EB病毒microRNA Bart6-5p表達(dá)對鼻咽癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

楊紅杰 朱慶堯 雒建超 韓倩

作者單位：450003 鄭州 河南省人民醫(yī)院放療科

EB病毒microRNA Bart6-5p表達(dá)對鼻咽癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

楊紅杰 朱慶堯 雒建超 韓倩

作者單位：450003 鄭州 河南省人民醫(yī)院放療科

目的探討EB病毒microRNA Bart6-5p表達(dá)對鼻咽癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）的影響。方法 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測EB病毒陽性的鼻咽癌細(xì)胞株C666-1和淋巴瘤細(xì)胞株Akata、Daudi、Raji及Namalwa中microRNA Bart6-5p和Dicer mRNA的表達(dá)，在恒定攜帶EB病毒且microRNA Bart6-5p表達(dá)最高的鼻咽癌細(xì)胞株C666-1中抑制microRNA Bart6-5p表達(dá)后檢測Dicer和與鼻咽癌EMT相關(guān)分子標(biāo)志物E-cadherin、Vimentin、ZEB1和ZEB2 mRNA的表達(dá)。結(jié)果 EB病毒陽性細(xì)胞株中microRNA Bart6-5p mRNA表達(dá)水平按C666-1、Akata、Daudi、Raji及 Namalwa順序依次遞減（P＜0.05），而 Dicer mRNA 表達(dá)水平則依次遞增（P＜0.05）。在恒定攜帶 EB 病毒且microRNA Bart6-5p表達(dá)最高鼻咽癌細(xì)胞株C666-1中抑制microRNA Bart6-5p表達(dá)后，Dicer mRNA表達(dá)呈升高趨勢（P＜0.05），與鼻咽癌 EMT相關(guān)分子標(biāo)志物E-cadherin mRNA表達(dá)呈升高趨勢（P＜0.05），Vimentin、ZEB1及ZEB2 mRNA表達(dá)則呈下降趨勢（P＜0.05）。結(jié)論 EB病毒microRNA Bart6-5p可能通過調(diào)控Dicer基因表達(dá)而進(jìn)一步影響鼻咽癌的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程。

鼻咽腫瘤；微小RNA；EB病毒；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）是解釋腫瘤發(fā)生發(fā)展特別是侵襲與轉(zhuǎn)移的重要理論模型，該理論主要觀點(diǎn)認(rèn)為腫瘤在發(fā)生發(fā)展過程中，腫瘤細(xì)胞由上皮樣細(xì)胞演化到間質(zhì)樣細(xì)胞并發(fā)生腫瘤細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移，其表型（細(xì)胞形態(tài)、侵襲能力等）及基因型（E-cadherin、Vimentin）均發(fā)生相應(yīng)變化，目前該理論在上皮性來源腫瘤中基本都得到證實(shí)［1］。Dicer屬于RNaseⅢ家族成員，是參與microRNA合成的重要蛋白質(zhì)，而microRNA參與細(xì)胞周期和增殖，通過RNA干擾抑制Dicer基因而影響microRNA合成［2-3］。EB病毒是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)可編碼microRNA的病毒，其microRNA表達(dá)譜對于病毒的潛伏及病毒相關(guān)腫瘤發(fā)生有重要作用。本研究初步探索Dicer是否與EB病毒microRNA互相影響，進(jìn)而影響鼻咽癌EMT過程而直接影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

EB病毒陽性鼻咽癌細(xì)胞株C666-1和淋巴瘤細(xì)胞株Akata、Daudi、Raji及 Namalwa 均由中山大學(xué)腫瘤防治中心華南腫瘤學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送。胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、RPMI-1640、OPTI-MEM 無血清培養(yǎng)基購自Gibco公司，實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)試劑SYBR Green I Nucleic、Trizol Reagent及 Lipofectamine 2000 購自Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒及microRNA Bart6-5p抑制劑購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及RNA提取

EB病毒陽性細(xì)胞株用含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞，按照Invitrogen公司Trizol Reagent說明書提取RNA。每6孔板加入1 mL Trizol試劑，微量加樣吸頭反復(fù)吹打勻漿，室溫靜置5～10 min，直至細(xì)胞全部溶化；加入0.2 mL氯仿，振蕩15 s，靜置2～5 min。4℃1 351 r/min離心15 min，取上清液至新的EP管，加入0.5 mL異丙醇，輕輕混勻，4℃放置20～30 min。4 ℃ 1 351 r/min離心10 min，棄上清液。加入1 mL 75%乙醇，輕輕洗滌沉淀。4℃1 068 r/min離心5 min，棄上清液。晾干，加入適量DEPC水溶解RNA。紫外分光光度計(jì)測定RNA濃度，-80℃冰箱保存。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測EB病毒陽性細(xì)胞株中microRNA Bart6-5p和Dicer mRNA的表達(dá)。反應(yīng)體系：cDNA（1∶20）5.0 μL、上游和下游引物各 0.5 μL、2*SYBR Green PCR Master Mix 10 μL、H2O 4 μL，總體積 20 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性10 s，60 ℃退火 20 s，72 ℃延伸 10 s，共 40個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。引物序列見表1。在目前發(fā)現(xiàn)的能夠恒定攜帶EB病毒的鼻咽癌細(xì)胞株C666-1中抑制microRNA Bart6-5p后，再次檢測Dicer及鼻咽癌EMT相關(guān)基因E-cadherin、Vimentin、ZEB1及ZEB2 mRNA的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用2-△△ct法進(jìn)行表達(dá)量相對定量分析。

表1 鼻咽癌EMT相關(guān)分子標(biāo)志物的引物序列

1.4 microRNA Bart6-5p抑制劑轉(zhuǎn)染鼻咽癌C666-1細(xì)胞

將EB病毒microRNA Bart6-5p抑制劑轉(zhuǎn)染目前發(fā)現(xiàn)的能夠恒定攜帶EB病毒的鼻咽癌細(xì)胞株C666-1。microRNA Bart6-5p抑制劑和EB病毒miRNA inhibitor NC按終濃度為100 nmol/L與等體積LP2000混合于OPTI-MEM低血清培養(yǎng)基中，按照LP2000說明書轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后6 h更換10%FBS完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。同時(shí)以O(shè)PTI-MEM低血清培養(yǎng)基設(shè)置空白對照組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。轉(zhuǎn)染12 h后流式細(xì)胞儀（Beckman Coulter Cytomics FC 500）計(jì)數(shù)10 000個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞百分率；熒光倒置顯微鏡（奧林巴斯研究級(jí)倒置顯微鏡IX71）觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用IBM SPSS Statistics 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EB病毒陽性細(xì)胞株中microRNA Bart6-5p與Dicer mRNA的表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，EB病毒陽性細(xì)胞 C666-1、Akata、Daudi、Raji及 Namalwa 中 microRNA Bart6-5p mRNA表達(dá)水平依次遞減（P＜0.05），見圖1A；Dicer mRNA表達(dá)水平則依次遞增（P＜0.05），見圖1B。

圖1 EB病毒陽性細(xì)胞株中microRNA Bart6-5p與Dicer mRNA的表達(dá)

2.2 EB病毒microRNA Bart6-5p抑制劑的轉(zhuǎn)染效率

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，加入EB病毒microRNA Bart6-5p抑制劑后轉(zhuǎn)染率達(dá)77%左右（圖2A），與顯微鏡下（放大100倍）觀察的轉(zhuǎn)染效率一致（圖2B）。

2.3 microRNA Bart6-5p被抑制后Dicer和鼻咽癌EMT相關(guān)分子標(biāo)志物mRNA的變化

明確microRNA Bart6-5p在5株EB病毒陽性細(xì)胞中的表達(dá)后，選取恒定攜帶EB病毒且microRNA Bart6-5p表達(dá)最高的鼻咽癌細(xì)胞C666-1，抑制其microRNA Bart6-5p表達(dá)后觀察Dicer和鼻咽癌EMT相關(guān)分子標(biāo)志物E-cadherin、Vimentin、ZEB1和ZEB2 mRNA的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EB病毒的microRNA Bart6-5p被抑制后，Dicer基因mRNA表達(dá)呈升高趨勢（F=1.637，P＜0.05），與鼻咽癌 EMT 呈正相關(guān)關(guān)系的分子標(biāo)志物E-cadherin mRNA表達(dá)亦升高（F=2.764，P＜0.05），而與EMT呈負(fù)相關(guān)關(guān)系的分子標(biāo)志物Vimentin、ZEB1和ZEB2 mRNA表達(dá)則呈下降趨勢（F=1.527、2.847、1.219，P＜0.05）。見圖 3。

圖2 EB病毒microRNA Bart6-5p抑制劑的轉(zhuǎn)染效率

圖3 microRNA Bart6-5p被抑制后Dicer及鼻咽癌EMT相關(guān)分子標(biāo)志物mRNA的變化

3 討論

EB病毒是皰疹病毒家族成員，目前感染人類的皰疹病毒有8種，EB病毒是其中之一［4］。EB病毒目前被認(rèn)為與多種疾病相關(guān)，其中包括非洲伯基特淋巴瘤［5-6］、霍奇金?。?-8］、胃腺癌［9］、乳腺癌［10-11］、鼻咽癌［12］及單核細(xì)胞增多癥［3，8］等。microRNA 是內(nèi)源性單鏈非編碼RNA，長22～25nt，與靶基因3'UTR區(qū)種子結(jié)合位點(diǎn)配對結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)。越來越多證據(jù)表明microRNA表達(dá)及功能失調(diào)與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)［13］。

Dicer屬于RNaseⅢ家族成員，是參與microRNA合成的重要蛋白質(zhì)。研究表明，Dicer基因在大部分腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)，可能在腫瘤發(fā)生發(fā)展及浸潤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用［2］。研究發(fā)現(xiàn)77.6%的實(shí)體腫瘤組織樣本中Dicer基因表達(dá)下調(diào)［14］。本研究就Dicer表達(dá)下調(diào)是否與EB病毒microRNA互相影響，進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展進(jìn)行初步探索。此外，Dicer基因也被證實(shí)與鼻咽癌的EMT調(diào)控密切相關(guān)，繼而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。目前該理論在上皮性來源腫瘤基本得到印證［1］。研究表明，EB病毒microRNA Bart6-5p可以靶向調(diào)控宿主細(xì)胞的Dicer［15］。本研究實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，在攜帶EB病毒的鼻咽癌細(xì)胞C666-1 及淋巴瘤細(xì)胞株 Akata、Daudi、Raji和 Namalwa中microRNA Bart6-5p mRNA表達(dá)水平越高，Dicer mRNA表達(dá)水平則相對越低，即EB病毒 microRNA Bart6-5p與Dicer表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。這種靶向調(diào)節(jié)關(guān)系，經(jīng)TargetScan分析發(fā)現(xiàn)Dicer基因3'UTR存在4個(gè)Bart6潛在調(diào)控靶點(diǎn)，亦表明Bart6可能靶向負(fù)調(diào)控宿主細(xì)胞的 Dicer［15］。

Dicer作為microRNA成熟的關(guān)鍵分子，其功能異常決定了microRNA豐度，且Dicer與多種腫瘤預(yù)后密切相關(guān)，可能通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞的EMT而促進(jìn)侵襲與轉(zhuǎn)移。本研究進(jìn)一步研究Dicer隨microRNA Bart6-5p表達(dá)降低而升高后，鼻咽癌EMT相關(guān)分子標(biāo)志物是否隨之變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)恒定攜帶EB病毒的鼻咽癌細(xì)胞C666-1中的microRNA Bart6-5p被抑制后，Dicer mRNA的表達(dá)升高，正向調(diào)節(jié)EMT的分子標(biāo)志物E-cadherin mRNA表達(dá)亦升高，而與EMT呈負(fù)相關(guān)關(guān)系的分子標(biāo)志物Vimentin、ZEB1和ZEB2 mRNA表達(dá)則呈下降趨勢，與Perdig?o-Henriques等［16］報(bào)道一致。由此推測，當(dāng)EB病毒microRNA Bart6-5p降低后，Dicer因失去microRNA Bart6-5p的靶向調(diào)節(jié)作用而反應(yīng)性升高，繼而發(fā)揮EMT調(diào)節(jié)作用，影響下游相關(guān)基因，最終影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

本研究結(jié)果初步證明，在感染EB病毒情況下，EB病毒可能通過microRNA Bart6-5p靶向調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞Dicer基因影響鼻咽癌的EMT，從而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。但本研究仍處于初步階段，EB病毒microRNA對鼻咽癌EMT過程存在的潛在調(diào)節(jié)作用及其具體機(jī)制，有待進(jìn)一步探索。

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［2017-06-06收稿］［2017-07-08修回］［編輯 羅惠予］

Role of EBV microRNA Bart6-5p in the epithelial-mesenchymal transition in nasopharyngeal carcinoma

Yang Hongjie，Zhu Qingyao，Luo Jianchao，Han Qian
（Department of Radiation Oncology，Henan Provincial People's Hospital，Zhengzhou 450003，P.R.China）

ObjectiveTo investigate the ability of Epstein-Barr virus（EBV）microRNA Bart 6-5p to regulate Dicer expression and thereby influence the epithelial-mesenchymal transition（EMT）in nasopharyngeal carcinoma cells.MethodsExpression of microRNA Bart6-5p and Dicer were quantitated using real-time quantitative PCR in the EBV-positive nasopharyngeal carcinoma cell line C666-1 and lymphoma cell lines Akata，Daudi，Raji and Namalwa.In C666-1 cells with the highest EBV load，microRNA Bart6-5p expression was inhibited and subsequent changes in levels of EMT-related molecular markers were examined.ResultsBart6-5p expression followed the trend C666-1＞Akata＞Daudi＞Raji＞Namalwa，while Dicer followed the inverse trend.Inhibiting Bart6-5p expression in C666-1 increased expression of Dicer and the positive EMT marker E-cadherin，while it decreased expression of the negative EMT markers vimentin，ZEB1 and ZEB2.ConclusionEBV microRNA Bart6-5p can influence the EMT in nasopharyngeal carcinoma by regulating Dicer expression.

Nasopharyngeal neoplasm；microRNA；Epstein-Barr virus；Eepithelial mesenchymal transition

Zhu Qingyao.E-mail：zhuqingyao1983@sina.com

R739.63

A

1674-5671（2017）04-04

10.3969/j.issn.1674-5671.2017.04.11

朱慶堯。E-mail：zhuqingyao1983@sina.com