shRNA沉默Annxin A2基因?qū)Ψ派淇咕鼙茄拾┘?xì)胞遷移和侵襲的影響

何火聰 蘇穎 林可焴 鄒長(zhǎng)棪 陳超

作者單位：350014 福州 福建省腫瘤醫(yī)院/福建醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院放射生物學(xué)及腫瘤放射治療學(xué)研究室；福建省科技廳轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

shRNA沉默Annxin A2基因?qū)Ψ派淇咕鼙茄拾┘?xì)胞遷移和侵襲的影響

何火聰 蘇穎 林可焴 鄒長(zhǎng)棪 陳超

作者單位：350014 福州 福建省腫瘤醫(yī)院/福建醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院放射生物學(xué)及腫瘤放射治療學(xué)研究室；福建省科技廳轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

目的探討shRNA沉默Annxin A2基因?qū)Ψ派淇咕鼙茄拾┘?xì)胞遷移和侵襲的影響。方法 采用FuGENE HD將Annexin A2 shRNA轉(zhuǎn)染放射抗拒的鼻咽癌CNE2（R743）細(xì)胞，qRT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染細(xì)胞中Annxin A2基因的表達(dá)，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)觀察下調(diào)Annxin A2基因表達(dá)及聯(lián)合照射對(duì)鼻咽癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響，Western blot檢測(cè)細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）蛋白的表達(dá)。結(jié)果 轉(zhuǎn)染組細(xì)胞Annexin A2基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量為（0.25±0.17），較對(duì)照組的（1±0.00）和轉(zhuǎn)染對(duì)照組的（0.96±0.06）明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，下調(diào)Annxin A2基因表達(dá)可抑制照射誘導(dǎo)的CNE2（R743）細(xì)胞的遷移能力（P<0.05）。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，下調(diào)Annxin A2基因表達(dá)可抑制照射誘導(dǎo)的CNE2（R743）細(xì)胞的遷移和侵襲能力（P<0.05）。Western blot結(jié)果表明，下調(diào)Annxin A2基因表達(dá)能抑制照射誘導(dǎo)的MMP2蛋白的表達(dá)上調(diào)（P<0.05）。結(jié)論下調(diào)Annxin A2基因表達(dá)能抑制照射誘導(dǎo)放射抗拒的鼻咽癌CNE2（R743）細(xì)胞的遷移和侵襲能力，可能與MMP2蛋白表達(dá)下調(diào)相關(guān)。

鼻咽腫瘤；Annxin A2基因；放射抗拒；鼻咽癌CNE2（R743）細(xì)胞；遷移；侵襲

鼻咽癌是我國(guó)南方常見的惡性腫瘤之一。放療后殘余病灶的局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是制約其療效和預(yù)后的主要瓶頸，而導(dǎo)致病灶殘余的主要原因之一是放射抗拒［1］。Annexin A2是鈣離子依賴的磷脂結(jié)合蛋白，與多種惡性腫瘤增殖、遷移和侵襲密切相關(guān)［2-4］。我們前期的克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，沉默Annexin A2基因可提高放射抗拒鼻咽癌細(xì)胞的放射敏感性［5］。但目前有關(guān)Annexin A2基因表達(dá)及聯(lián)合照射與鼻咽癌遷移和侵襲的相關(guān)性研究未見報(bào)道。為探討Annexin A2基因表達(dá)及聯(lián)合照射對(duì)鼻咽癌遷移和侵襲的影響，本研究利用shRNA下調(diào)放射抗拒鼻咽癌CNE2（R743）細(xì)胞中Annexin A2基因的表達(dá)，通過劃痕實(shí)驗(yàn)、遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)探討放射前后鼻咽癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的變化，并觀察各組細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）的表達(dá)，為探討Annexin A2基因?qū)Ρ茄拾┓派涿舾行缘挠绊懠捌錂C(jī)制的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑、pGeneClip空載體及pGeneClip ANXA2 shRNA載體購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司；RPMI-1640購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；新生牛血清（四季青）購(gòu)自浙江天杭生物科技股份有限公司；基質(zhì)膠Matrigel Matrix和纖連蛋白Fibronectin購(gòu)自美國(guó)CORNING公司；胰酶干粉購(gòu)自美國(guó)AMRESCO公司；Millicell細(xì)胞培養(yǎng)小室（8.0 μm）購(gòu)自德國(guó) Merck Millipore公司；24孔細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自丹麥NUNC公司；NC 膜購(gòu)自美國(guó) General Electric Company（GE）公司；Annexin A2、MMP2 和 β-actin 等一抗購(gòu)自美國(guó)CST公司；BCA蛋白定量試劑盒、HRP標(biāo)記的二抗和ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；結(jié)晶紫染色液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 細(xì)胞株及培養(yǎng)

放射抗拒的鼻咽癌CNE2（R743）細(xì)胞由福建省腫瘤醫(yī)院放射生物研究室以鼻咽癌CNE-2細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)建立并保存［6］。CNE2（R743）細(xì)胞培養(yǎng)于含 20%新生牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液中，在5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

經(jīng)FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑將pGeneClip空載體及pGeneClip ANXA2 shRNA重組載體轉(zhuǎn)染CNE-2（R743）細(xì)胞（對(duì)照組）分別構(gòu)建轉(zhuǎn)染對(duì)照組細(xì)胞和轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后加含20%新生牛血清RPMI-1640新培養(yǎng)液，繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 qRT-PCR檢測(cè)Annexin A2基因mRNA的表達(dá)

收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行Annexin A2基因的熒光定量PCR檢測(cè)。內(nèi)參照β-actin上游引物：5'-GGAAATCGTGCGTGAC-3'，下游引物：5'-ATGCCCAGGAAGGAA-3'。AnnexinA2上游引物：5'-ACCTGGAGACGGTGATTT-3'，下游引物：5'-TGCTCTTCTACCCTTTGC-3'。qPCR 反應(yīng)體系（20 μL）：去離子水6 μL，PCR 上下游引物（10 μM）各 1 μL，Master Mix 10 μL，DNA 模板 2 μL。qPCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；擴(kuò)增（95 ℃ 變性10 s，60℃退火10 s，72℃延伸20 s），共40個(gè)循環(huán)；熔解曲線 95℃ 變性 10 s，60℃退火 1 min，然后升溫至95℃（每1℃采集5次熒光，連續(xù)采集）；40 ℃冷卻 30 s。以 2-ΔΔCt值代表Annexin A2基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞用胰酶消化后，接種于24孔板，待每孔細(xì)胞密度約達(dá)90%時(shí)，以無菌載玻片做依靠，用無菌20 μL移液器tip頭在每孔中心軸垂直劃痕，溫PBS洗盡懸浮細(xì)胞，每孔加入1 mL無血清RPMI-1640培養(yǎng)液，倒置顯微鏡下拍照（0 h），4 Gy X線照射后繼續(xù)原培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，24 h后倒置顯微鏡下再次拍照，測(cè)量劃痕的愈合程度，劃痕愈合率=（24 h后劃痕愈合寬度）/（0 h劃痕寬度）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

吸取 3 μL纖連蛋白（1 mg/mL）均勻涂抹在Transwell小室的上室外膜，置于24孔板中37℃靜置4 h。細(xì)胞消化后用無血清RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整濃度至 1×106個(gè)/mL，取上述細(xì)胞懸液100 μL加至Transwell小室的上室，下室加入600 μL含20%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，各設(shè)3個(gè)復(fù)孔。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出Transwell小室的上室，用干棉簽輕輕擦盡上室內(nèi)膜上未遷移的細(xì)胞，晾干，甲醇固定30 min，每孔加入0.1%結(jié)晶紫染液600 μL，染色10～20 min，棄染液，雙蒸水浸洗去除染色液。顯微鏡下（×200）拍照，計(jì)數(shù)并比較穿膜的細(xì)胞數(shù)，每膜計(jì)數(shù)上、下、左、右、中5個(gè)不同視野的總細(xì)胞數(shù)，取平均值。

1.7 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力

將凍存于-20℃冰箱的Matrigel Matrix膠放置4℃過夜，使成液態(tài)。低溫下用750 μL無血清RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋250 μL Matrigel原液。向Transwell小室的上室分別加入100 μL的Matrigel稀釋液，放入37℃培養(yǎng)箱中靜置1 h使Matrigel Matrix聚合成凝膠。后續(xù)步驟同上述Transwell實(shí)驗(yàn)，通過計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)反映細(xì)胞的侵襲能力。

1.8 Western blot檢測(cè)細(xì)胞MMP2及Annexin A2基因的表達(dá)

胰酶消化、離心收集各組細(xì)胞，用含100 μmol/L PMSF的PBS重懸細(xì)胞，冰浴中超聲破碎細(xì)胞，4℃12 000 r/min離心10 min，收集上清液，用BCA試劑盒測(cè)定總蛋白濃度。將定量的蛋白經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，120 V恒壓1 h轉(zhuǎn)移至NC膜，3%BSA于4℃封閉過夜，TTBS（Tris-HCl 20 mmol/L pH 7.2，NaCl 150 mmol/L，吐溫-20 0.1%）洗膜，然后分別加入Annexin A2、MMP2和β-actin一抗與膜上抗原結(jié)合，用相應(yīng)HRP偶聯(lián)的二抗與其反應(yīng)后，加ECL化學(xué)發(fā)光試劑，在Carestream公司的4000 MM PRO多功能成像分析系統(tǒng)采集數(shù)據(jù)并分析。以MMP2蛋白與內(nèi)參照β-actin蛋白電泳條帶的吸光度比值表示MMP2蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0軟件對(duì)組間數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 shRNA轉(zhuǎn)染下調(diào)CNE2（R743）細(xì)胞Annexin A2基因的表達(dá)

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞Annexin A2基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量為（0.25±0.17），較對(duì)照組的（1±0.00）和轉(zhuǎn)染對(duì)照組的（0.96±0.06）明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；對(duì)照組與轉(zhuǎn)染對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖1。提示轉(zhuǎn)染組細(xì)胞Annexin A2基因表達(dá)明顯下調(diào)。

2.2 下調(diào)Annexin A2基因表達(dá)及聯(lián)合照射對(duì)CNE2（R743）細(xì)胞劃痕愈合的影響

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，劃痕后24 h，未照射（0 Gy）轉(zhuǎn)染組劃痕愈合率為（40.63±3.12）%，明顯低于對(duì)照組的（57.78±1.93）%和轉(zhuǎn)染對(duì)照組的（56.67±6.67），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明下調(diào)Annexin A2基因表達(dá)可明顯抑制CNE2（R743）細(xì)胞遷移。4 Gy照射后，轉(zhuǎn)染組劃痕愈合率為（58.55±4.37）%，明顯低于對(duì)照組的（77.42±3.23）% 和轉(zhuǎn)染對(duì)照組的（73.96±6.51）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖 2A和圖2B。4 Gy照射對(duì)照組和轉(zhuǎn)染對(duì)照組的劃痕愈合率明顯高于未照射對(duì)照組和轉(zhuǎn)染對(duì)照組（P<0.05），提示照射可誘導(dǎo)CNE2（R743）細(xì)胞遷移。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明下調(diào)Annexin A2基因表達(dá)可明顯抑制照射誘導(dǎo)的放射抗拒鼻咽癌CNE2（R743）細(xì)胞的遷移能力。

圖1 3組細(xì)胞Annexin A2基因mRNA的表達(dá)

圖2 下調(diào)Annexin A2基因及聯(lián)合照射對(duì)CNE2（R743）細(xì)胞劃痕愈合的影響

2.3 下調(diào)Annexin A2基因表達(dá)可抑制照射誘導(dǎo)CNE2（R743）細(xì)胞的遷移

Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，未照射（0 Gy）轉(zhuǎn)染組的遷移細(xì)胞數(shù)為（12±3）個(gè)，明顯低于對(duì)照組的（38±4）個(gè)和轉(zhuǎn)染對(duì)照組的（37±2）個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示下調(diào)Annexin A2基因表達(dá)可抑制CNE2（R743）細(xì)胞的遷移能力。4 Gy照射后轉(zhuǎn)染組的遷移細(xì)胞數(shù)為（32±3）個(gè)，明顯低于對(duì)照組的（62±4）個(gè)和轉(zhuǎn)染對(duì)照組的（64±1）個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖3A和圖3B。4 Gy照射對(duì)照組和轉(zhuǎn)染對(duì)照組的遷移細(xì)胞數(shù)明顯高于未照射的對(duì)照組和轉(zhuǎn)染對(duì)照組（P<0.05），提示4 Gy照射可誘導(dǎo)CNE2（R743）細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)。上述結(jié)果表明，下調(diào)Annexin A2基因表達(dá)能明顯抑制4 Gy照射誘導(dǎo)CNE2（R743）細(xì)胞的遷移能力。

圖3 下調(diào)Annexin A2基因及聯(lián)合照射對(duì)CNE2（R743）細(xì)胞遷移能力的影響

2.4 下調(diào)Annexin A2基因表達(dá)抑制照射誘導(dǎo)CNE2（R743）細(xì)胞的侵襲

本研究利用鋪有基質(zhì)膠的Transwell小室觀察Annexin A2基因下調(diào)及聯(lián)合照射對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響，結(jié)果顯示，未照射（0 Gy）轉(zhuǎn)染組的侵襲細(xì)胞數(shù)為（7±1）個(gè)，明顯低于對(duì)照組的（19±2）個(gè)和轉(zhuǎn)染對(duì)照組的（17±3）個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示下調(diào)Annexin A2基因表達(dá)可抑制CNE2（R743）細(xì)胞的侵襲能力。4 Gy照射后轉(zhuǎn)染組的侵襲細(xì)胞數(shù)為（14±2）個(gè)，明顯低于對(duì)照組的（32±3）個(gè)和轉(zhuǎn)染對(duì)照組的（34±2）個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖4A和圖4B。4 Gy照射對(duì)照組和轉(zhuǎn)染對(duì)照組的侵襲細(xì)胞數(shù)明顯高于未照射的對(duì)照組和轉(zhuǎn)染對(duì)照組（P<0.05），提示4 Gy照射可誘導(dǎo)CNE2（R743）細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)。上述結(jié)果表明下調(diào) Annexin A2基因表達(dá)能明顯抑制照射誘導(dǎo)CNE2（R743）細(xì)胞的侵襲能力。

圖4 下調(diào)Annexin A2基因及聯(lián)合照射對(duì)CNE2（R743）細(xì)胞侵襲能力的影響

2.5 下調(diào)Annexin A2基因表達(dá)及聯(lián)合照射對(duì)MMP2蛋白表達(dá)的影響

檢測(cè)各組細(xì)胞MMP2蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，未照射的轉(zhuǎn)染組細(xì)胞MMP2蛋白的相對(duì)表達(dá)量為（0.14±0.02），較相對(duì)應(yīng)對(duì)照組的（0.28±0.01）和轉(zhuǎn)染對(duì)照組的（0.29±0.02）明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖5A和圖5B。4 Gy照射后轉(zhuǎn)染組的MMP2蛋白的相對(duì)表達(dá)量為（0.20±0.02），明顯低于對(duì)照組的（0.87±0.10）和轉(zhuǎn)染對(duì)照組的（0.88±0.08），差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。4 Gy照射的對(duì)照組和轉(zhuǎn)染對(duì)照組的MMP2蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯高于未照射對(duì)照組和轉(zhuǎn)染對(duì)照組（P<0.05），提示下調(diào)Annexin A2基因表達(dá)能明顯抑制照射誘導(dǎo)CNE2（R743）細(xì)胞的MMP2蛋白表達(dá)的提高。

圖5 下調(diào)Annexin A2基因及聯(lián)合照射對(duì)MMP2蛋白表達(dá)的影響

3 討論

放療是鼻咽癌首選的治療方法，隨著放療技術(shù)的進(jìn)步，鼻咽癌患者放療后局部復(fù)發(fā)率和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率均明顯降低。尤其采用調(diào)強(qiáng)放療技術(shù)后，鼻咽癌3年無局部復(fù)發(fā)生存率可達(dá)90%以上，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率達(dá)80%以上，但仍有約80%的腫瘤復(fù)發(fā)于射線高照射劑量區(qū)，約20%的患者最終出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［7］。鼻咽癌放療失敗的主要原因是鼻咽癌組織中存在一定比例的放射抗拒細(xì)胞，放療后殘留的這些腫瘤細(xì)胞不僅放射抗拒性增強(qiáng)，而且更具侵襲性，易發(fā)生局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，放射抗拒及侵襲轉(zhuǎn)移成為制約鼻咽癌療效的瓶頸［8］。

Annexin A2基因過表達(dá)與惡性腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)Annexin A2基因的表達(dá)可導(dǎo)致腎癌、子宮內(nèi)膜癌和結(jié)直腸癌惡性進(jìn)展［9-11］。對(duì)14種不同腫瘤（不包括鼻咽癌）共2 321例患者的Meta分析結(jié)果表明，Annexin A2基因過表達(dá)與患者的不良預(yù)后呈正相關(guān)［12］。本研究結(jié)果顯示，下調(diào)Annexin A2基因的表達(dá)能降低放射抗拒的鼻咽癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。目前，Annexin A2基因被認(rèn)為是與放射抗拒相關(guān)的基因之一，我們的前期研究結(jié)果表明Annexin A2蛋白過表達(dá)的鼻咽癌細(xì)胞對(duì)X射線較抗拒，低表達(dá)的鼻咽癌細(xì)胞對(duì)X射線較敏感［13］。但有關(guān)Annexin A2基因的表達(dá)下調(diào)及聯(lián)合照射與鼻咽癌細(xì)胞遷移和侵襲的相關(guān)性仍未見相關(guān)報(bào)道，本研究通過劃痕和Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)探討Annexin A2基因表達(dá)下調(diào)及聯(lián)合照射對(duì)鼻咽癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。

越來越多的研究結(jié)果表明，放療在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)促進(jìn)了殘存的腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。Nalla等［14］研究發(fā)現(xiàn)放射能促進(jìn)成神經(jīng)管細(xì)胞瘤侵襲和遷移。Pickhard等［15］證實(shí)放射后的頭頸鱗狀細(xì)胞癌HN、BHY和CAL-27細(xì)胞的遷移能力增強(qiáng)。高敏等［16］研究發(fā)現(xiàn)X線照射后肺腺癌A549細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力較照射前明顯增強(qiáng)。本研究通過劃痕和Transwell小室實(shí)驗(yàn)同樣發(fā)現(xiàn)，4 Gy劑量照射后對(duì)照組和轉(zhuǎn)染對(duì)照組細(xì)胞劃痕愈合率和遷移細(xì)胞數(shù)增多，穿過鋪有基質(zhì)膠Transwell小室的細(xì)胞增多，提示4 Gy照射誘導(dǎo)了對(duì)照組和轉(zhuǎn)染對(duì)照組鼻咽癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力增強(qiáng)。但shRNA下調(diào)CNE2（R743）細(xì)胞Annexin A2基因表達(dá)后，細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯下降，說明shRNA沉默Annexin A2基因能抑制放射誘導(dǎo)鼻咽癌CNE2（R743）細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrixc，ECM）是存在于細(xì)胞之間的動(dòng)態(tài)網(wǎng)狀細(xì)胞構(gòu)架，由膠原、蛋白聚糖和糖蛋白等大分子物質(zhì)組成，是防止腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的屏障，它的降解是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的前提［17-19］。腫瘤細(xì)胞分泌的許多酶類可以降解ECM成分中的大分子蛋白，其中基質(zhì)金屬蛋白酶MMPs被認(rèn)為是最重要的一類，它們能特異地與ECM各種成分結(jié)合，通過降解ECM在腫瘤侵襲過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［20］。MMP2是所有MMPs中分布最廣，位于腫瘤細(xì)胞質(zhì)膜上，是MMPs激活過程中的關(guān)鍵酶之一。Kumar等［21］提出直腸癌患者接受高劑量放療后，腫瘤MMP2的活性增強(qiáng)。此后Speake等［22］也在直腸癌患者放療前后的腫瘤組織及周圍正常黏膜組織中發(fā)現(xiàn)，放療后癌細(xì)胞MMP2表達(dá)增強(qiáng)，而周圍正常黏膜組織MMP2表達(dá)無明顯改變。本研究結(jié)果亦顯示，照射可上調(diào)鼻咽癌細(xì)胞CNE2（R743）MMP2的表達(dá)，且細(xì)胞遷移侵襲能力的變化與MMP2表達(dá)水平一致，即放射誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞CNE2（R743）MMP2表達(dá)增加，從而導(dǎo)致細(xì)胞遷移、侵襲能力增強(qiáng)。Annexin A2是異源四聚體，通過結(jié)合血纖維蛋白溶酶原使血纖維蛋白溶酶原被剪切成血纖維蛋白溶酶，后者能激活基質(zhì)金屬蛋白酶前體pro-MMPs成基質(zhì)金屬蛋白酶MMPs［23］，提示 Annexin A2是調(diào)控包括MMP2的MMPs表達(dá)的主要基因之一。本研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)鼻咽癌細(xì)胞CNE（R743）Annexin A2基因表達(dá)能誘導(dǎo)MMP2蛋白表達(dá)水平降低，MMP2蛋白表達(dá)水平降低可能是Annexin A2基因下調(diào)后抑制放射抗拒鼻咽癌細(xì)胞CNE2（R743）遷移和侵襲能力的一個(gè)主要原因。但X線照射后鼻咽癌細(xì)胞侵襲能力及MMP2蛋白表達(dá)增強(qiáng)是否導(dǎo)致體內(nèi)的轉(zhuǎn)移和侵襲能力增強(qiáng)仍有待進(jìn)一步探索。

本實(shí)驗(yàn)采用shRNA沉默鼻咽癌CNE（R743）細(xì)胞Annexin A2基因表達(dá)，成功構(gòu)建沉默Annexin A2基因的轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，該組接受4 Gy X線照射后的細(xì)胞劃痕愈合率、遷移和侵襲能力均較相對(duì)應(yīng)的對(duì)照組和轉(zhuǎn)染對(duì)照組下降，可能與MMP2蛋白的表達(dá)下調(diào)有關(guān)，這一結(jié)果為Annexin A2基因?qū)Ρ茄拾┓派涿舾行缘挠绊懠捌錂C(jī)制研究提供了一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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［2017-07-01收稿］［2017-07-20修回］［編輯 游雪梅］

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（本刊編輯部）

Effects of shRNA-mediated silencing of Annexin A2 on migration and invasion of radioresistant nasopharyngeal carcinoma cells

He Huocong，Su Ying，Lin Keyu，Zou Changyan，Chen Chao
（Fujian Cancer Hospital&Fujian Medical University Cancer Hospital，Laboratory of Radiation Oncology and Radiobiology，F(xiàn)ujian Key Laboratory of Tumor Translational Cancer Medicine，F(xiàn)uzhou 350014，P.R.China）

ObjectiveTo investigate the effect of shRNA-mediated silencing of Annexin A2 and combined irradiation on the migration and invasion of radioresistant nasopharyngeal carcinoma cells.MethodsAnnexin A2 shRNA was transfected into CNE2（R743）cells using FuGENE HD.The expression of Annexin A2 gene in transfected cells was verified by qRT-PCR.The effect of down-regulation of Annexin A2 expression combined with irradiation on the migration and invasion of nasopharyngeal carcinoma cells were determined by scratch assay and transwell chamber assay.The expression of MMP2 was detected by Western blot.ResultsThe relative expression of Annexin A2 mRNA in transfected group（0.25±0.17）was significantly lower than in control group（1±0.00）and transfected control group（0.96±0.06），the difference was statistically significant（P<0.05）.Cell scratches showed that down-regulation of Annexin A2 could inhibit the migration of CNE2（R743）cells induced by irradiation（P<0.05）.Transwell assay showed that down-regulation of Annexin A2 expression inhibited the migration and invasion of CNE2（R743）cells induced by irradiation（P<0.05）.Western blot analysis showed that down-regulation of Annexin A2 could inhibit the upregulation of MMP2 protein expression induced by irradiation（P<0.05）.ConclusionDown-regulation of Annexin A2 can inhibit the migration and invasion of CNE2（R743）cells induced by irradiation，which may be related to the down-regulation of MMP2 protein expression.

Nasopharyngeal neoplasm；Annexin A2 gene；Radioresistant；Nasopharyngeal carcinoma CNE2（R743）cells；Migration；Invasion

Su Ying.E-mail：zjsuying@hotmail.com

R739.63

A

1674-5671（2017）04-07

10.3969/j.issn.1674-5671.2017.04.10

福建省科技計(jì)劃資助項(xiàng)目（2014Y0014）；國(guó)家臨床重點(diǎn)?？平ㄔO(shè)資助項(xiàng)目（國(guó)衛(wèi)辦醫(yī)函〔2013〕544號(hào)）；福建省衛(wèi)生廳臨床重點(diǎn)?？疲ㄎ麽t(yī)類別）建設(shè)資助項(xiàng)目（閩衛(wèi)科教〔2012〕149號(hào)）

蘇穎。E-mail：zjsuying@hotmail.com