巴西橡膠樹HbCCoAOMT基因克隆及其表達分析

晁金泉　陳月異　楊署光　田維敏

摘 要 木質(zhì)素是植物細胞壁的成分之一，其含量高低影響到細胞壁的彈性。橡膠樹乳管膨壓是割膠后膠乳排出的初動力，乳管細胞壁的物理性能可能是影響乳管膨壓的因素之一。本研究采用QRT-PCR和RACE技術(shù)， 從巴西橡膠樹無性系CATAS7-33-97的乳管細胞中克隆到一個木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶CCoAOMT基因的同源基因，命名為HbCCoAOMT。該基因的開放閱讀框為741 bp，編碼1個由246個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)分子量為27.76 ku，理論等電點為5.255。實時熒光定量PCR結(jié)果表明， 割膠和乙烯利處理均下調(diào)HbCCoAOMT基因在膠乳中的表達。該基因的表達量以及內(nèi)層樹皮的木質(zhì)素含量在兩個橡膠樹品種（CATAS8-79和PR107）間存在顯著差異。HbCCoAOMT差異表達可能影響到乳管細胞木質(zhì)素含量和乳管細胞壁的物理性能。

關(guān)鍵詞 橡膠樹；HbCCoAOMT；乳管細胞壁；乳管膨壓；木質(zhì)素

中圖分類號 S794.1 文獻標識碼 A

木質(zhì)素是一類由香豆醇、松柏醇和芥子醇等單體聚合而成的多酚類物質(zhì)，是植物體內(nèi)一種主要的天然代謝產(chǎn)物，廣泛存在于維管植物次生結(jié)構(gòu)中，對維持植物組織的硬度和剛性有著重要的意義[1-2]?？Х弱］o酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（CCoAOMT）屬于植物甲基轉(zhuǎn)移酶類，是木質(zhì)素生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，在木質(zhì)素合成時以咖啡酰輔酶A為底物，將S-腺苷甲硫氨酸上的甲基基團轉(zhuǎn)移到木質(zhì)素單體的苯環(huán)碳3位置上，形成阿魏酰輔酶A[3]。CCoAOMT的氨基酸序列具有A，B，C，D，E，F(xiàn)，G，H共8個保守序列元件，其中A， B和C元件是植物甲基化酶所共有的序列，而D，E，F(xiàn)，G和H元件為CCoAOMT特有[4]。作為木質(zhì)素合成途徑的關(guān)鍵酶，CCoAOMT的活性變化將直接調(diào)控木質(zhì)素單體的合成，改變木質(zhì)素在植物細胞壁中所占的比例，進而影響植物次生結(jié)構(gòu)的強度[5-7]。

橡膠是一種重要的工業(yè)原材料，在國計民生中起著重要作用。目前世界上90%以上的天然橡膠均來源于巴西橡膠樹。橡膠樹樹皮內(nèi)層中的次生乳管細胞是天然橡膠合成和貯存的場所[8]。通過切割乳管使膠乳流出到乳管末端堵塞物形成導(dǎo)致排膠停止這一時間段被稱為排膠的持續(xù)時間，與天然橡膠產(chǎn)量呈顯著正相關(guān)[9]。次生乳管是由乳管細胞彼此連通形成的一種特化組織，保持約8～12個大氣壓的膨壓[10]。在割膠后，乳管膨壓作為膠乳排出的初動力，是影響排膠時間的重要內(nèi)在因子[11]。目前人們主要從排膠動力和排膠阻力對排膠機制進行研究[12-15]。在排膠阻力方面，主要是探究橡膠凝集的機理，如Shi等[14]鑒定出C乳清中的Hevb7是膠乳中重要的抗凝集因子；在排膠動力方面，主要是解析乳管膨壓形成的生理和分子機制，如An等[15]克隆了與膨壓形成相關(guān)的水通道蛋白HbPIP2；3，并發(fā)現(xiàn)其在高產(chǎn)品種CATAS8-79中的表達量要遠遠高于PR107，但對于乳管細胞壁的物理性能對乳管膨壓的影響尚未有報道。在本研究中，筆者從乳管細胞中克隆了一個木質(zhì)素合成途徑關(guān)鍵基因的同源基因HbCCoAOMT，分析了割膠和乙烯利刺激對該基因表達的影響，以及該基因在排膠時間有顯著差異的兩個橡膠樹品種（CATAS8-79和PR107）間的表達模式與內(nèi)層樹皮木質(zhì)素含量的相關(guān)性，初步揭示該基因的差異表達可能是影響乳管細胞壁木質(zhì)素含量和乳管膨壓的因素之一。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗用樹 實驗材料為種植于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗場的割齡為3 a的巴西橡膠樹無性系CATAS7-33-97、CATAS8-79和PR107，以及CATAS7-33-97的未開割樹。

1.1.2 菌株及試劑 Escherichia coli DH10B菌株由本實驗室保存。植物總RNA提取試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas公司；克隆載體pEASY-Blunt Simple Cloning Vector購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；QRT-PCR熒光染料試劑SYBR Ⅱ premix購自TaKaRa公司；引物合成和測序由Invitrogen公司（上海）完成；其他生化試劑和常規(guī)試劑均為進口或國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 材料處理 割膠處理選用樹圍一致的CATAS7-33-97的未開割樹和開割樹單株，采用二分之一樹圍割制（S/2）冰上收集膠乳保存于液氮用于RNA的提取。乙烯利處理選用割齡為3 a的CATAS7-33-97開割樹，選樹圍一致的單株，于割膠前2 d用0.5%乙烯利涂抹于割線及其上部約2 cm的割面，采用二分之一樹圍割制（S/2）冰上收集膠乳保存于液氮用于RNA的提取。木質(zhì)素含量測定選取樹圍一致的CATAS8-79和PR107開割樹單株，用打孔器取離地面1.2 m處樹皮內(nèi)層樣品，液氮保存。另外選取樹圍一致的CATAS8-79和PR107開割樹單株，采用二分之一樹圍割制（S/2）冰上收集膠乳保存于液氮用于RNA的提取。每種實驗處理設(shè)3次重復(fù)，每個重復(fù)為等量混合3株樹樣品。

1.2.2 總RNA提取與cDNA合成 橡膠樹RNA的提取參照RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒的操作說明進行。cDNA第一鏈的合成使用Fementas公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit），按照公司操作說明進行。

1.2.3 HbCCoAOMT基因的RACE擴增和全長cDNA擴增 從課題組前期膠乳轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中得到一段與CCoAOMT高度同源的Unigene30660片段，開放閱讀框分析顯示該序列含有5′UTR序列[9]。根據(jù)序列設(shè)計3′-RACE引物（3′-RACE-F： CCC AGG ATT GAG ATT TGC ATG，3′-RACE-R： TAC GTT TTT TTT TTT TT），采用Clontech公司Smarter TMRACE cDNA Amplification Kit試劑盒進行3′端序列的克隆。經(jīng)DNAMAN 5.22軟件對3′端序列與Unigene30660序列進行拼接獲取HbCCoAOMT基因的全長序列（GenBank：KU301753）。以Primer Premier 5軟件設(shè)計全長序列的PCR引物進行擴增驗證。引物序列為：HbCCoAOMT-F（ATG GCT TCC AAC AAT GAA CAG）和HbCCoAOMT-R（TCA CTT GAT CCG ACG GCA GAG A）。50 μL擴增體系中含cDNA 1 μL、2×TaKaRa PrimeSTAR Max Premix緩沖液25 μL、上下游引物（25 μmol/L）各2 μL及ddH2O 20 μL。PCR程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸 1.5 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠分離后經(jīng)天根生物技術(shù)有限公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化目的條帶，克隆到全式金公司的pEASY-Blunt Simple Cloning Vector載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞并挑取陽性菌株送Invitrogen公司（上海）測序。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 利用NCBI在線軟件ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）進行開放閱讀框預(yù)測；采用DNAMAN 5.22軟件對HbCCoAOMT基因翻譯及多序列比對；利用WoLF PSORT在線軟件（http：//www.genscript.com/wolf-psort.html）進行推導(dǎo)蛋白的亞細胞定位預(yù)測；利用ProtParam在線軟件（http：//web.expasy.org/protparam/）進行推導(dǎo)蛋白的分子量與等電點預(yù)測；從NCBI數(shù)據(jù)庫下載其他植物的CCoAOMT蛋白序列，利用軟件MEGA4.0以Neighbor Joining（NJ）模型進行1 000次boot-strap統(tǒng)計學(xué)檢驗構(gòu)建CCoAOMT蛋白系統(tǒng)進化樹。

1.2.5 實時熒光定量PCR分析 采用Bio-Rad公司的CFX96實時熒光定量PCR系統(tǒng)進行HbCCoAOMT基因的相對定量表達分析。以合成好的cDNA第一鏈稀釋10倍后作為熒光定量PCR分析的模板。HbCCoAOMT熒光定量引物為QPCR-HbCCoAOMT-F（GAA CCC ATG AAG GAG C）和QPCR-HbCCoAOMT-R（GGA AGA GCA AGA GCA G）。內(nèi)參選取本課題組前期優(yōu)化的橡膠樹穩(wěn)定內(nèi)參HbUBC2b[16]，引物序列為：QPCR-HbUBC2b-F（CGA CCA AGT TTT CAT TTC GGG TG）和QPCR-HbUBC2b-R（AGT CTC TTC TTT GCT GGG GTT G）。20 μL擴增體系中含cDNA 1 μL、2×TaKaRa SYBR Premix Ex Taq TMⅡ 10 μL、上下游引物（25 μmol/L）各1 μL及ddH2O 7 μL。QRT-PCR程序為：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性 10 s，60 ℃復(fù)性20 s，72 ℃延伸20 s，共40個循環(huán)。利用CFX manager 3.0軟件自動進行基線和Cq值分析。以HbUBC2b作為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct算法分析相對表達量。

1.2.6 橡膠樹樹皮內(nèi)層木質(zhì)素含量測定 木質(zhì)素含量測定采用乙酰溴法[17]。將保存于液氮中的CATAS8-79和PR107樹皮內(nèi)層材料研磨成粉狀，70 ℃烘箱干燥至恒重。各取5 mg干粉加入5 mL 30%乙酰溴（冰醋酸配制）和0.69 mol/L的高氯酸，封蓋后置于70 ℃水浴1 h，而后加入10 mL 2 mol/L的NaOH和10 mL冰醋酸終止反應(yīng)，并用冰醋酸定容至50 mL。以冰醋酸為空白對照，在OD=280 nm處測其吸光值，根據(jù)木質(zhì)素回歸曲線[17]計算所測樣品中木質(zhì)素含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 HbCCoAOMT基因的克隆及生物信息學(xué)分析

通過3′-RACE方法及測序從橡膠樹無性系CATAS7-33-97膠乳中得到1條長236 bp的片段，經(jīng)DNAMAN將其與Unigene30660拼接后獲得1條包含橡膠樹HbCCoAOMT基因完整開放閱讀框的cDNA序列（KU301753）。該序列長度為973 bp，含有1個741 bp的開放閱讀框，5′端非翻譯區(qū)為62 bp，3′端非翻譯區(qū)為170 bp（圖1）。ProtParam tool軟件預(yù)測該基因編碼了1個由246個氨基酸殘基組成的蛋白，其分子量大小約為27.76 ku，理論等電點為5.255，屬于弱堿性蛋白。亞細胞定位預(yù)測結(jié)果顯示HbCCoAOMT蛋白定位于細胞質(zhì)中。

2.2 HbCCoAOMT推導(dǎo)的氨基酸序列比對及進化樹構(gòu)建

序列相似性分析結(jié)果表明HbCCoAOMT蛋白序列與蓖麻RcCCoAOMT（XP_002518739.1）、棉花GhCCoAOMT（ACF48821.1）、楊樹PeCCoAOMT（XP_

011000746.1）、油菜BrCCoAOMT（XP_009138259.1）、馬鈴薯StCCoAOMT（XP_006339880.1）蛋白相似性分別為92%、90%、90%、87%和86%（圖2），均含有CCoAOMT蛋白所特有A，B，C，D，E，F(xiàn)，G，H結(jié)構(gòu)元件。

為研究橡膠樹HbCCoAOMT與其他CCoAOMT蛋白在進化上的關(guān)系，選取葡萄[18]、煙草[19]、野茶樹[20]、苜蓿[21]、黃麻[22]、玉米[6]、擬南芥[23]、輻射松[5]等8個物種的CCoAOMT蛋白序列，利用Mega 6.06軟件，采用Neighbor-Joining，進行1 000次 bootstrap統(tǒng)計學(xué)檢驗構(gòu)建進化樹（圖3）。聚類結(jié)果表明植物CCoAOMT蛋白家族可分為兩個亞類（Ⅰ和Ⅱ），其中橡膠樹與葡萄、煙草、野茶樹、苜蓿歸為Ⅰ亞類，并且與苜蓿的同源蛋白MsCCoAOMT親緣關(guān)系最近（圖3）。

2.3 割膠和乙烯利處理對HbCCoAOMT基因表達的影響

割膠是獲取天然橡膠的唯一方式[10]。QRT-PCR結(jié)果表明HbCCoAOMT基因在開割樹膠乳中的相對表達量僅為未開割樹膠乳中的八分之一（圖4-A），說明割膠可顯著抑制HbCCoAOMT基因表達。乙烯利是一種乙烯釋放劑，生產(chǎn)上可顯著延長排膠時間達到增產(chǎn)的目的[24]。本研究發(fā)現(xiàn)施用乙烯利可顯著下調(diào)HbCCoAOMT基因的表達，其相對表達量僅為對照組的一半（圖4-B）。

2.4 不同橡膠樹品種HbCCoAOMT基因的表達量與木質(zhì)素含量測定

分別測定排膠時間長的橡膠樹品種CATAS8-79和排膠時間短的橡膠樹品種PR107膠乳中HbCCoAOMT基因的表達量以及其樹皮內(nèi)層的木質(zhì)素含量。結(jié)果表明CATAS8-79的HbCCoAOMT基因表達量（圖5-A）以及木質(zhì)素含量（圖5-B）均顯著低于PR107。

3 討論

植物細胞膨壓是細胞吸水對細胞壁產(chǎn)生的壓力，對于保持細胞的緊張度，維持植物體正常的生命活動有著重要的生理學(xué)意義[25]。根據(jù)細胞壁體積彈性模量學(xué)說，細胞壁的可塑性越大表明細胞壁越柔軟，維持的膨壓越高；相反細胞壁越堅硬，膨壓也就越低[26]。木質(zhì)素是植物細胞壁的成分之一，其含量高低與細胞壁的可塑性負相關(guān)，影響植物生長。Zhang等[27]對白樺的木質(zhì)素合成關(guān)鍵基因BpCCR干涉后發(fā)現(xiàn)，與對照相比，轉(zhuǎn)基因株系的木質(zhì)素含量顯著下降，但生長速度卻得到了明顯提高，這可能是由于木質(zhì)素含量降低增強了細胞壁的可塑性，利于細胞膨大。謝兆森等[28]研究表明在葡萄的第1次快速生長期內(nèi)果肉細胞膨壓快速升高，這一過程伴隨著維管束結(jié)構(gòu)大量消失，認為木質(zhì)素減少導(dǎo)致的細胞壁延伸性增強是葡萄果實急劇膨大的原因所在。在天然橡膠生產(chǎn)中，割膠后的排膠持續(xù)時間是影響天然橡膠產(chǎn)量的重要因素之一。不同橡膠樹品種間排膠持續(xù)時間有明顯差異，并且割膠和施用乙烯利均可顯著延長排膠時間，進而達到增產(chǎn)的目的[9-10，24]。作為膠乳排出的初動力，人們長期以來對于乳管膨壓的認識僅僅停留在水份進出乳管細胞以及割膠后的傷口阻礙方面[12-13，15，29]，而忽視了次生乳管細胞壁的物理性能在其中的作用。

本研究從橡膠樹膠乳中克隆了一個編碼木質(zhì)素合成途徑關(guān)鍵酶CCoAOMT的基因的同源基因HbCCoAOMT。氨基酸序列分析表明，HbCCoAOMT具有典型的CCoAOMT家族保守結(jié)構(gòu)域，其中A，B，E，F(xiàn)，G，H元件在不同成員間保守性較高，而C和D元件保守性較差，這可能與物種特異性有關(guān)。系統(tǒng)發(fā)生樹分析表明HbCCoAOMT屬于植物CCoAOMT家族I亞類，與來自苜蓿的同源蛋白MsCCoAOMT親緣關(guān)系最近。在苜蓿中，抑制MsCCoAOMT基因的表達可顯著降低木質(zhì)素的含量，并且通過降低G型木質(zhì)素單體進而改變G/S木質(zhì)素比例[21]。割膠和乙烯利刺激均可顯著延長橡膠樹的排膠持續(xù)時間[10，24]。在排膠動力方面，主要認為乙烯利刺激的這種效應(yīng)與調(diào)節(jié)水通道蛋白有關(guān)[15]。在排膠阻力方面，以往認為乙烯利刺激的這種效應(yīng)與提高黃色體的穩(wěn)定性有關(guān)[24]。但最近研究證明，這種效應(yīng)與膠乳C-乳清中的一種Hevb7蛋白有關(guān)。該蛋白可抑制橡膠粒子與黃色體膜碎片和B-乳清中的蛋白結(jié)合，從而延緩乳管傷口堵塞[14]。在本研究中，發(fā)現(xiàn)割膠和乙烯利刺激均可顯著下調(diào)HbCCoAOMT基因的表達，這可能導(dǎo)致乳管細胞壁的木質(zhì)素含量降低，進而降低乳管細胞壁剛性，維持較高的乳管膨壓，增大排膠的初動力。橡膠樹品種CATAS8-79和PR107在排膠持續(xù)時間上存在顯著差異，前者的排膠持續(xù)時間顯著長于后者[9]。An 等[26]利用實時膨壓測定儀測定了兩者的樹干樹皮膨壓，證明CATAS8-79的乳管膨壓要明顯高于PR107。本研究表明，HbCCoAOMT在CATAS8-79膠乳中的表達量顯著低于PR107，并且CATAS8-79樹皮內(nèi)層的木質(zhì)素含量也顯著低于PR107。這些結(jié)果表明HbCCoAOMT差異表達可能與乳管細胞木質(zhì)素含量差異有關(guān)，是影響乳管細胞壁的物理性能和乳管細胞膨壓的因素之一。

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