大黃酸酯類衍生物的合成及體外抗腫瘤活性研究*

黃新煒

（西安文理學(xué)院 化學(xué)工程學(xué)院，陜西 西安 710065）

大黃酸酯類衍生物的合成及體外抗腫瘤活性研究*

黃新煒

（西安文理學(xué)院 化學(xué)工程學(xué)院，陜西 西安 710065）

以天然產(chǎn)物大黃酸為先導(dǎo)化合物，通過酯化反應(yīng)合成了10個大黃酸酯類衍生物，對于位阻較小的醇以SOCl2作催化劑，合成了大黃酸甲酯、乙酯和正丁酯；對于位阻較大的醇以DCC作脫水劑、DMAP作催化劑，合成了大黃酸異丙酯、異丁酯、異戊酯、芐酯、2-苯乙醇酯、2-氯乙醇酯，并通過熔點、IR和1H NMR對目標(biāo)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征，其中5個化合物未見文獻(xiàn)報道。通過MTT法對部分目標(biāo)產(chǎn)物抑制人宮頸癌細(xì)胞Hela活性進(jìn)行了體外評價，結(jié)果表明：化合物2對Hela具有較高的抑制活性，在濃度為100μg·mL-1時抑制率為70%。

大黃酸；酯化；合成；抗腫瘤活性

1844年，Schossberger等首次從中藥大黃中提取純化出大黃酸，其分子式為C15H8O6，分子量為284.21，黃色針狀結(jié)晶，熔點 321～322℃，330℃分解，幾乎不溶于水，可溶于堿性水溶液和吡啶。大黃酸屬于單蒽核類1,8-二羥基蒽醌衍生物，是中藥大黃、何首烏、虎杖的主要活性成分之一，具有廣泛的藥理活性，如：抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化、降糖調(diào)脂、保肝抗纖維化等，并且在治療骨關(guān)節(jié)炎、糖尿病、腎病等疾病及抗腫瘤方面表現(xiàn)突出，成為研究的熱點之一。大黃酸含有多個羥基和羰基，易與生物體靶酶中的金屬離子鰲合，形成較穩(wěn)定的鰲合物，這也是其生物作用廣泛的原因之一[1，2]。大黃酸能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤血管形成，逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥等多方面的抗腫瘤活性[3]。鑒于其較廣泛的藥理作用及低毒性、低成本等特點，大黃酸有望得到進(jìn)一步開發(fā)。但是由于大黃酸具有蒽醌類三環(huán)芳香結(jié)構(gòu)，溶解性較差，既不溶于水和醇，又不溶于絕大多數(shù)有機溶劑，生物利用度較低，這使大黃酸的臨床使用受到了很大限制。如果通過結(jié)構(gòu)改造的方法來改善大黃酸的溶解性能，增加其水溶性或脂溶性，其生物利用度將會有所提高，將會有很廣闊的臨床應(yīng)用前景。

近年來，對大黃蒽醌類化合物的結(jié)構(gòu)改造主要是針對大黃素進(jìn)行的，而對大黃酸進(jìn)行的改造還相對較少。大黃酸與大黃中其它蒽醌類化合物最顯著的區(qū)別就是大黃酸存在一個游離的羧基，因此，我們選擇大黃酸的羧基進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，通過酯化反應(yīng)合成了10個大黃酸酯類衍生物，同時進(jìn)行體外抗腫瘤活性研究，以期能夠發(fā)現(xiàn)活性抗腫瘤較好、且毒性較 小可用于新藥開發(fā)的候選藥物，合成路線見圖1。

圖1 大黃酸酯的合成路線Fig.1 Synthetic route of ester of rhein

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

X-5顯微熔點測定儀（未校準(zhǔn) 北京泰克儀器有限公司）;傅里葉變換紅外光譜儀（KBr壓片法 美國Pekin Elmer公司）;Bruker Avance-400MHz核磁共振儀（TMS作內(nèi)標(biāo)，CDCl3為溶劑，瑞士Bruker公司）;EL311型酶標(biāo)免疫檢測儀（美國Bio Tek公司）;3164型水套式CO2孵箱（美國Forma Scientific公司）;IX71型倒置熒光相差顯微鏡（日本Olympus公司）;四氮唑藍(lán)（MTT）購于瑞士Fluka公司;RPMI-1640培養(yǎng)基購于美國HyClone公司。

大黃酸（98%陜西森弗生物技術(shù)有限公司）；氯化亞砜、DMAP、DCC、2-氯乙醇、苯甲醇、2-苯乙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇、異戊醇均為分析純。

1.2 合成方法

1.2.1 大黃酸甲酯、乙酯及正丁酯的合成[4]稱取0.57g大黃酸（2mmol）溶于30mL甲醇中，冰浴冷卻下將0.2mL SOCl2（3mmol）滴入反應(yīng)物中，整個滴加時間控制在10mins左右，控制反應(yīng)溫度為0～5℃。室溫攪拌反應(yīng)，TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程，反應(yīng)完全后，減壓蒸除溶劑，加入25mL水，用乙酸乙酯（3×20mL）萃取后，20mL飽和碳酸鈉溶液洗滌后，無水Na2SO4干燥，減壓濃縮得粗品，柱層析分離得目標(biāo)產(chǎn)物。

大黃酸甲酯（1）：黃色粉末，mp:185.2～186.2℃;1H NMR（400MHz,CDCl3）:δ12.03（IH,s）,11.97（IH,s）,8.43 （1H,bs）,7.95 （1H,d,J=1.2Hz）,7.88（1H,d,J=7.2Hz）,7.74（1H,t,J=8Hz）,7.34（1H,d,J=8.6Hz）,4.00（3H,s）；IR（KBr）ν:3433（br）,2953,1726,1626,1449,1378,1206,840,751 cm-1。

大黃酸乙酯（2）：橙黃色粉末，mp:169.3～171.8℃；1H NMR（400MHz,CDCl3）:δ12.02（IH,s）,11.97（IH,s）,8.41 （1H,s）,7.94 （1H,s）,7.87 （1H,d,J=7.2Hz）,7.73 （1H,t,J=8Hz）,7.33 （1H,d,J=8Hz）,4.45（2H,q,J=7.6Hz）,1.45 （3H,t,J=7.2Hz）；IR（KBr）ν:3422（br）,2987,1722,1631,1454,1380,1202,845,748 cm-1。

大黃酸正丁酯（3）：橙黃色粉末，mp:127.8～129.9℃ ；1H NMR （400MHz,CDCl3）: δ12.02（IH,s）,11.96（IH,s）,8.40（1H,bs）,7.93（1H,d,J=1.2Hz）,7.87（1H,d,J=7.2Hz）,7.72（1H,t,J=8Hz）,7.33（1H,d,J=8Hz）,4.39 （2H,t,J=6.4Hz）,1.80 （2H,m,J=6.8Hz）,1.50（2H,m,J=7.2Hz）,1.01（3H,t,J=7.2Hz）；IR（KBr）ν:3420（br）,2969,2877,1724,1627,1447,1376,1201,841,752cm-1。

1.2.2 大黃酸異丙酯、異丁酯、叔丁酯、異戊酯、苯甲酯、2-苯乙醇酯、2-氯乙醇酯的合成[5]將0.57g大黃酸（2mmol）和 0.5mL異丙醇（2mmol）溶于 30mL二氯甲烷中，冰浴冷卻下將0.3gDCC（2mmol）和0.01g DMAP（0.06mmol）加入反應(yīng)物中，0～5℃反應(yīng) 1h 后，撤去冰浴室溫攪拌反應(yīng)，TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程，反應(yīng)完全后，過濾，減壓濃縮蒸除溶劑后，柱層析分離得目標(biāo)產(chǎn)物。

大黃酸異丙酯（4）：橙黃色粉末，mp:183.4～184.8℃；1H NMR（400MHz,CDCl3）:δ12.04（1H,s）,11.99（1H,s）,8.42（1H,d,J=1.6Hz）,7.95（1H,d,J=1.2Hz）,7.89（1H,dd,J=8.4,1.2Hz）,7.74（1H,t,J=8Hz）,7.34 （1H,dd,J=8.4,1.2Hz）,5.31 （1H,m,J=6Hz）,1.42（6H,d,J=6Hz）；IR （KBr）ν:3204,2984,1717,1627,1452,1373,1202,840,749cm-1。

大黃酸異丁酯（5）：橙黃色粉末，mp:154.7～155.9℃；1H NMR （400MHz CDCl3）:δ12.06（1H,s,OH）,11.99（IH,s,OH）,8.44（1H,s）,7.95（1H,s）,7.89（1H,d,J=7.2Hz）,7.74（1H,t,J=8Hz）,7.35（1H,d,J=8Hz）,4.18（2H,d,J=6.8Hz）,2.13（1H,m,J=6.8Hz）,1.05（6H,d,J=6.8Hz）；IR（KBr）ν:3198,2951,1720,1624,1453,1377,1198,811,751cm-1。

大黃酸叔丁酯（6）：橙黃色粉末，mp:179.9～181.7℃；1H NMR（400MHz,CDCl3）:δ12.03（1H s）,11.98 （1H,s）,8.40 （1H,d,J=2Hz）,7.93（1H,d,J=2Hz）,7.88（1H,d,J=7.2Hz）,7.73（1H,t,J=8Hz）,7.33（1H,d,J=7.2Hz）,1.43（9H,s）；IR（KBr）ν:3417,3204,3094,2983,1716,1625,1474,1371,1202,822,751 cm-1。

大黃酸異戊酯（7）：橙黃色粉末，mp:123.3～125.9℃；1H NMR （400MHz,CDCl3）:δ12.06（1H,s）,11.99（1H,s）,8.42（1H,d,J=1.6Hz）,7.94（1H,d,J=1.2Hz）,7.89（1H,d,J=7.2Hz）,7.74（1H,t,J=8.4Hz）,7.34（1H,d,J=8.4Hz）,4.42 （2H,t,J=6.4Hz）,1.81（2H,q,J=6.8Hz）,1.04（1H,m,J=6.4Hz）,0.99（6H,d,J=6.8Hz）。

大黃酸芐酯（8）：橙色粉末，mp:155.7～157.7℃；1H NMR（400MHz,CDCl3）: δ12.05（IH,s）,11.99（IH,s）,8.46（1H,d,J=1.2Hz）,7.97（1H,d,J=1.2Hz）,7.88（1H,d,J=8Hz）,7.74（1H,t,J=8Hz）,7.34（1H,d,J=8Hz）,7.49-7.36（5H,m）,5.42（2H,s）。

大黃酸-2-苯乙醇酯（9）：黃色粉末，mp:148.6～151.5℃；1H NMR （400MHz,CDCl3）:δ12.06（IH,s）,12.00（IH,s）,8.42（1H,d,J=1.6Hz）,7.91（1H,d,J=2.0Hz）,7.89（1H,d,J=7.2Hz）,7.74（1H,t,J=8Hz）,7.37（1H,d,J=7.2Hz）,7.34-7.29（5H,m）,4.59（2H,t,J=6.8Hz）,3.13（2H,t,J=6.8Hz）。

大黃酸-2-氯乙醇酯（10）：橙色粉末，mp:163.2～163.7℃；1H NMR （400MHz,CDCl3）:δ12.07（IH,s）,11.98（IH,s）,8.45（1H,d,J=1.2Hz）,7.94（1H,d,J=1.2Hz）,7.87（1H,d,J=7.2Hz）,7.75（1H,t,J=8Hz）,7.35（1H,d,J=7.6Hz）,4.65（2H,t,J=5.2Hz）,3.86（2H,t,J=5.6Hz）；IR（KBr）ν:3430,3084,2947,1723,1678,1449,1189,819,749 cm-1。

1.3 MTT法體外抗腫瘤活性實驗

取腫瘤細(xì)胞株，用RPMI-1640培養(yǎng)液于CO2孵箱中37℃，5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后用胰蛋白酶消化傳代。將處于對數(shù)生長期腫瘤細(xì)胞以5×104個·mL-1的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL。次日，每孔分別加入不同濃度受試化合物，每藥設(shè)4個劑量組，每組設(shè)3個平行孔，另設(shè)空白組和對照組（以喜樹堿為陽性對照藥）。加藥完畢后于CO2孵箱中在37℃，5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)48h，然后每孔再加入5mg·mL-1MTT溶液20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，吸棄上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10min（60次·min-1）后，用自動酶標(biāo)儀于 490 nm波長處測定吸光度（OD）值，取各組平均值，計算每種濃度藥物的抑制率，結(jié)果見表1。

抑制率（%）=（1-試驗組平均OD值/對照組平均OD值）×100%

表1 部分目標(biāo)產(chǎn)物對Hela細(xì)胞的抑制作用Tab.1 Inhibitory effects of some compounds against Hela

2 結(jié)果與討論

2.1 合成

針對不同的醇，采用不同的方法進(jìn)行酯化反應(yīng)：對于位阻較小的醇（如甲醇、乙醇或正丁醇），以SOCl2作催化劑，合成了大黃酸甲酯、乙酯和正丁酯。在合成時，一是SOCl2需要滴加，并在整個滴加過程中要注意控制反應(yīng)溫度為0～5℃；對于位阻較大的醇（如異丙醇、異丁醇、異戊醇、苯甲醇、2-苯乙醇及2-氯乙醇），以DCC作脫水劑、DMAP作催化劑，合成了大黃酸異丙酯、異丁酯、異戊酯、芐酯、2-苯乙醇酯、2-氯乙醇酯。

2.2 活性

以喜樹堿（12）作為陽性對照藥，對表中數(shù)據(jù)進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，喜樹堿在4種不同濃度下對Hela細(xì)胞株均呈現(xiàn)出較強的抑制作用；隨著濃度的增加，大黃酸（11）對Hela細(xì)胞株的抑制作用依次增強，并且這種抑制作用呈劑量依賴性的關(guān)系，這說明大黃酸只有在高濃度時，對腫瘤細(xì)胞的抑制作用才較強；大黃酸酯類衍生物在濃度為10g·mL-1時對Hela細(xì)胞株的抑制作用普遍強于相同濃度下大黃酸對Hela細(xì)胞株的抑制作用，但低于陽性對照藥喜樹堿相同濃度下的抑制作用，其中化合物2對Hela具有較高的抑制活性，在濃度為100μg·mL-1時，抑制率可達(dá)70%。

3 結(jié)論

本文以大黃酸及各種醇為原料，通過酯化反應(yīng)合成了10個大黃酸的酯類衍生物，并通過熔點、IR和1H NMR對目標(biāo)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征，其中5個化合物未見文獻(xiàn)報道。體外抗腫瘤活性實驗表明，化合物2對Hela具有較高的抑制活性，在濃度為100μg·mL-1時抑制率為 70%。

［1］ 趙芳，梁慧，程惠，等.大黃酸金屬配合物的合成、表征及抗氧化活性研究［J］.化學(xué)學(xué)報，2011,69（8）:925-930.

［2］ 向暉，潘曉麗，譚玉柱，等.大黃酸金屬配合物的抑菌活性研究［J］.中藥與臨床，2014,5（4）:19-22.

［3］ 萬宗明，孫文軍，陳虹.大黃酸抗腫瘤作用的研究進(jìn)展［J］.武警醫(yī)學(xué)，2006,17（8）:611-612.

［4］ Hosangadi,B.D.;Dave,R.H.An efficient general method for esterification ofaromatic carboxylic acids［J］.TetrahedronLetters,1996,37（35）:6375-6378.

［5］ Jin,G.Z.;You,Y.J.;Kim,Y.,et al.Esters of chlorambucil with 2-substituted 1,4-dihydroxy-9,10-anthraquinones as multifunctional anticancer agents［J］.Eur.J.Med.Chem,2001,36:361-366.

Study on the synthesis of some ester derivatives of Rhein and their in vitro antitumor activities*

HUANG Xin-wei
（School of Chemical Engineering,Xi'an University,Xi'an 710065,China）

Taking rhein as lead compound,ten esters of rhein were synthesized by esterification.For the smaller steric hindrance alcolhols,SOCl2was used as catalyst to synthesize methyl,ethyl and butyl esters;but for the lager steric hindrance alcohols,DCC was used as dehydrating agent,and DMAP was used as catalyst to synthesize isopropyl,isobutyl,tert-butyl,isoamyl,benzyl,2-phenyl ethyl,2-chloro ethyl esters.The structures of target compounds were characterized by melting point,IR and 1H NMR.Five of them were new compounds.Some compounds were evaluated for antitumor activities in vitro against Hela human cervical cartcinoma cell lines.The results showed that compound 2 exhibited high activity against Hela at 100μg·mL-1which inhibition rate is 70%.

rhein;esterification;synthesis;antitumor activities

O625.5

A

10.16247/j.cnki.23-1171/tq.20170918

2017-08-18

西安市科技計劃項目（CXY1443WL13）；陜西省教育廳基金項目（15JK2145）

黃新煒（1976-），男，講師，博士，主要從事天然產(chǎn)物的合成及結(jié)構(gòu)改造研究。