以小麥為基質(zhì)的靈芝固體發(fā)酵條件研究

楊宗渠 李長看 雷志華 李玉華 曲金柱 高紅云 羅青

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.13.043[HT9.]

摘要：為篩選靈芝菌絲體生長的適宜環(huán)境條件和基質(zhì)，以臺灣靈芝和赤芝為材料，觀察菌絲體在不同溫度、pH值、氮源、光照條件、基質(zhì)下的生長情況。結(jié)果表明：臺灣靈芝的最適生長溫度為25 ℃，培養(yǎng)基最適初始pH值為5.0，最適氮源為（NH4）2SO4，在黑暗中生長最好；赤芝的最適生長溫度為30 ℃，培養(yǎng)基最適初始pH值為5.5，最適氮源為牛肉膏；臺灣靈芝和赤芝菌絲體均在小麥80%、谷子10%、蕎麥10%配方培養(yǎng)基質(zhì)上生長最旺盛。

關(guān)鍵詞：靈芝；菌絲體；培養(yǎng)條件；小麥

中圖分類號： S188+.4文獻標志碼： A[HK]

文章編號：1002-1302（2017）13-0150-03[HS）][HT9.SS]

收稿日期：2016-08-15

基金項目：河南省重點科技攻關(guān)項目（編號：102102110182）。

作者簡介：楊宗渠（1964—），男，河南延津人，博士，教授，研究方向為生物資源利用與轉(zhuǎn)化。E-mail：yangzqu@163.com。

[ZK）]

靈芝是我國傳統(tǒng)的食藥兼用真菌，是自然界珍稀的菌類。迄今為止，人們已經(jīng)從靈芝中分離出150種化合物，如多糖、腺苷、有機鍺、三萜等[1]。野生的靈芝子實體資源少，加之不合理采挖，導(dǎo)致藥源不足。靈芝子實體栽培要消耗大量木材，破壞森林資源，且靈芝子實體生產(chǎn)周期長、受氣候條件影響較大、產(chǎn)量低而不穩(wěn)。研究證實，發(fā)酵菌絲體與子實體成分一致[2]，為利用發(fā)酵工程技術(shù)生產(chǎn)靈芝菌絲體提供了理論基礎(chǔ)。固體發(fā)酵生產(chǎn)靈芝菌絲體與子實體栽培相比，具有難度低、生產(chǎn)周期短、次生代謝產(chǎn)物積累時間長、培養(yǎng)料來源廣泛等優(yōu)點。魏龍等研究了接種量、料層厚度、初始酸堿度、發(fā)酵時間對靈芝固體發(fā)酵產(chǎn)物抗氧化活性的影響[3]。張平等采用靈芝菌絲固體發(fā)酵枇杷葉，分析發(fā)酵前后枇杷葉中主要活性成分的變化[4]。曲墨等報道了以中藥渣和蓮藕渣為基質(zhì)的靈芝菌固體發(fā)酵條件[5-6]。杜亞楠等在大豆固體培養(yǎng)基中接種富硒靈芝菌種，探索固體發(fā)酵生產(chǎn)游離氨基酸的工藝條件[7]。付銘等以多糖及賴氨酸含量為指標，研究不同大米加量、裝液量、培養(yǎng)基酸堿度和培養(yǎng)溫度對靈芝菌絲體生長的影響[8]。筆者以小麥為發(fā)酵基質(zhì)，以菌絲生長速度為指標，研究不同菌株菌絲的生長特性，探索以小麥為基質(zhì)的靈芝固體發(fā)酵條件，旨在為將靈芝固體發(fā)酵技術(shù)應(yīng)用于小麥深加工提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與儀器

供試菌株臺灣靈芝從中國科學(xué)院微生物研究所引進，赤芝由中華供銷合作總社昆明食用菌研究所提供。CP313型電子天平[奧豪斯儀器（上海）有限公司]；DH-420型電熱恒溫培養(yǎng)箱（北京科偉永興儀器有限公司）；LRH-300-G型光照培養(yǎng)箱（廣東省醫(yī)療器械廠）；立式高壓滅菌器（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司）；PHSJ-5型pH計（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；SW-CJ-2FD型超凈工作臺（蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司）。

1.2方法

1.2.1培養(yǎng)基

母種采用PDA加富培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基以小麥為主要原料，添加輔料制成培養(yǎng)基質(zhì)。稱取一定量的小麥、燕麥、玉米、蕎麥、谷子、糙米、高粱，用涼水浸泡，放置冰箱12 h后煮沸，煮熟但不裂開，放涼至不黏手，按比例配制培養(yǎng)基質(zhì)。

1.2.2試驗設(shè)計

設(shè)置20、25、30、35、40 ℃等5個溫度處理。將靈芝菌種接種到PDA平板加富培養(yǎng)基上，分別置于5種溫度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每個溫度處理臺灣靈芝、赤芝各接種4個培養(yǎng)皿。

設(shè)置4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5等7個pH值。采用10% NaOH或10% HCl將PDA加富培養(yǎng)基分別調(diào)整為不同酸堿度，每個pH值下臺灣靈芝、赤芝各接種4個培養(yǎng)皿，放于最適溫度下的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

設(shè)置奶粉、牛肉膏、蛋白胨、（NH4）2SO4 4個處理。在PDA加富培養(yǎng)基中分別添加2%的不同氮源，每個處理接種4個培養(yǎng)皿，在最適溫度下的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

設(shè)置光照、黑暗條件2個處理。將菌種接種到加富PDA培養(yǎng)基上，分別置于黑暗和12 h光照的恒溫培養(yǎng)箱，在最適溫度下培養(yǎng)。每個處理接種4個培養(yǎng)皿。

培養(yǎng)期間定期觀察菌絲體生長情況，測量菌落直徑。

以小麥為主要原料，添加不同比例的其他谷物，制成5種培養(yǎng)基質(zhì)：A：小麥80%、谷子10%、蕎麥10%；B：小麥70%、玉米20%、糙米10%；C：小麥70%、高粱20%、薏米10%；D：小麥60%、燕麥20%、秈米20%；E：小麥100%。將培養(yǎng)基質(zhì)裝入500 mL菌種瓶，棉塞封口，121 ℃滅菌2.5 h。每個菌株在每種培養(yǎng)基質(zhì)上接種6瓶，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)3 d后搖動菌種瓶。觀察靈芝菌絲的生長情況，并記錄菌絲體長勢及長滿瓶的天數(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1溫度對靈芝菌絲體生長的影響

從表1可以看出，9 d內(nèi)，臺灣靈芝的菌落直徑均以25 ℃最大，30 ℃次之，20、35 ℃下菌落直徑較小，40 ℃下菌絲未生長。赤芝則是30 ℃下菌落直徑最大，其次分別是25、35 ℃，20 ℃菌落直徑最小，40 ℃下菌絲未生長。由此可知，臺灣靈芝的最適生長溫度為25 ℃，赤芝在30 ℃下生長最快。20、25 ℃ 下臺灣靈芝菌絲生長速度比赤芝快，臺灣靈芝菌絲潔白，赤芝菌絲稍微發(fā)黃；30、35 ℃下赤芝菌絲生長速度比臺灣靈芝快，且赤芝菌絲發(fā)黃。

2.2培養(yǎng)基酸堿度對靈芝菌絲體生長的影響

從表2可知，2個靈芝菌株的菌絲在pH值4.5～7.5之間的培養(yǎng)基上均能生長。臺灣靈芝在pH值5.0～6.0之間培養(yǎng)基上的菌落直徑大于pH 值5.0以下或6.0以上的培養(yǎng)基，pH值為5.0時菌落直徑最大，且菌絲濃密，長勢旺盛，說明臺灣靈芝菌絲體生長的最適pH值為5.0。赤芝菌絲在同一pH值的培養(yǎng)基上菌落直徑大于臺灣靈芝，pH值為5.5時赤芝菌落直徑最大，長勢好，菌絲潔白、濃密，說明赤芝菌絲生長的最適pH值為5.5。endprint

2.3氮源對靈芝菌絲體生長的影響

由表3可知，氮源對臺灣靈芝菌絲生長有顯著影響，在含有（NH4）2SO4的培養(yǎng)基上生長最好，菌落直徑最大，生長旺盛，菌絲濃密，牛肉膏、蛋白胨次之，以奶粉作為氮源時菌落直徑最小。由此可知，臺灣靈芝菌絲對無機氮源（NH4）2SO4的利用能力較強。赤芝菌絲的菌落直徑在牛肉膏為氮源的培養(yǎng)基最大，其次為（NH4）2SO4，奶粉、蛋白胨較小，說明赤芝菌絲生長的最適氮源為牛肉膏，赤芝對奶粉、蛋白胨的利用能力較弱。在相同氮源下，赤芝菌絲的菌落直徑均大于臺灣靈芝，說明赤芝對氮源的適應(yīng)能力強于臺灣靈芝。

2.4光照對靈芝菌絲體生長的影響

由表4可知，2個供試菌株的菌絲在黑暗條件下的菌落直徑均大于光照條件下，且黑暗條件下，菌絲長勢旺盛，濃密、潔白；光照條件下，菌絲稀疏、長勢弱。說明2個供試菌株的菌絲均適宜在黑暗環(huán)境中生長。光照條件下，赤芝菌絲體生長速度較臺灣靈芝緩慢，黑暗條件下，赤芝菌絲體的生長速度明顯快于臺灣靈芝?？梢?，與臺灣靈芝相比，赤芝菌絲體生長對光照條件更為敏感。

2.5基質(zhì)成分對靈芝菌絲生長的影響

分別在5種配方的固體培養(yǎng)基上接種臺灣靈芝和赤芝，黑暗條件下培養(yǎng)，觀察菌絲生長情況，結(jié)果如表5所示。臺灣靈芝在A培養(yǎng)基上生長速度最快、長勢強，B培養(yǎng)基次之，D、E培養(yǎng)基上菌絲生長速度最慢、長勢弱。赤芝菌株在整個培養(yǎng)過程中菌絲泛黃，A基質(zhì)上的菌絲生長速度最快，且菌絲濃密，B基質(zhì)上菌絲生長最慢，菌絲較稀疏，C、D、E基質(zhì)上菌絲生長速度相差不大，C基質(zhì)上菌絲較D、E基質(zhì)上濃密。由此可知，臺灣靈芝、赤芝的最適培養(yǎng)基配方均為A基質(zhì)。

3結(jié)論與討論

溫度是影響靈芝菌絲體生長的重要因子之一。杜曾榮等報道，黑靈芝（Ganoderma atrum）菌絲體最適生長溫度為 33 ℃[9]。楊德等[10]、譚才鄧等[11]、余有貴等[12]研究均發(fā)現(xiàn)，赤靈芝菌絲體的最適生長溫度為27 ℃。本研究中，臺灣靈芝、赤芝菌絲的最適生長溫度分別為25、30 ℃，與上述報道不一致，其原因是試驗菌株不同、菌株的生長特性差異所致。培養(yǎng)基酸堿度通過影響細胞膜的通透性和營養(yǎng)物質(zhì)的溶解度來影響營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，從而影響靈芝菌絲的生長。靈芝菌絲體生長適宜的pH值大多在5.5～6.5，培養(yǎng)基的初始pH值應(yīng)提高，因為培養(yǎng)基在滅菌后pH值會降低，同時菌絲體在生長過程中會產(chǎn)生有機酸而使pH值減小[13]。本研究中，臺灣靈芝培養(yǎng)基最適初始pH值為5.0，赤芝最適初始pH值則為 5.5，據(jù)此認為，菌絲體生長中產(chǎn)生的有機酸和滅菌過程對培養(yǎng)基pH值影響很小，應(yīng)將固體發(fā)酵基質(zhì)初始pH值調(diào)整到 5.0～5.5。2個菌株的菌絲體在光照條件下生長受到不同程度的抑制，與前人報道[10，12]一致。

靈芝菌絲體對氮源的適應(yīng)能力較強，但對不同種類氮源的利用能力不同。與現(xiàn)有報道[13]不同，本研究中，臺灣靈芝利用無機氮（NH4）2SO4的能力大于蛋白胨、牛肉膏、奶粉等有機氮，赤芝利用（NH4）2SO4的能力大于蛋白胨和奶粉，其原因可能是2個菌株菌絲體分泌的催化無機氮合成某些必需氨基酸的酶類活性較強，但其機理還有待進一步研究。小麥富含淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪、膳食纖維、礦物質(zhì)、鈣、鐵、維生素等成分，可為靈芝菌絲體生長提供必需的碳源、氮源、微量元素、微量活性物質(zhì)，2個菌株的菌絲體在以小麥為主要原料的培養(yǎng)基上生長良好，說明小麥作為靈芝固體發(fā)酵基質(zhì)是適宜的。由于靈芝固體發(fā)酵是以獲得靈芝多糖等功能成分為目的，所以還需進一步研究培養(yǎng)條件對菌質(zhì)中靈芝多糖含量的影響。同時，發(fā)酵過程中菌絲分泌的酶類會催化淀粉、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分的水解，靈芝固體發(fā)酵菌質(zhì)中營養(yǎng)成分的變化也需要進行深入研究。

[HTK]致謝：鄭州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院生物科學(xué)專業(yè)學(xué)生楊晶晶、王利紅、劉旭、孟翠、李巖參加部分研究工作，在此表示感謝！[HT]

[HS2]參考文獻：

[1][ZK（#]張麗霞，張雅君，張麗萍. 靈芝多糖的提取純化及其免疫活性[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2014，42（6）：168-172.

[2]李欽艷，鐘瑩瑩，陳逸湘，等. 我國靈芝種質(zhì)資源及生產(chǎn)技術(shù)研究進展[J]. 中國食用菌，2016，35（1）：8-12，20.

[3]魏龍，贠建民，艾對元，等. 提高靈芝-當歸雙向固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)抗氧化活性的條件優(yōu)化研究[J]. 食品工業(yè)科技，2014，35（16）：160-165.

[4]張平，李曄，陳嬋，等. 靈芝菌株固體發(fā)酵對枇杷葉主要活性成分的影響[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2016，28（16）：242-246.

[5]曲墨，邱智東，王偉楠. 靈芝菌固體發(fā)酵三七藥渣工藝研究[J]. 長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2016，32（2）：263-265.

[6]Yin Y Q，Liu M Y，Wu J X，et al. Optimization of medium composition for soluble dietary fibre production by Ganoderma lucidum using lotus root pomace[J]. Indian Journal of Agricultural Sciences，2014，84（10）：1225-1230.

[7]杜亞楠，涂曉嶸，胡志斌，等. 大豆富硒靈芝菌固體發(fā)酵產(chǎn)氨基酸工藝的優(yōu)化研究[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2012，34（5）：1043-1048.

[8]付銘，冮潔，狄文婷，等. 大米為基質(zhì)靈芝菌絲體固態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化[J]. 食品工業(yè)科技，2014，35（2）：186-191.

[9]杜曾榮，常繼東. 黑靈芝菌絲體培養(yǎng)條件的初步研究[J]. 食用菌，2007，29（1）：4-6.[ZK）]

[10][ZK（#]楊德，周明，郭鵬，等. 靈芝發(fā)酵豆渣培養(yǎng)條件優(yōu)化[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，52（24）：6135-6138.

[11]譚才鄧，廖延智，邱玉美，等. 利用糖蜜培養(yǎng)靈芝菌絲工藝條件優(yōu)化[J]. 中國調(diào)味品，2012，37（11）：29-31，42.

[12]余有貴，李忠海，黃國華，等. 響應(yīng)面設(shè)計法優(yōu)化蕨渣基質(zhì)的靈芝培養(yǎng)條件[J]. 中國生物工程雜志，2009，29（12）：37-42.

[13]鄧功成，周川，王文飛，等. 靈芝菌絲體發(fā)酵條件優(yōu)化研究[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，40（21）：96-99.endprint