雪平. ICTV第八次報告的最新植物病毒分類系統(tǒng)[J]. 植物病理學(xué)報, 2005, 35(6): 1-9.

[18] 張忠信. ICTV第九次報告對病毒分類系統(tǒng)的一些修改[J]. 病毒學(xué)報, 2012, 28(5): 595-599.

[19] Song D, Cho W K, Park S H, et al. Evolution of and horizontal gene transfer in theEndornavirusgenus [J].PLoS ONE, 2013, 8(5): 8750.

[20] Horiuchi H, Fukuhara T. Putative replication intermediates inEndornavirus, a novel genus of plant dsRNA viruses [J]. Virus Genes, 2004, 29(3): 365-375.

[21] Valverde R A, Gutierrez D L. Transmission of a dsRNA in bell pepper and evidence that it consists of the genome of anEndornavirus[J]. Virus Genes, 2007, 35(2): 399-403.

[22] Ikeda K I, Nakamura H, Matsumoto N. Hypovirulent strain of the violet root rot fungusHelicobasidiummompa[J]. Journal of General Plant Pathology, 2004, 69(2): 385-390.

[23] Osaki H, Nakamura H, Sasaki A, et al. Anendornavirusfrom a hypovirulent strain of the violet root rot fungus,Helicobasidiummompa[J]. Virus Research, 2006, 118(1/2): 143-149.

[24] Jo Y, Choi H, Yoon J Y, et al. In silico identification ofBellpepperendornavirusfrom pepper transcriptomes and their phylogenetic and recombination analyses [J]. Gene, 2015, 575(3): 712-717.

(責(zé)任編輯： 楊明麗)

DetectionandsequenceanalysisofBellpepperalphaendornavirusinfectingApiumgraveolens

Zhao Xinghua1, Yu Peixia2, Chen Lijun2, Wang Defu2, Niu Yanbing2

(1.HorticulturalStationofJiyuanAgriculturalandAnimalHusbandryBureauinHenanProvince,Jiyuan459000,China;2.CollegeofLifeSciences,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China)

Viral pathogen that causedApiumgraveolenswrinkled disease, was identified by double-stranded RNA (dsRNA) extraction and sequence-independent amplification (SIA). The results of SIA and sequencing showed thatA.graveolenswas infected byBellpepperalphaendornavirus(BPEV). To further characterize the BPEV strain fromA.graveolens(BPEV-QC), specific primer pairs were designed for RT-PCR according to the results of SIA.Sequence alignments showed that BPEV-QC shared high homology (80.0%-97.8%) with BPEV isolates (IS, Maor, Kyosuzu, BPEV, lj, BPEV-YW), but shared low homology (30.6%-37.6%) with otherEndornaviridaeisolates, Phylogenetic analysis based on nucleotide sequences of BPEV-QC and otherEndornaviridaeisolates showed that BPEV-QC was most closely related toEndornaviridaeisolates (IS, Maor, Kyosuzu, BPEV, lj), and these isolates formed an independent branch.

Apiumgraveolens; pathogen identification;Bellpepperalphaendornavirus; sequence analysis

研究簡報ResearchNotes

S 436.3

： ADOI： 10.3969/j.issn.0529-1542.2017.05.023

2016-10-25

： 2017-01-10

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201303028); 國家自然科學(xué)基金(31540050)

* 通信作者 E-mail: niuyanbingbest@163.com