益氣活血組方對急性缺血性心肌大鼠PDGF表達的影響*

胡國恒 龔 純 王瑾茜 袁 華 陳 亞

（1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙410007）

益氣活血組方對急性缺血性心肌大鼠PDGF表達的影響*

胡國恒1△龔 純2王瑾茜2袁 華1陳 亞1

（1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙410007）

目的 觀察益氣活血組方對于急性缺血缺氧的心肌組織血管新生的作用及其機制。方法 采用結(jié)扎健康的SD雄性大鼠左冠脈的前降支，建立急性缺血缺氧的心肌梗死的模型，造模成功后的45只大鼠隨機分為模型組、芪參益氣滴丸組、益氣活血方組，假手術組15只大鼠模型僅穿線不結(jié)扎，各組在根據(jù)處死時間隨機分為3 d、7 d、14 d 3個時相組。觀察不同組別不同時相HE染色情況及血小板衍生生長因子（PDGF）蛋白的表達情況。結(jié)果 與假手術組，模型組相比，益氣活血組方HE染色可見較多增生的毛細血管；PDGF蛋白表達在芪參益氣滴丸組和益氣活血組方表達較高（P<0.01），在4個組別的不同時相比較時，發(fā)現(xiàn)在芪參益氣滴丸組和益氣活血組方隨著時間增加，蛋白表達量增多（P<0.01），而假手術組和模型組無規(guī)律可循。結(jié)論益氣活血組方可能通過促進PDGF的表達，促進血管新生，增加動脈的密度，形成血管壁，從而可以增加心臟側(cè)支循環(huán)，改善心肌的缺血缺氧狀態(tài)。

益氣活血組方 芪參益氣滴丸 急性心肌缺血 血管新生 血小板源性生長因子（PDGF）

急性心肌梗死是指誘發(fā)于過度勞累、不良情緒或者環(huán)境突然改變而發(fā)生冠脈粥樣硬化斑塊脫落引起管腔狹窄或者堵塞，在側(cè)支循環(huán)尚未建立的情況下，出現(xiàn)供血與需血不平衡，出現(xiàn)心肌組織嚴重而持久地缺血。其病情重，致死率高。本病有藥物治療、介入治療等，但這些治療手段對已壞死的心肌尚無良好治療措施，因此難以滿足心功能恢復的需要。急性心肌梗死總體預后較差，其并發(fā)癥多，例如受累心肌在缺血緩解下發(fā)生持續(xù)性凋亡，出現(xiàn)心肌纖維化及心室重構(gòu)，由于心肌做功困難，舒縮功能下降，收縮期射血分數(shù)下降及舒張期充盈量增多，導致心臟容量負荷加大，進一步出現(xiàn)心力衰竭等［1］。臨床上缺乏真正有長期療效的心肌保護劑。因此，如何促進心肌梗死后期血管新生，避免心肌纖維化及心室重構(gòu)，且具有長期療效的治療手段成為了醫(yī)學界的一大研究熱點。經(jīng)多項研究表明中醫(yī)藥在促進心肌梗死后血管新生具有明顯的療效［2］，結(jié)合它的整體優(yōu)勢，中醫(yī)藥可能將成為保護心肌的新型治療手段［3］。本研究是在本團隊前期研究成果之上提出猜想［4-5］：建立急性心肌梗死的動物模型后，通過觀察心臟心肌梗死后大體形態(tài)、心肌組織的病理形態(tài)（HE染色）、檢測血小板源性生長因子（PDGF）蛋白表達（Western-blot）等方面，分析益氣活血組方對急性冠脈中斷后心肌缺血缺氧的保護機制，并為臨床運用“益氣活血、祛瘀生新”這一方法治療心肌梗死提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康的SPF級Sprague Dawley（SD）大鼠，雄性，體質(zhì)量（250±30） g，購買于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號：SYXK（湘）2011-D03。喂養(yǎng)7 d后方可開始實驗，以增強動物的適應性。大鼠喂養(yǎng)環(huán)境保持一致，均在湖南中醫(yī)藥大學SPF級實驗動物中心飼養(yǎng)。

1.2 實驗藥物 益氣活血組方由黃芪50 g，當歸10 g，川芎25 g，丹參25 g組成。中藥飲片均購于湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，已由藥劑科鑒定為道地藥材。制備方法：飲片先浸泡30 min后煎煮2次，第1次加水500 mL，第2次加水300 mL，兩次均煎汁150 mL；取2次藥液混合后，利用水浴箱水浴濃縮為膏狀（含生藥0.73 g/mL），存放至-2℃的冰箱冷藏備用。每只大鼠灌胃的液體量為14 mL/kg，按體表面積折算其濃度及等效體積。芪參益氣滴丸由黃芪、丹參、三七、降香油組成，規(guī)格是每袋0.5 g，由天津天力士制藥集團股份有限公司生產(chǎn)。麻醉注射用品戊巴比妥鈉注射液由哈藥集團三精制藥股份有限公司生產(chǎn)。

1.3 試劑與儀器 蘇木精 （美國Sigma公司）；伊紅（美國 Sigma公司）；APS （美國 Sigma公司）；BSA 粉末（上海 Solarbio公司）；山羊兔抗 IgG（德國 Proteintech三鷹）；Tris（美國 Sigma 公司）等。 呼吸機（ALC-V10）-奧爾科特生物科技有限公司（上海）；心電圖機（BL-420F）-光電醫(yī)用儀器有限公司（上海）；石蠟切片機-Leica公司（德國）；自動封片機-索斯恩Leica公司（德國）等。

1.4 造模方法 大鼠適應新喂養(yǎng)7 d后開始造模，依據(jù)標準方法進行造模［6-7］。采用開胸冠脈結(jié)扎方法進行，第1步行腹腔注射麻醉，麻醉劑量以1%戊巴比妥鈉注射液40 mg/kg的比例計算，麻醉成功后將大鼠固定于鼠板；第2步氣管插管，接呼吸機輔助呼吸，動物呼吸機參數(shù)設置為呼吸頻率90次/min，潮氣量10～12 mL，呼吸比2∶1。第3步結(jié)扎冠脈。逐層分離皮膚、肌肉等組織后于左肋2～3做橫切口撐開，暴露心臟，在左心耳前下方用1根零號無創(chuàng)縫合線結(jié)扎左冠狀動脈前降支。最后記錄標準Ⅱ?qū)?lián)心電圖，即刻觀察心臟心肌顏色形態(tài)的變化，以心肌變白，心電圖ST段弓背向上抬高，心肌酶學的改變及左室前壁向外膨脹發(fā)紺、搏動減弱為結(jié)扎成功標志。假手術組僅穿線不結(jié)扎。術后在傷口縫合處涂抹適量青霉素粉以抗感染。

1.5 給藥方法 采用隨機數(shù)字表法，將成功造模大鼠分為模型組、芪參益氣滴丸組、益氣活血方組，保證每組存活15只。另取假手術組15只。如果每組大鼠在3、7、14 d內(nèi)出現(xiàn)死亡，則應再次擴大樣本量。術后灌胃，假手術組與模型組按照等體積蒸餾水灌胃；芪參益氣滴丸組按照藥物劑量換算方法 D1∶D2＝R1∶R2（D1 為人的服藥劑量、D2為大鼠服藥劑量、R1為人的相應體表面積比值、R2為大鼠體表面積比值）換算成300 g大鼠的每日劑量為0.04 g，用蒸餾水溶解稀釋到1～1.5 mL/100 g灌胃；益氣活血組方組按同樣方法換算成300 g大鼠的每日劑量為2.7 g，用蒸餾水溶解稀釋到1～1.5 mL/100 g灌胃。

1.6 樣本采集與處理 在大鼠冠狀動脈結(jié)扎術后第3、7、14天，每次每組分批以頸髓離斷法處死5只，開胸取出心臟后稱質(zhì)量，然后將心臟組織放在預先準備好的冰塊上用鋒利刀片在約為心臟乳頭肌平面將心臟橫切為上下兩份，近心尖部梗死區(qū)用10%甲醛液固定，約2 min內(nèi)完成，4℃冰箱保存，用于HE染色，并在光鏡下各組選取5個互不重疊的視野，采用IPP6.0圖像分析系統(tǒng)，觀察梗死區(qū)域形態(tài)，并計數(shù)血管新生的大致面積。近心底部迅速凍存于-80℃冰箱，檢測時將心肌勻漿蛋白取出后，采用Western-blot、Quality one軟件對灰度進行分析，觀察并計算PDGF蛋白相對的表達水平。

1.7 統(tǒng)計學處理 應用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示。組內(nèi)不同時間點的均數(shù)比較采用單因素方差分析。同一時間點的組間的均數(shù)比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組3 d、7 d、14 d心梗區(qū)細胞形態(tài)學比較 在光鏡下對缺血區(qū)心肌組織進行形態(tài)學觀察，假手術組可見近心尖部梗死區(qū)心肌細胞輪廓正常，排列規(guī)整，心肌纖維未見明顯異常，毛細血管增生不明顯。模型組可見心尖部梗死區(qū)細胞在3 d組出現(xiàn)細胞腫脹，胞核固縮壞死或出現(xiàn)空泡，細胞結(jié)構(gòu)散亂，后期肌纖維萎縮不明顯，有少量毛細血管增生。芪參益氣滴丸組在急性缺血缺氧后出現(xiàn)細胞腫脹，壞死，細胞結(jié)構(gòu)散亂，在7 d時開始出現(xiàn)肌纖維萎縮，間質(zhì)纖維組織增生較明顯，14 d時可見較多新生的毛細血管；益氣活血組方組在初期如芪參益氣滴丸組，后期可見間質(zhì)纖維組織增生明顯，肌纖維萎縮變性，可見較多增生的毛細血管。見圖1。

圖1 心肌梗死區(qū)細胞形態(tài)學觀察（HE染色，400倍）

圖2 各組大鼠心肌組織中PDGF的Western Blot電泳條帶

表1 各組大鼠心肌組織中PDGF蛋白表達水平比較

表1 各組大鼠心肌組織中PDGF蛋白表達水平比較

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。 下同。

組 別 n PDGF蛋白表達假手術組 15模型組 15芪參益氣滴丸組 15 0.187±0.068 0.218±0.063 0.545±0.163**益氣活血組方組 150.567±0.223**

2.2 各組大鼠心肌組織PDGF蛋白表達比較 見圖2，表1。假手術組及模型組PDGF蛋白電泳灰度值與標準蛋白電泳條帶（β-action）比較明顯減少。芪參益氣滴丸組與益氣活血方組PDGF蛋白電泳灰度值與標準蛋白電泳條帶（β-action）比較明顯增高（P<0.01）。2.3 各組大鼠不同時間點心肌組織中PDGF表達水平比較 見圖3，表2。假手術組、模型組在3個時相中PDGF蛋白電泳灰度值無明顯變化，隨著時間變長，灰度值不同程度下降。芪參益氣滴丸組與益氣活血方組PDGF蛋白電泳灰度值隨著時間加長表達明顯增高，與假手術組和模型組各時相相比均有顯著差異。蛋白灰度值在7 d與14 d較假手術組、模型組有顯著差異（P<0.01）。

圖3 各時間點AIM大鼠心肌組織中PDGF的Western Blot電泳條帶

表2 各組大鼠不同時間點心肌組織中PDGF表達水平比較s）

表2 各組大鼠不同時間點心肌組織中PDGF表達水平比較s）

組 別 n 14 d 3 d 7 d假手術組 15 0.140±0.024模型組 15 0.199±0.018芪參益氣滴丸組 15 0.676±0.023**0.157±0.051 0.126±0.005 0.208±0.061 0.215±0.043 0.538±0.052 0.609±0.017**益氣活血組方組 15 0.764±0.036**0.585±0.017*0.653±0.053**

3 討 論

心肌梗死屬中醫(yī)學“真心痛”范疇，《黃帝內(nèi)經(jīng)》中對其癥狀有詳細描述，真心痛者，手足青至節(jié)，胸痛徹背，背痛徹心等?；静C為本虛標實，本以氣虛為主，標以血瘀為主［8］，在《素問·痹論》中談到“心痹者，脈不通”“痹……在于脈則血凝而不流”，明確指出了心痛是由于瘀血凝集，心脈痹阻，不通則痛，拘急而劇痛。標實可漸而引起本虛，且真心痛者以中老年居多，本腎氣自半，精血漸衰，胸中之宗氣不下，脈中之血凝而留止，加重心脈攣急。治療上瘀血當通，氣虛宜補，益氣與活血相輔，宗氣得補，下行助心脈之血行，則瘀去而脈利，如此治法，標實得通，本虛得補，瘀血去，新血生［9］。

根據(jù)“益氣活血、祛瘀生新”為治療原則，本文第1作者胡國恒教授精心組方，在臨床上多運用益氣活血組方治療氣虛血瘀型真心痛或胸痹，每每可收獲良效，可以明顯改善心脈瘀滯情況。心臟脈絡漸而通暢，心肌得以濡養(yǎng)，故心肌缺血程度降低，心肌梗死后帶來的并發(fā)癥減少。PDGF促進血管新生，側(cè)支循環(huán)網(wǎng)絡進一步建立，使心肌供血增加，細胞凋亡減少，纖維化及心室重構(gòu)的程度也隨之減小［10］。全方由黃芪、當歸、丹參、川芎4味中藥組成，雖組方精簡，但考慮十分周全。本方以黃芪為君，補元氣而通達三焦；大補宗氣，下行助血運。臣以當歸，活血暢心脈之血行，化瘀通心絡之痹阻，使標實得通，兼以行氣通止，合君藥黃芪使脈氣充足以助血行。佐以丹參通心包絡祛瘀，川芎活血行氣，走而不守，瘀祛而不留。諸藥配伍，使元氣得復，瘀血得祛，新血相生，脈道滑利，故通而痛止。

PDGF在心肌梗死后促進血管新生得到多個研究的證實。它是一種由A、B肽鏈構(gòu)成的具有多種生物學功能的多肽，是促血管新生的生長因子家族中的一員。PDGF受體在毛細血管內(nèi)皮細胞上表現(xiàn)為高度表達，可使血管發(fā)生效應，從而促進血管新生的作用［11］，雖然相對VEGF和bFGF而言，PDGF促血管新生的作用要弱，但在特殊的器官，例如心臟血管顯得非常重要［12］。它的作用在于［13］：第一，PDGF-AB產(chǎn)物能夠通過促進微血管內(nèi)皮細胞高表達VEGF、VEGFR-2、von Willebrand，間接使血管新生發(fā)生；第二，PDGF能夠顯著增加動脈密度，有促動脈新生的作用；第三，可促進血管壁生成的作用，其機制是通過血管內(nèi)皮細胞分泌的PDGF-BB化學趨化作用募集相應受體的平滑肌細胞及周細胞，使其向內(nèi)皮細胞遷移、黏附，緊密連接后可構(gòu)成血管壁。這種機制既可限制血管的無限擴大，血管形態(tài)得以穩(wěn)定，又可加強保持血管基底膜的完整性，新的血管有穩(wěn)固的細胞壁后可防止血管內(nèi)容物滲漏［14］。第五，調(diào)節(jié)不同類型的血管收縮，機制是通過抑制內(nèi)皮衍生舒張因子的合成和刺激內(nèi)皮細胞誘導一氧化氮的產(chǎn)生而導致的［15］。

本實驗研究試通過制備大鼠急性心肌梗死的動物模型，觀察心肌急性缺血缺氧后形態(tài)學、缺血缺氧性心肌HE染色情況、PDGF蛋白表達。結(jié)果表明：1）HE染色結(jié)果示，實驗組益氣活血組方、陽性藥物對照組與假手術組、模型組相比，前兩者HE染色可見較多增生的毛細血管；2）在促血管新生因子蛋白表達方面，不同組別比較時，PDGF蛋白表達在芪參益氣滴丸組和益氣活血組方表達較其他組別高；從4個組別的3個時相比較時，發(fā)現(xiàn)PDGF在芪參益氣滴丸組和益氣活血組方隨著時間增加，蛋白表達量增多，而假手術組和模型組無此規(guī)律可循，可能隨著時間的增加而減少。通過本次研究結(jié)果的分析，我們可以應證益氣活血組方在改善急性心肌梗死大鼠模型的心肌缺血缺氧情況有效，機制可能是通過促進PDGF的高表達，促進新生血管密度的增加，增加心肌供血，且可形成完整的血管壁，緊密而無滲漏［16］。

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Effects of Yiqi Huoxue Decoction on the Expression of PDGF in Rats with Acute Myocardial Ischemia

HU Guoheng，GONG Chun，WANG Jinxi，et al. The First Affiliated Hospital of Hunan University of TCM，Hunan，Changsha 410007，China.

Objective： To investigate the effect and mechanism of Yiqi Huoxue Decoction on angiogenesis in myocardial tissue of rats with acute ischemia and hypoxia.Methods：A model of acute hypoxic ischemic myocardial infarction was established by ligating the anterior descending branch of the left coronary artery in healthy SD male rats.After the success of the model，45 rats were randomly divided into the model group，Qishen Yiqi Decoction group and Yiqi Huoxue Decoction group.In the sham operation group，15 rats only wore thread without ligation.According to the execution time，each group was randomly divided into 3 d，7 d and 14 d three phase groups.The HE staining and the expression of platelet-derived growth factor （PDGF） protein were observed in different groups at different time.Results： Compared with the sham operation group and the model group，more hyperplastic capillaries were seen in the HE staining of Yiqi Huoxue Decoction group；the expression of PDGF protein was higher in Qishen Yiqi Decoction group and Yiqi Huoxue Decoction group（P<0.01）.When compared at different time in the four groups，the expression of protein in Qishen Yiqi Decoction group and Yiqi Huoxue Decoction group increased with time （P<0.01），but the sham operation group and the model group had no regularity to follow.Conclusion： Yiqi Huoxue Decoction can promote the expression of PDGF and angiogenesis，increase the density of arteries，and form the wall of blood vessel，thus increasing the collateral circulation of heart and improving the myocardial ischemia and hypoxia.

Yiqi Huoxue Decoction；Qishen Yiqi Decoction；Acute myocardial ischemia；Angiogenesis；Platelet derived growth factor（PDGF）

R285.5

A

1004-745X（2017）09-1529-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.09.008

2017-06-07）

湖南省科學技術廳資助項目（2015SK20161，2015SK2016）

△通信作者（電子郵箱：gc89785189@sina.com）