鼻咽癌組織中P16、CD4和CD8的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系

李文婷 秦永輝 王若崢

作者單位：830011 烏魯木齊 新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院1病理科，2頭頸放療科

鼻咽癌組織中P16、CD4和CD8的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系

李文婷1秦永輝2王若崢2

作者單位：830011 烏魯木齊 新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院1病理科，2頭頸放療科

王若崢，博士后，教授，主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師，享受國務(wù)院特殊津貼專家?，F(xiàn)任新疆維吾爾自治區(qū)腫瘤防治研究所副所長、新疆維吾爾自治區(qū)腫瘤學(xué)重點實驗室主任、新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院放療中心主任、放療教研室主任。兼任中華醫(yī)學(xué)會放射腫瘤學(xué)學(xué)會委員，國家腫瘤質(zhì)控中心放射治療質(zhì)控專家委員會委員，中國抗癌協(xié)會放射治療專業(yè)委員會委員，中國醫(yī)師協(xié)會放射治療專業(yè)委員會常務(wù)委員，中國抗癌協(xié)會鼻咽癌專業(yè)委員會委員，新疆醫(yī)學(xué)會放射腫瘤學(xué)分會主任委員，新疆放射治療質(zhì)量控制中心主任委員，新疆醫(yī)學(xué)會腫瘤學(xué)分會常務(wù)委員，西部放射治療協(xié)會常務(wù)理事，牛津大學(xué)客座研究員，科技部專家?guī)煸u審專家，教育部學(xué)位論文評審專家等。擔(dān)任《中華放射腫瘤學(xué)雜志》、《中華放射與防護雜志》、《實用癌癥雜志》、《新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報》、《新疆醫(yī)學(xué)》等雜志編委。從事放療專業(yè)30年，在腫瘤放射治療領(lǐng)域有獨到之處。近5年主持國家自然基金地區(qū)聯(lián)合重點項目1項、國家科技部國際合作資助項目1項、國家自然基金科學(xué)基金資助項目2項；2016年獲新疆維吾爾自治區(qū)科技進步獎一等獎，2013年獲新疆維吾爾自治區(qū)科技進步獎二等獎，2014年獲新疆維吾爾自治區(qū)優(yōu)秀論文二等獎。主編教材1部、專著1部，參編教材2部；以第一或通信作者發(fā)表SCI論文14篇，核心期刊論文60余篇。

目的探討鼻咽癌組織中P16、CD4和CD8的表達(dá)及其與鼻咽癌患者臨床特點及預(yù)后的關(guān)系。方法采用免疫組化法檢測133例鼻咽癌組織中P16、CD4和CD8的表達(dá)情況，分析其表達(dá)與鼻咽癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果133例鼻咽癌組織中，P16的陰性表達(dá)率為75.9%（101/133），陽性表達(dá)率為24.1%（32/133）；CD4的陰性表達(dá)率為75.2%（100/133），陽性表達(dá)率為 24.8%（33/133）；CD8 陰性表達(dá)率為 76.7%（102/133），陽性表達(dá)率為 23.3%（31/133）。P16與CD4在鼻咽癌組織中的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），二者呈正相關(guān)趨勢（r＝0.206，P=0.094）；P16、CD4和CD8在不同性別、年齡、民族、吸煙史、腫瘤家族史、臨床分期患者中的表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），但P16表達(dá)在不同性別患者（P=0.069）、CD8表達(dá)在不同臨床分期患者（P=0.085）中的差異均為臨界值；P16、CD4、CD8陰性表達(dá)和陽性表達(dá)患者5年總生存率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），但CD4陽性表達(dá)與陰性表達(dá)患者5年無瘤生存率（P=0.002）及5年無局部復(fù)發(fā)生存率（P=0.024）差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論 P16、CD4和CD8表達(dá)與鼻咽癌患者性別、臨床分期有關(guān)。CD4陽性表達(dá)患者預(yù)后可能更佳，聯(lián)合檢測P16、CD4和CD8在鼻咽癌中的表達(dá)或可作為判定鼻咽癌患者生物學(xué)行為及預(yù)后評估的依據(jù)。

鼻咽腫瘤；P16；CD4；CD8；臨床病理學(xué)；預(yù)后

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是發(fā)生于鼻咽腔頂部和側(cè)壁的惡性腫瘤，已知的病因包括EB病毒感染、遺傳、環(huán)境因素等，放療是首選的治療方法。P16是細(xì)胞周期素依賴性激酶（cyclin dependent kinases，CDKs）抑制劑［1］，P16 蛋白表達(dá)情況可能是推測機體HPV感染狀態(tài)的證據(jù)之一［2］。CD4+T細(xì)胞識別外源性抗原，與MHCⅡ類分子結(jié)合，活化的效應(yīng)細(xì)胞主要為Th細(xì)胞。CD8+T細(xì)胞識別內(nèi)源性抗原，與MHCⅠ類分子結(jié)合，活化的效應(yīng)細(xì)胞為細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL或Tc）［3］。研究顯示，腫瘤中病毒抗原可引起機體抗腫瘤應(yīng)答，觸發(fā)腫瘤特異性CD4+輔助分子和CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞活化與增殖［4］。本研究采用免疫組織化學(xué)方法檢測133例鼻咽癌患者活檢組織中P16、CD4和CD8的表達(dá)，并探討其與鼻咽癌患者臨床特點及預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本

選取并整理新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科2010～2014年收集的鼻咽癌活檢石蠟包埋組織133例。所有病例經(jīng)核實無重復(fù)，年齡、性別、民族、病理診斷等臨床病理資料完整，組織標(biāo)本均經(jīng)HE染色，進行組織學(xué)觀察和復(fù)診。組織學(xué)類型參照2006年WHO頭頸部腫瘤病理學(xué)和遺傳學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)［5］，臨床分期采用中國鼻咽癌2008分期標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 方法

所有組織標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，3～4 μm厚連續(xù)切片，進行免疫組織化學(xué)染色。免疫組化染色所用的抗體 P16（克隆號 16p04JC2，1∶50）、CD4（克隆號 EP204，1∶100）、CD8（克隆號 SP16，1∶150）、PV-6000免疫組化測試劑盒均購自北京中杉金橋生物公司。常規(guī)脫蠟、脫水，EDTA（PH8.0）高壓修復(fù)，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，光鏡下觀察。具體實驗步驟按試劑盒說明進行。每組實驗均設(shè)置陽性及空白對照，以PBS代替一抗作陰性對照，P16以宮頸鱗癌作為陽性對照，CD4和CD8以鼻咽組織中淋巴細(xì)胞作為內(nèi)對照。

1.3 結(jié)果判定

P16定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，以腫瘤細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，腫瘤間質(zhì)不著色。CD4、CD8定位于細(xì)胞膜，以腫瘤細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽性，腫瘤間質(zhì)不著色或部分淋巴細(xì)胞著色。P16、CD4、CD8結(jié)果判讀依據(jù)染色陽性細(xì)胞數(shù)計算，結(jié)合文獻［6-7］及本實驗結(jié)果，P16表達(dá)≥5%腫瘤細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)著色為陽性，<5%腫瘤細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)著色為陰性。CD4、CD8表達(dá)≥10%腫瘤細(xì)胞膜著色為陽性，<10%腫瘤細(xì)胞膜著色為陰性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，相關(guān)性分析采用Person相關(guān)分析，采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存曲線比較行l(wèi)og-rank檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 P16、CD4和CD8在鼻咽癌組織中的表達(dá)

133 例鼻咽癌組織中EBV原位雜交的感染率為84.96%（圖1A～B）。P16在133例鼻咽癌組織中陰性表達(dá)率為75.9%（101/133），陽性表達(dá)率為 24.1%（32/133）。P16在鼻咽癌組織中呈陰性表達(dá)腫瘤成分及腫瘤間質(zhì)均不著色（圖1C），以同批實驗中宮頸鱗癌組織作對照呈陽性表達(dá)（如圖1D）；P16陽性表達(dá)呈棕黃色細(xì)顆粒表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)（圖1E）或細(xì)胞核（圖1F），腫瘤間質(zhì)均不著色。

CD4在鼻咽癌組織中陰性表達(dá)率為75.2%（100/133），陽性表達(dá)率為 24.8%（33/133），CD4 蛋白呈棕黃色細(xì)顆粒表達(dá)在鼻咽癌組織的細(xì)胞膜（圖1G），腫瘤組織及間質(zhì)均不著色為陰性表達(dá)（圖1H）；CD8陰性表達(dá)率為76.7%（102/133），陽性表達(dá)率為23.3%（31/133），CD8蛋白呈深棕黃色細(xì)顆粒表達(dá)在鼻咽癌組織的細(xì)胞膜（圖1I），腫瘤組織及間質(zhì)均不著色為陰性表達(dá)（圖 1J）。

圖1 P16、CD4和CD8在鼻咽癌組織中的表達(dá)

2.2 P16、CD4和CD8表達(dá)與鼻咽癌臨床病理特征的關(guān)系

133 例鼻咽癌患者年齡15～91歲，中位年齡為50.3歲。P16、CD4和CD8在不同性別、年齡、民族、吸煙史、腫瘤家族史、臨床分期患者中的表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），但P16表達(dá)在不同性別患者（P=0.069）、CD8表達(dá)在不同臨床分期患者（P=0.085）中的差異均介于臨界值，見表1。

表1 P16、CD4、CD8表達(dá)與鼻咽癌患者臨床病理特征的關(guān)系

（續(xù)表）

2.3 鼻咽癌組織中P16表達(dá)與CD4、CD8表達(dá)的關(guān)系

鼻咽癌組織中P16及CD4均陰性表達(dá)的患者最多，P16及CD4均表達(dá)陽性者最少，P16在鼻咽癌組織中的表達(dá)與CD4在鼻咽癌組織中的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），兩者呈正相關(guān)趨勢（r=0.206，P=0.094）。P16與CD8在鼻咽癌組織中的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），兩者呈正相關(guān)趨勢（r=0.064，P=0.090）。

2.4 P16、CD4和CD8表達(dá)與鼻咽癌患者預(yù)后的關(guān)系P16、CD4、CD8陰性表達(dá)和陽性表達(dá)患者5年總生存率（overall survival，OS）比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見圖2。CD4陽性表達(dá)患者5年無瘤生存率（disease-free survival，DFS）顯著高于陰性患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（92.6%vs 45.4%，P=0.002），見圖 3。P16、CD4、CD8陰性表達(dá)和陽性表達(dá)患者5年無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存率（distant metastasis-free survival，DMFS）比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見圖4。CD4陽性表達(dá)患者5年無局部復(fù)發(fā)生存率（local relapse-free survival，LRFS）高于陰性患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（96.3%vs 71.2%，P=0.024），見圖 5。P16、CD4 和 CD8表達(dá)與鼻咽癌患者預(yù)后的關(guān)系見表2。

圖2 P16、CD4、CD8表達(dá)與鼻咽癌患者5年OS的關(guān)系

圖3 P16、CD4、CD8表達(dá)與鼻咽癌患者5年DFS的關(guān)系

圖4 P16、CD4、CD8表達(dá)與鼻咽癌患者5年DMFS的關(guān)系

圖5 P16、CD4、CD8表達(dá)與鼻咽癌患者5年LRFS的關(guān)系

表2 P16、CD4和CD8表達(dá)與鼻咽癌患者預(yù)后的關(guān)系

3 討論

鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展是多因素、多階段、多基因變異積累及相互作用的過程，EBV感染是其明確的病因之一。研究證實，頭頸部鱗癌中可通過P16蛋白表達(dá)推測HPV感染情況，是影響頭頸部鱗癌患者預(yù)后的獨立因素［8］。而鼻咽癌中EBV與HPV雙重感染及交互作用的研究報道較少，目前尚未得出一致的結(jié)論［9-10］。

目前研究發(fā)現(xiàn)P16蛋白表達(dá)陽性患者大多提示預(yù)后不良。韋明壯等［11］認(rèn)為P16蛋白低表達(dá)與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。Lin等［12］發(fā)現(xiàn)P16陰性表達(dá)的腫瘤細(xì)胞放化療的療效更佳。Rosales-Pérez等［6］研究發(fā)現(xiàn)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)以及短期無復(fù)發(fā)生存均可能與P16蛋白陰性表達(dá)有關(guān)。Wen等［13］研究表明，檢測P16表達(dá)可作為指導(dǎo)鼻咽癌診斷和預(yù)測療效的指標(biāo)。成瀟等［14］研究發(fā)現(xiàn)肺癌中HPV相關(guān)蛋白表達(dá)與CD4+和CD8+細(xì)胞表達(dá)呈正相關(guān)。本研究中，P16在133例鼻咽癌組織中的陰性表達(dá)率為75.9%，在鼻咽癌組織中的表達(dá)與CD4在鼻咽癌組織中的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），二者呈正相關(guān)趨勢，可能由于p16基因在對抗EBV感染時機體免疫機制的差異所導(dǎo)致，但目前此類交互作用的研究尚未見報道。

有研究檢測鼻咽癌患者外周血中CD4和CD8相關(guān)T細(xì)胞比例的表達(dá)情況評估鼻咽癌患者的臨床療效。本研究133例鼻咽癌組織中EBV感染率為84.96%，CD4、CD8表達(dá)在不同性別、年齡、民族、吸煙史、腫瘤家族史、臨床分期等患者中的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），但CD8在不同臨床分期患者中的表達(dá)差異介于臨界值（P=0.085），這可能由于地域差異、研究樣本選擇、研究方法不同以及遺傳易感性等差異造成，也可能與腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）有關(guān)，不同腫瘤的TIL細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞比例差異較大，但大多以CD8+T細(xì)胞為主［15］。

在分析P16、CD4和CD8表達(dá)與鼻咽癌患者預(yù)后的關(guān)系時，尚未發(fā)現(xiàn)P16、CD4、CD8表達(dá)陰性、陽性患者5年OS差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），但5年DFS CD4陽性組（92.6%）高于 CD4陰性組（45.4%），5年LRFS CD4陽性組（96.3%）高于CD4陰性組（71.2%），提示CD4表達(dá)陽性患者可能預(yù)后更佳。因此，通過聯(lián)合檢測鼻咽癌組織中P16、CD4和CD8的表達(dá)情況，探討其表達(dá)與鼻咽癌患者臨床特點及預(yù)后的關(guān)系，或有助于鼻咽癌患者生物學(xué)行為及預(yù)后評估。但由于本研究病例數(shù)較少，要明確P16、CD4、CD8與鼻咽癌臨床特點及療效預(yù)后的關(guān)系，尚需繼續(xù)擴大樣本量并增加其他研究指標(biāo)進一步探討。

［1］ Liao GD，Sellors JW，Sun HK，et al.p16INK4A immunohistochemical staining and predictive value for progression of cervical intraepithelial neoplasia grade 1：a prospective study in China［J］.Int J Cancer，2014，134（7）：1715-1724.

［2］ Demir F，Kimiloglu E，Igdem AA，et al.High risk HPV in situ hybridization，p16 INK4A，and survivin expressions in cervical carcinomas and intraepithelial neoplasms：evaluation of prognostic factors［J］.Eur J Gynaecol Oncol，2014，35（6）：708-717.

［3］ Petruccioli E，Chiacchio T，Pepponi I，et al.First characterization of the CD4 and CD8 T-cell responses to QuantiFERON-TB Plus［J］.J Infect，2016，73（6）：588-597.

［4］ Lee H，Lee EJ.HPV infection and p16 promoter methylation as predictors of ASC-US/LSIL progression［J］.Cancer Cytopathol，2016，124（1）：58-65.

［5］ Leon B，John WE，Peter R，et al.WHO classification of tumours of head and neck tumours［M］.Lyon，F(xiàn)rance：IARC Press；2006：91-111.

［6］ Rosales-Pérez S，Cano-Valdez AM，F(xiàn)lores-Balcázar CH，et al.Expression of Epstein-Barr virus-encoded latent membrane protein（LMP-1），p16 and p53 proteins in nonendemic nasopharyngeal carcinoma（NPC）：a clinicopathological study［J］.Arch Med Res，2014，45（3）：229-236.

［7］ M?kitie AA，MacMillan C，Ho J，et al.Loss of p16 expression has prognostic significance in human nasopharyngeal carcinoma［J］.Clin Cancer Res，2003，9（6）：2177-2184.

［8］ 馬玲玲，王多明，吾甫爾·艾克木，等.頭頸部鱗癌人乳頭瘤病毒感染與p16和表皮生長因子受體表達(dá)及患者預(yù)后的關(guān)系［J］.中華腫瘤雜志，2014，36（1）：23-28.

［9］ Dogan S，Hedberg ML，F(xiàn)erris RL，et al.Human papillomavirus and Epstein-Barr virus in nasopharyngeal carcinoma in a low-incidence population［J］.Head Neck，2014，36（4）：511-516.

［10］ Dawson CW，Port RJ，Young LS.The role of the EBV-encoded latent membrane proteins LMP1 and LMP2 in the pathogenesis of nasopharyngeal carcinoma（NPC）［J］.Semin Cancer Biol，2012，22（2）：144-153.

［11］韋明壯，唐奇燎.P16蛋白在鼻咽癌中的表達(dá)及意義［J］.右江民族醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2003，25（6）：770-771.

［12］ Lin HS，Berry GJ，Sun Z，et al.Cyclin D1 and p16 expression in recurrent nasopharyngeal carcinoma［J］.World J Surg Oncol，2006，4：62.

［13］ Wen J，Paul C，Erich S，et al.p16 as a complementary prognostic marker for EBV-positive nasopharyngeal carcinoma［J］.Oncology（Williston Park），2015，29（4 Suppl 1）：205151.

［14］成瀟，尹小文，杜艷萍，等.肺癌組織中HPV相關(guān)蛋白E6和E7與 CD4+和 CD8+T 細(xì)胞相關(guān)性研究［J］.國際呼吸雜志，2013，33（22）：1681-1685.

［15］ Li J，Mo HY，Xiong G，et al.Tumor microenviroment macrophage inhibitory factor directs the accumulation of interleukin-17-producing tumor-infiltrating lymphocytes and predicts favorable survival in nasopharyngeal carcinoma patients［J］.J Biol Chem，2012，287（42）：35484-35495.

［2017-05-24收稿］［2017-06-16修回］［編輯 羅惠予］

Clinical significance of P16，CD4 and CD8 in nasopharyngeal carcinoma

Li Wenting1，Qin Yonghui2，Wang Ruozheng2
（1Department of Pathology，2Department of Radiotherapy of Head and Neck ，Affiliated Tumor Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi 830011，P.R.China）

Nasopharyngeal neoplasm；P16；CD4；CD8；Clinical pathology；Prognosis

Wang Ruozheng.E-mail：wrz8526@vip.163.com

R739.63

A

1674-5671（2017）04-06

10.3969/j.issn.1674-5671.2017.04.08

新疆維吾爾自治區(qū)科技計劃資助項目（201554142）；新疆維吾爾自治區(qū)重點實驗室開放課題資助項目（2015KL021）

王若崢。E-mail：wrz8526@vip.163.com

【Abstract】ObjectiveTo examine the clinical significance of P16，CD4 and CD8 in patients with nasopharyngeal carcinoma.MethodsClinical history and immunohistochemical expression of P16，CD4 and CD8 were investigated in 133 patients with nasopharyngeal carcinoma.ResultsNegative expression rates were 75.9%for P16，75.2%for CD4 and 76.7%for CD8；the corresponding positive expression rates were 24.1%，24.8%and 23.3%.Expression of P16 positively correlated with that of CD4 （P<0.05）.Expression of P16，CD4 or CD8 did not differ significantly with gender，age，nationality，smoking history，family history of cancer or clinical stage.Nevertheless，trends were observed for gender-dependent expression of P16（P=0.069）and clinical stage-dependent expression of CD8（P=0.085）.Patients negative or positive for expression of P16，CD4，or CD8 did not differ significantly in 5-year overall survival rate（P>0.05）.However，CD4 positivity was associated with significantly higher rates of 5-year disease-free survival（P=0.002）and 5-year local recurrence-free survival（P=0.024）than CD4 negativity.ConclusionP16，CD4 and CD8 expression is associated with the clinical characteristics of nasopharyngeal carcinoma.CD4-positive patients may have better prognosis.Joint detection of P16，CD4 and CD8 expression in nasopharyngeal carcinoma may help guide classification，treatment and prognosis prediction of patients.