一種快速微量化測(cè)定蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶活性的方法及其初篩應(yīng)用

何燦+周易+葛曦雨+曲瑞丹+嚴(yán)文娟+王文君+高紅亮+黃靜

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.13.044

摘要：通過對(duì)苯酚-次氯酸鹽法（試管體系）反應(yīng)體系微量化，借助酶標(biāo)儀動(dòng)態(tài)檢測(cè)96孔板中蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶與底物產(chǎn)生氨的最大速度Δmaxv，對(duì)于不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)PG樣品與不同酶活的發(fā)酵液，Δmaxv與酶活間呈顯著正相關(guān)（r=0.999、r=0.890），故用Δmaxv代替酶活進(jìn)行快速測(cè)定。選用96孔板作為快速測(cè)量體系，標(biāo)準(zhǔn)PG樣品與發(fā)酵液在96孔板內(nèi)部60孔中Δmaxv變異系數(shù)分別為10%、18%。利用該方法進(jìn)行亞硝酸鈉（nitrite，NIT）誘變初篩，0.6 mg/mL 的NIT處理109 CFU/mL菌液20 min，涂板后篩選400株菌株樣本，利用該方法最終得到1株是出發(fā)菌株酶活1.825倍且穩(wěn)定性良好的菌株，可繼續(xù)作為出發(fā)菌株應(yīng)用于后續(xù)誘變篩選工作中。該方法可以準(zhǔn)確、快速地提高誘變初篩的效率，為以后的育種工作奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：苯酚-次氯酸鹽法；快速微量化；Δmaxv；蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶

中圖分類號(hào)： TS201.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A[HK]

文章編號(hào)：1002-1302（2017）13-0153-04[HS）][HT9.SS]

收稿日期：2016-01-28

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31170920）；大夏大學(xué)生科研基金項(xiàng)目（編號(hào)：2014DX-333）。

作者簡(jiǎn)介：何燦（1992—），女，安徽六安人，碩士研究生，主要從事食品微生物研究。E-mail：hc13524170366@163.com。

通信作者：黃靜，博士，副教授，主要從事食品微生物研究。E-mail：jhuang@ecnu.bio.edu.cn。

[ZK）]

植物蛋白如大豆蛋白、小麥蛋白和玉米蛋白等在食品工業(yè)中應(yīng)用非常廣泛。但由于大部分植物蛋白在弱酸性環(huán)境中（大多數(shù)食品系統(tǒng)的pH范圍）存在溶解性差、穩(wěn)定性低的問題，造成其應(yīng)用范圍受到了限制[1]。采用蛋白質(zhì)脫酰胺法對(duì)植物蛋白進(jìn)行改性，增強(qiáng)其相關(guān)功能特性，擴(kuò)大其在食品領(lǐng)域的應(yīng)用是目前熱門的研究方向[1-3]。蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶（protein-glutaminase，PG）是一種能夠催化L-β-谷氨酰胺殘基，生成L-谷氨酸和氨的酶，并且對(duì)于天冬酰胺殘基以及游離的谷氨酰胺殘基的酰胺鍵沒有作用[4]，相比較于谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶以及肽谷氨酰胺酶具有無蛋白交聯(lián)、無副作用等優(yōu)點(diǎn)[5]。目前PG已應(yīng)用到小麥蛋白、米谷蛋白、麥麩蛋白等多種蛋白的改性試驗(yàn)中，試驗(yàn)結(jié)果證明其可明顯地增強(qiáng)蛋白質(zhì)脫酰胺程度[6]。

2000年Yamaguchi等從解朊金黃桿菌（Chryseobacterium proteolyticum）9670T中首次發(fā)現(xiàn)了PG[7]。由于產(chǎn)PG的菌株稀少，世界上對(duì)PG的研究主要為該酶的結(jié)構(gòu)和應(yīng)用[8]。近年來，華東師范大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室致力于產(chǎn)PG菌種研究，從全國(guó)各地土壤中一共篩選到9株產(chǎn)PG的細(xì)菌，經(jīng)鑒定，其中7株為產(chǎn)吲哚金黃桿菌（C.indologenes），1株為解朊金黃桿菌（C.proteolyticum），1株為黏金黃桿菌（C.gleum），其酶活大小在0.10～0.72 U/mL之間，其中2013年從四川省土樣中篩選分離到的1株能夠產(chǎn)生PG的解朊金黃桿菌Y8-10-1，經(jīng)鑒定與已被批準(zhǔn)可用于食品工業(yè)生產(chǎn)的菌株9670T為同一來源菌株，兩者酶活均為0.40 U/mL左右[9]，低酶活限制了其在工業(yè)生產(chǎn)中的大規(guī)模應(yīng)用。

筆者實(shí)驗(yàn)室欲通過化學(xué)誘變、紫外誘變等傳統(tǒng)育種方法，以Y8-10-1作為出發(fā)菌株得到高產(chǎn)PG菌株，但由于傳統(tǒng)誘變方法操作復(fù)雜、篩選樣本量大，并且由于國(guó)際通用的測(cè)定PG酶活的苯酚-次氯酸鹽方法[10-11]試管用量大、操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)等缺點(diǎn)難以在初篩過程中大規(guī)模應(yīng)用。因此，準(zhǔn)確、快速微量化測(cè)定PG酶活方法的建立在高通量篩選高產(chǎn)蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶過程中有著重要的意義。

本試驗(yàn)基于苯酚-次氯酸鹽方法，借助酶標(biāo)儀快速檢測(cè)功能，利用PG與底物反應(yīng)過程中產(chǎn)生氨的顯色反應(yīng)最大速率Δmaxv代替酶活，建立適合高通量篩選的96孔微孔板反應(yīng)體系，30 min可檢測(cè)60個(gè)以上的反應(yīng)，完全達(dá)到高通量篩選的要求[12]，并與苯酚-次氯酸鹽方法進(jìn)行比較以驗(yàn)證該方法的可行性。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1菌種產(chǎn)PG的解阮金黃桿菌Y8-10-1，由華東師范大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基（1 000 mL）：10 g多聚蛋白胨，2 g 酵母提取物，1 g MgSO4·7H2O，加ddH2O至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值至7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基（1 000 mL）：5 g乳糖，10 g多聚蛋白胨，1.7 g NaH2PO4·H2O，0.25 g K2HPO4，0.25 g MgSO4·7H2O，0.05 g FeSO4·7H2O，加ddH2O至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值至7.2。

1.1.3試劑與儀器

主要試劑：176 mmol/L PBS （pH值為 6.5）：（1）0.2 mol/L Na2HPO4溶液：稱取 71.6 g Na2HPO4·12H2O，用ddH2O定容到1 000 mL；（2）0.2 mol/L NaH2PO4溶液：稱取31.2 g NaH2PO4·2H2O，用ddH2O定容到 1 000 mL。取31.5 mL（1）溶液、68.5 mL（2）溶液，以及11364 mL ddH2O，混合均勻。

底物溶液（反應(yīng)液）：稱取0.337 g二肽Cbz-Gln-Gly，用176 mmol/L PBS（pH值為6.5）定容至100 mL。400 mmol/L CCl3COOH溶液（終止液）：稱取6.536 g CCl3COOH，用ddH2O定容至100 mL。顯色劑A：稱取 40.46 g 苯酚和0.15 g Na2Fe（CN）5NO2·H2O，用ddH2O定容至 1 000 mL。顯色劑B：稱取49.94 g KOH，用ddH2O定容至 1 000 mL。顯色劑C：稱取200.40 g K2CO3，加適量ddH2O溶解，待冷卻后加8.33 mL NaClO溶液，ddH2O定容至 1 000 mL。醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH值為4.5）：取18 g醋酸鈉，加9.8 mL冰醋酸，再加水定容至1 000 mL。NIT母液：稱取0.1 g NIT，溶于20 mL醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH值為45）。endprint

SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳：配制具有12%的分離膠和5%的濃縮膠，插10孔樣品梳，膠厚1.5 mm。標(biāo)準(zhǔn)PG樣品（50 U/g），購(gòu)自Amano公司；底物Cbz-Gln-Gly，購(gòu)自Sigama公司；大豆蛋白胨、多聚蛋白胨生化純，購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；酵母提取物，購(gòu)自安琪酵母股份有限公司；苯酚、硝普鈉、亞硝酸鈉（NIT）等常規(guī)試劑分析純，購(gòu)自上海潤(rùn)捷化學(xué)試劑公司。恒溫調(diào)速回旋式搖床DKY-Ⅱ，購(gòu)自上海杜科自動(dòng)化設(shè)備有限公司；Synergy HT多功能酶標(biāo)儀，購(gòu)自BioTek公司，Labofuge 400R水平離心機(jī)，購(gòu)自Thermo Scientific公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1苯酚-次氯酸鹽法測(cè)定PG酶活——試管法

參照國(guó)際通用的測(cè)定氨含量的苯酚次氯酸法[10-11]進(jìn)行PG酶活測(cè)定。

試驗(yàn)組：取100 μL酶樣品溶液加入試管中，向其中加入1 000 μL已在37 ℃水浴中預(yù)熱10 min的底物Cbz-Gln-Gly溶液，混合液在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中溫育30 min。然后加入1 000 μL的400 mmol/L CCl3COOH溶液，終止反應(yīng)。

對(duì)照組：取100 μL酶樣品溶液加入試管中，向其中加入1 000 μL已在37 ℃水浴中預(yù)熱10 min的400 mmol/L CCl3COOH溶液，混合液在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中溫育30 min。然后加入 1 000 μL 的底物Cbz-Gln-Gly溶液，混合均勻。

從每支試管中吸取120 μL溶液加入到新試管中，再加入480 μL蒸餾水，混合均勻，然后向試管中依次加入900 μL顯色劑A、450 μL顯色劑B和900 μL顯色劑C?；旌暇鶆蚝笾糜?7 ℃恒溫培養(yǎng)箱中溫育20 min，在酶標(biāo)儀630 nm下測(cè)定吸光度。

1個(gè)酶活單位定義為1 min催化底物生成1 μmol氨需要的酶量，根據(jù)以下公式計(jì)算蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶活力。

[JZ（][HT9.，8.]蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶活力=[SX（]（試驗(yàn)組氨含量-對(duì)照組氨含量）×[SX（]2.10.1[SX）]17.03×30×a[SX）][HT]。[JZ）]

式中：蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶活力單位為U/mL；[SX（]2.10.1[SX）]為反應(yīng)液與酶液的體積比；17.03為氨的相對(duì)分子質(zhì)量；30為反應(yīng)時(shí)間，min；a為氨標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。

1.2.2基于苯酚-次氯酸法測(cè)定PG Δmaxv——96孔板體系

1.2.2.196孔板體系測(cè)定PG Δmaxv

試驗(yàn)組：取10 μL酶樣品溶液加入孔中，向其中加入100 μL已在37 ℃水浴中預(yù)熱10 min的底物Cbz-Gln-Gly溶液，混合液在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中溫育15 min。

對(duì)照組：在之前的研究中發(fā)現(xiàn)，PG在80 ℃下溫育10 min后可完全失活[13]。故對(duì)照組取10 μL 80 ℃高溫失活的酶樣品溶液加入孔中，向其中加入100 μL已在37 ℃水浴中預(yù)熱10 min的底物Cbz-Gln-Gly溶液，混合液在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中溫育15 min。

每孔中加入60 μL顯色劑A、30 μL顯色劑B和60 μL顯色劑C顯色，在酶標(biāo)儀630 nm下測(cè)定顯色反應(yīng)吸光度 10 min，記錄試驗(yàn)組、對(duì)照組顯色反應(yīng)最大速度（maxv在酶標(biāo)儀中直接讀取）的差值Δmaxv。

1.2.2.2標(biāo)準(zhǔn)PG樣品的Δmaxv曲線

用176 mmol/L PBS（pH值為6.5）稀釋標(biāo)準(zhǔn)PG樣品至不同的濃度，使其酶活分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 U/mL，按照“1.2.2.1”節(jié)中的方法測(cè)定所有樣品顯色反應(yīng)的Δmaxv。

1.2.2.3Δmaxv在96孔板中變異系數(shù)的測(cè)定

將10 μL標(biāo)準(zhǔn)PG樣品與發(fā)酵液上清分別加入96孔板的所有孔中，按照“1.2.2.1”節(jié)中的方法測(cè)定所有孔中顯色反應(yīng)的Δmaxv，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)PG樣品與發(fā)酵液上清在96孔板中Δmaxv的變異系數(shù)。變異系數(shù)（CV）=標(biāo)準(zhǔn)差/平均值×100%。

1.2.2.4同一菌株不同發(fā)酵時(shí)間發(fā)酵液的Δmaxv與酶活相關(guān)性分析

將產(chǎn)PG的Y8-10-1菌株活化后接種2%進(jìn)行發(fā)酵，每隔2 h取樣，苯酚次氯酸法測(cè)定酶活并讀取發(fā)酵上清液顯色反應(yīng)的Δmaxv值，計(jì)算其與酶活的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳：取不同時(shí)間發(fā)酵液，10 000 r/min 離心5 min，取上清液，添加適量5×Loading buffer，沸水浴5 min后離心吸取上清液，采用5%濃縮膠以及12%分離膠進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。

1.2.3NIT誘變隨機(jī)誘變庫(kù)的建立

pH值為4.5的醋酸-醋酸鈉緩沖液稀釋NIT母液至NIT濃度為0.4、0.5、0.6、1.0 mg/mL。900 μL不同濃度的NIT溶液與100 μL Y8-10-1菌液（109 CFU/mL）充分反應(yīng)20 min后涂板。致死率=（未誘變平板菌落數(shù)-誘變后平板菌落數(shù)）/未誘變平板菌落數(shù)×100%；正突變率=酶活發(fā)生正突變的菌株數(shù)/發(fā)生突變的總菌株數(shù)×100%。

1.2.4誘變菌株Δmaxv值與酶活相關(guān)性分析

將NIT誘變得到的菌株，測(cè)其發(fā)酵液上清的酶活及顯色反應(yīng)的Δmaxv，并從中隨機(jī)選取菌株計(jì)算酶活與Δmaxv之間的相關(guān)系數(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1不同濃度PG標(biāo)準(zhǔn)品的酶活與Δmaxv的關(guān)系

將PG標(biāo)準(zhǔn)品（1.5 U/mL）稀釋不同倍數(shù)，結(jié)果如表1、圖1所示，可知，用PBS稀釋標(biāo)準(zhǔn)PG樣品不同的倍數(shù)，其不同的濃度對(duì)應(yīng)的酶活分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 U/mL，將不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)酶樣品進(jìn)行顯色反應(yīng)Δmaxv測(cè)定。結(jié)果顯示，隨著標(biāo)準(zhǔn)酶樣品酶活的增加，Δmaxv值也在不斷增加，并在酶活0～1.0 U/mL范圍內(nèi)，兩者呈高度正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.999，說明Δmaxv表征酶活的線性適用范圍為0～1.0 U/mL，若超過1.0 U/mL，可稀釋樣品再進(jìn)行測(cè)量。endprint

2.2在96孔板中顯色反應(yīng)Δmaxv變異系數(shù)的測(cè)定

96孔板在高通量菌株篩選中有著重要的地位，通過標(biāo)準(zhǔn)PG樣品與發(fā)酵液在96孔板中的顯色反應(yīng)Δmaxv測(cè)定，結(jié)果如圖2、圖3、圖4所示。標(biāo)準(zhǔn)PG樣品在96孔板上的顯色反應(yīng)Δmaxv變異系數(shù)為32%（圖2），并且邊緣孔對(duì)應(yīng)的數(shù)值均發(fā)生較大變異，說明該方法在使用過程中，96孔板在溫育時(shí)受熱不均勻，容易產(chǎn)生邊孔效應(yīng)[14]。使用96孔板內(nèi)部60孔測(cè)定相同30組標(biāo)準(zhǔn)PG樣品顯色反應(yīng)Δmaxv，變異系數(shù)為10%（圖3），測(cè)定相同30組發(fā)酵液上清，其顯色反應(yīng)Δmaxv的變異系數(shù)為18%（圖4），根據(jù)圖1中標(biāo)準(zhǔn)PG樣品的曲線，當(dāng)Δmaxv變化18%時(shí)，酶活變化幅度為20%以上，說明不同樣品的Δmaxv變異系數(shù)均在合理的范圍內(nèi)[15]，此方法每輪可篩選中酶活高于出發(fā)菌株20%的誘變株。結(jié)果表明，利用96[JP3]孔板內(nèi)部60孔進(jìn)行顯色反應(yīng)Δmaxv測(cè)定，可大大提高篩選通量。

2.3不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)Δmaxv測(cè)定的影響

由表2以及圖5可知，產(chǎn)PG的解阮金黃桿菌Y8-10-1隨[CM（25]著發(fā)酵時(shí)間的增長(zhǎng)，其酶活、蛋白量與Δmaxv均在增長(zhǎng)，在[CM）]

12 h時(shí)均達(dá)到最大值，這與前人研究中的試驗(yàn)結(jié)果[9]一致。

在發(fā)酵初期，該菌產(chǎn)酶活性很低，從SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果說明，PG在發(fā)酵6 h時(shí)已有明顯的目的蛋白條帶出現(xiàn)，Δmaxv測(cè)得數(shù)值為0.004，比4 h時(shí)有著明顯的提高，而苯酚-次氯酸法無法對(duì)6 h的發(fā)酵液進(jìn)行準(zhǔn)確的酶活測(cè)定，說明Δmaxv測(cè)定與苯酚-次氯酸法相比有著很高的靈敏性，并由圖6可知2種方法相關(guān)性很高，r=0.991。

2.3Δmaxv測(cè)定在NIT隨機(jī)誘變庫(kù)中的檢驗(yàn)

將該方法應(yīng)用于NIT誘變篩選中驗(yàn)證其準(zhǔn)確性，不同NIT濃度條件下的誘變結(jié)果如表3所示。

由表3可知，隨著NIT濃度從0.4 mg/mL增加至 1.0 mg/mL時(shí)，致死率不斷增加，當(dāng)NIT濃度為1.0 mg/mL時(shí)，致死率為99.99%，而正突變率的變化呈現(xiàn)了先增大后減小的趨勢(shì)。當(dāng)NIT濃度為0.6 mg/mL時(shí)，正突變率最大，為30.4%，此結(jié)果與前期試驗(yàn)中對(duì)產(chǎn)PG的金黃桿菌誘變基本相同。綜合考慮選擇NIT濃度為0.6 mg/mL的[JP2]條件進(jìn)行NIT化學(xué)誘變，并在建立條件過程中隨機(jī)選取酶活于0～1.0 U/mL [JP]范圍內(nèi)的30株菌株進(jìn)行酶活與Δmaxv相關(guān)性分析，結(jié)果如圖7所示。

將30株酶活0～1.0 U/mL范圍內(nèi)的菌株發(fā)酵液測(cè)定Δmaxv，測(cè)得的Δmaxv與苯酚次氯酸鹽反應(yīng)測(cè)定酶活結(jié)果的相關(guān)系數(shù)r=0.890，兩者呈高度正相關(guān)。此方法得到驗(yàn)證，可以應(yīng)用于誘變初篩的階段，大大減小了工作量。

[FK（W11][TPHC7.tif][FK）]

2.4Δmaxv測(cè)定在NIT第1輪誘變中的放大應(yīng)用

以Y8-10-1作為出發(fā)菌株，利用測(cè)定Δmaxv方法進(jìn)行NIT第1輪誘變初篩，結(jié)果如圖8所示。

[FK（W11][TPHC8.tif][FK）]

誘變選取400株菌株進(jìn)行Δmaxv值測(cè)定，對(duì)于Δmaxv大于出發(fā)菌株Δmaxv（0.038）的菌株進(jìn)行苯酚-次氯酸鹽法復(fù)篩，其中得到酶活大于0.6 U/mL的菌株有3株，1505120312號(hào)菌株酶活為0.81 U/mL，增加幅度最大。將這3株菌進(jìn)行4次傳代并搖瓶發(fā)酵測(cè)定酶活，結(jié)果如表4所示，3株突變菌體較原始菌株產(chǎn)酶能力均有明顯的提高，其中編號(hào)1505120312的酶活提高最大，為0.73 U/mL，是親本酶活 0.40 U/mL 的1.825倍，因此可通過本研究中建立的初篩方法在誘變初篩階段快速有效地篩選出酶活提高的突變菌株。[FL）]

[FK（W6][HT6H][JZ]表43株初篩高酶活菌株遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果[HTSS][STBZ]

[HJ*5][BG（！][BHDFG3，WK9，WK8*2。6W]菌株編號(hào)初始酶活（U/mL）1次傳代酶活（U/mL）2次傳代酶活（U/mL）3次傳代酶活（U/mL）4次傳代酶活（U/mL）相對(duì)酶活

[BHDG1*2，WK9，WK8*2。6DWW]15051203120.810.75±0.030.77±0.070.73±0.050.73±0.0390.12%

[BHDW]15051204420.620.52±0.070.50±0.040.52±0.070.54±0.0287.10%

[BH]15051201290.630.59±0.060.48±0.070.47±0.060.49±0.0477.80%[HT][HJ][BG）F][FK）]

[FL（2K2]3結(jié)論

本試驗(yàn)方法利用96孔板將反應(yīng)微量化縮小了反應(yīng)體系，并通過高溫失活酶活性，改變對(duì)照組反應(yīng)條件，在酶標(biāo)儀動(dòng)態(tài)檢測(cè)10 min下快速測(cè)定酶與底物產(chǎn)生氨的顯色反應(yīng)的Δmaxv，其與苯酚-次氯酸法測(cè)定酶活的相關(guān)系數(shù)高達(dá)0890，具有方便、快捷、通量高、試劑消耗少等優(yōu)點(diǎn)，將該方法運(yùn)用至NIT誘變中，從400株誘變菌株中獲得1株是出發(fā)菌株酶活1.825倍且遺傳穩(wěn)定性良好的菌株，該方法在實(shí)際篩選應(yīng)用中得以驗(yàn)證，可大大提高初篩效率，進(jìn)一步用于工業(yè)育種過程。

參考文獻(xiàn)：

[1][ZK（#]Yong Y H，Yamaguchi S，Matsumura Y.Effects of enzymatic deamidation by protein-glutaminase on structure and functional properties of wheat gluten[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2006，54（16）：6034-6040.endprint

[2]Miwa N，Yokoyama K，Wakabayashi H，et al.Effect of deamidation by protein-glutaminase on physicochemical and functional properties [JP3]of skim milk[J]. International Dairy Journal，2010，20（6）：393-399.[JP][ZK）][HT][HJ][HT][FL）][LM]

[KH*4D]

[HT8.]

[3][ZK（#]Miwa N，Nio N，Sonomoto K.Effect of enzymatic deamidation by protein-glutaminase on the textural and microstructural properties of set yoghurt[J]. International Dairy Journal，2014，36（1）：1-5.

[4]Yong Y H，Yamaguchi S，Gu Y S，et al.Effects of enzymatic deamidation by protein-glutaminase on structure and functional properties of α-zein[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2004，52（23）：7094-7100.

[5]Motoki M，Seguro K，Nio N，et al.Glutamine-specific deamidation of α S1-casein by transglutaminase[J]. Agricultural and Biological Chemistry，1986，50（12）：3025-3030.

[6]Kato A，Tanaka A，Lee Y，et al.Effects of deamidation with chymotrypsin at pH 10 on the functional properties of proteins[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，1987，35（2）：285-288.

[7]Yamaguchi S，Yokoe M.A novel protein-deamidating enzyme from Chryseobacterium proteolyticum sp.nov.，a newly isolated bacterium from soil[J]. Applied and Environmental Microbiology，2000，66（8）：3337-3343.

[8]張艷芳，賈彩鳳，何燦，等. 蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶產(chǎn)生菌的分離篩選和鑒定[J]. 食品工業(yè)科技，2015，36（1）：170-176.

[9]張艷芳. 產(chǎn)蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶菌株的篩選及酶的鑒定[D]. 上海：華東師范大學(xué)，2014.[ZK）]

[10][ZK（#]戚文福，王興為，梁軍，等. 苯酚次氯酸鹽試劑管法測(cè)定水中氨氮[J]. 軍隊(duì)衛(wèi)生，1984（4）：21-26.

[11]何秋云，楊志偉. 馬鈴薯中γ-氨基丁酸快速測(cè)定方法的研究[J]. 食品科技，2010（10）：262-266.

[12]康立. 蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶的發(fā)酵純化及其應(yīng)用的初步研究[D]. 上海：華東師范大學(xué)，2014.

[13]郭瑋婷，張慧，查東風(fēng)，等. 產(chǎn)耐高溫谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶菌株的快速篩選方法[J]. 中國(guó)生物工程雜志，2015，35（8）：83-89.

[14]Salazar O，Sun L.Evaluating a screen and analysis of mutant libraries[J]. Directed Enzyme Evolution： Screening and Selection Methods，2003：85-97.

[15]李向紅，周小玲，劉永樂，等. 蛋白質(zhì)谷氨酰胺酶對(duì)米谷蛋白功能性質(zhì)的影響[J]. 食品科學(xué)，2010，31（17）：192-196.endprint