金花葵和葵花葉提取物的亞硝酸鹽清除能力的初步研究

樸明淑+李美蘭+葛冰潔+李一婷+姜成哲

【摘 要】為了研究金花葵和葵花葉提取物對(duì)亞硝酸鹽的清除作用，本實(shí)驗(yàn)首先利用苯酚-硫酸法對(duì)金花葵提取物和葵花葉提取物的多糖含量進(jìn)行測(cè)定，在波長(zhǎng)為490nm處測(cè)定吸光度，實(shí)驗(yàn)表明，標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液在4-32μg/mL之間與NaNO2 的清除率呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。此方法簡(jiǎn)便，可操作性強(qiáng)，準(zhǔn)確性高。在弱酸性條件下，亞硝酸根能使對(duì)氨基苯磺酸重氮化，再與鹽酸CL-奈胺反應(yīng)生成紅色偶聯(lián)化合物。利用此原理，可通過測(cè)定反應(yīng)溶液的吸光度，比較兩種提取物及抗壞血酸對(duì)亞硝酸鹽的清除作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：金花葵提取物和葵花葉提取物對(duì)NaNO2 都有一定的清除作用，清除作用：抗壞血酸>金花葵提取物>葵花葉提取物。

【Abstract】In order to study the nitrite scavenging capacity of the extracts of abelmoschus manihot and sunflower leaves， this test firstly uses phenol-sulfuric acid method measure the content of polysaccharide in the extracts of abelmoschus manihot and sunflower leaves， and measure the absorbancy at a wavelength of 490 nm， the test shows that， the standard glucose solution showed a good linear relationship with the clearance rate of NaNO2 between the 4 uglml to 32 ug/mL. This method is simple， easy to operate and high accuracy. In the weak acid condition， the nitrite can make the amino benzene sulfonic acid re-nitriding， and then react with the hydrochloric acid alpha amine to form the red coupling compound. According to this principle， through measurement of absorbance in reaction solution， we can compare the scavenging effects of these two exacts and ascorbic acid on nitrite. The experimental results show that the extracts of abelmoschus manihot and sunflower leaves had scavenging effect on NaNO2， the scavenging effect of ascorbic acid is bigger than extracts of abelmoschus manihot and bigger than extracts of sunflower leaves.

【關(guān)鍵詞】金花葵；葵花葉；多糖含量；NaNO2清除率

【Keywords】abelmoschus manihot； sunflower leaves； polysaccharide content； NaNO2 clearance rate

【中圖分類號(hào)】TQ460.1 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A 【文章編號(hào)】1673-1069（2017）09-0191-02

1 引言

金花葵（Aurea helianthu），又名菜芙蓉，也稱野芙蓉。金花葵具有良好的清熱解毒、鎮(zhèn)痛消炎、降血脂、免疫調(diào)節(jié)、抑制腫瘤細(xì)胞、抗氧化、抗衰老等作用，具備很強(qiáng)的藥用價(jià)值。

2 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

本實(shí)驗(yàn)使用的葵花葉提取物是來自于向日葵的葵花葉提取物，向日葵是菊科向日葵屬的一年生草本植物，向日葵的葉分為真葉和子葉。莖下部分葉片在開花前制造養(yǎng)分，主要供給根部生長(zhǎng)，到開花時(shí)其功能基本結(jié)束。中上部葉片制造的養(yǎng)分主要供給花盤促使種子形成，葵花葉中含有多糖及多種微量元素，營(yíng)養(yǎng)豐富，利用價(jià)值很高。[1]

維生素C，英文名Vitamin C，又稱L-抗壞血酸，是多數(shù)生物的必需營(yíng)養(yǎng)素?？箟难嵩诙鄶?shù)生物體內(nèi)可以借助新陳代謝制造而來，人類例外。在生物體內(nèi)，抗壞血酸是一種抗氧化劑，其作用是保護(hù)機(jī)體免于自由基的傷害。維生素C有兩種異構(gòu)體，分別為L(zhǎng)-型和D-型，只有L-型的異構(gòu)體才具備一定的生理功能，還原型和氧化型都有生理活性[2]。維生素C的主要功能有：① 還原作用，維持巰基酶的活性、促進(jìn)鐵的吸收、促進(jìn)四氫葉酸形成、促進(jìn)抗體形成；②參與羥化反應(yīng)，促進(jìn)有機(jī)物或毒物羥化解毒、促進(jìn)類固醇羥化、促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)（5-羥色胺及去甲腎上腺素）合成；③其他功能：解毒、預(yù)防癌癥、清除自由基。[3]

3 實(shí)驗(yàn)過程

金花葵提取物和葵花葉提取物含有豐富的多糖成分，由目前研究證明，多糖對(duì)NaNO2具有一定的清除作用，亞硝酸鈉是一種食品添加劑，主要用于腌制肉食類食品，其可以保持食品鮮艷的色澤，抑制肉毒芽孢桿菌。但是，當(dāng)亞硝酸鹽進(jìn)入人體后，會(huì)與磷脂、氨基酸等有機(jī)物質(zhì)發(fā)生胺類反應(yīng)，該反應(yīng)可生成具有強(qiáng)烈致癌作用的亞硝胺。因此，亞硝酸鈉可以說是一種潛在的致癌物質(zhì)，那么對(duì)它的清除作用的研究也顯得尤為重要[4-5]。苯酚-硫酸法[6-7]是常用的測(cè)定多糖含量的方法，本實(shí)驗(yàn)也是利用此方法來測(cè)定兩種提取物中的多糖含量。此外，本實(shí)驗(yàn)也測(cè)定了金花葵提取物、葵花葉提取物中的多糖對(duì)NaNO2的清除作用，其測(cè)定原理是：多糖可將NaNO2氧化消耗，而未參與反應(yīng)的亞硝酸根在弱酸性環(huán)境下，可使對(duì)氨基苯磺酸重氮化，再與鹽酸α-奈胺偶合生成紅色偶聯(lián)化合物，通過測(cè)定該溶液吸光度，即可計(jì)算出多糖對(duì)NaNO2的清除率。endprint

①實(shí)驗(yàn)材料。金花葵花，來自延吉郊區(qū)；葵花葉，采自龍井郊區(qū)。

②實(shí)驗(yàn)儀器。紫外分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司），電子分析天平（上海精天電子儀器有限公司）。

③實(shí)驗(yàn)試劑。NaNO2；檸檬酸鈉緩沖液；0.4%對(duì)氨基苯磺酸；0.2%鹽酸α-奈胺。

④實(shí)驗(yàn)方法。

金花葵提取液：配制成濃度為1mg/ml溶液備用。

葵花葉提取液：配制成20mg/ml的溶液，搖勻，靜置。使用時(shí)，吸取上清液1ml，加入9ml蒸餾水稀釋為2mg/ml的溶液。

抗壞血酸溶液：配制成500μg/ml抗壞血酸溶液備用，用時(shí)稀釋成100μg/ml。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液配制成濃度為0.04mg/ml的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

0.1%NaNO2溶液（用時(shí)稀釋100倍）。

0.5mol/L檸檬酸鈉緩沖液（pH=3）： 配制成0.5mol/L檸檬酸鈉溶液；配制成0.5mol/L檸檬酸溶液；按1.4mL：18.6mL的比例混合，搖勻，得到0.5mol/L檸檬酸鈉緩沖液（PH=3）。

⑤標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。分別吸0.0ml，0.2ml，0.4ml，0.6ml，0.8ml， 1.0ml，1.2ml，1.4ml，1.6ml的0.04mg/ml的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，置于5ml的試管中，加水補(bǔ)足到2ml，加入0.2ml 6%苯酚，震蕩混勻后，快速滴加濃硫酸1ml，靜置5min后，置于沸水浴中加熱15～20min，取出，迅速冷卻至室溫，于波長(zhǎng)490nm處測(cè)吸光度。

⑥樣品中多糖含量的測(cè)定。按照上述標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程，分別對(duì)金花葵提取物及葵花葉提取物中的多糖含量進(jìn)行測(cè)定，通過測(cè)定樣品液的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中多糖含量。

⑦NaNO2清除率的測(cè)定。提取物及抗壞血酸對(duì)NaNO2的清除率的測(cè)定：取6支試管，按下表加入試劑。加入試劑后，搖勻，置于37°C恒溫水浴中加熱1h后取出。從6支試管中分別吸取0.75ml溶液，置于潔凈試管中，并加入1.5ml 0.4%對(duì)氨基苯磺酸、0.75ml 0.2%鹽酸α-奈胺，搖勻，暗處放置15min后，在波長(zhǎng)540nm處測(cè)定吸光度值。 NaNO2的清除率的計(jì)算公式： 清除率（%）=（A對(duì)照-A樣品）/A對(duì)照x100%

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1 樣品多糖含量的測(cè)定

按上述多糖含量測(cè)定方法，分別對(duì)金花葵提取物和葵花葉提取物同時(shí)測(cè)定三次吸光度，金花葵提取物吸光值分別為0.126，0.123，0.125，葵花葉提取物的吸光值分別為0.117，0.118，0.114。根據(jù)計(jì)算得，金花葵提取物中多糖的平均含量為14.2%，葵花葉提取物中多糖的平均含量為13.3%。

4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的建立

用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)為490nm處測(cè)定1.2.3中各反應(yīng)后溶液吸光度，試管1為對(duì)照組，得到線性回歸方程為：Y=1.575X+0.0115，R2=0.9881，說明葡萄糖在0.004mg/ml-0.032mg/ml范圍內(nèi)很好地符合朗白-比爾定律。

4.3 金花葵提取物溶液對(duì)NaNO2的清除作用

第一，根據(jù)吸光度計(jì)算樣品溶液對(duì)NaNO2的清除作用，在0.2～1.0mg/ml范圍內(nèi)，金花葵提取物對(duì)NaNO2有一定的清除作用，且清除率隨著濃度的增加而增大。樣品濃度與清除率存在良好的線性關(guān)系，計(jì)算出其50%抑制濃度IC50=0.71mg/ml。第二， 葵花葉提取物溶液對(duì)NaNO2的清除作用。根據(jù)吸光度計(jì)算樣品溶液對(duì)對(duì)NaNO2的清除作用，在0.4～2.0mg/ml范圍內(nèi)，葵花葉提取物對(duì)NaNO2有一定的清除作用，且清除率隨著濃度的增加而增大。樣品濃度與清除率存在良好的線性關(guān)系，計(jì)算出其50%抑制濃度IC50=1.5mg/ml。第三， 抗壞血酸對(duì)NaNO2的清除作用。根據(jù)吸光度計(jì)算樣品溶液對(duì)NaNO2的清除作用，在10～100μg/ml范圍內(nèi)，抗壞血酸對(duì)NaNO2有一定的清除作用，且清除率隨著濃度的增加而增大。樣品濃度與清除率存在良好的線性關(guān)系，計(jì)算出其50%抑制濃度IC50=0.053mg/ml。

5 結(jié)論

通過實(shí)驗(yàn)測(cè)出金花葵提取物中多糖含量占14.2%，葵花葉提取物中的占13.3%。此外，金花葵提取物、葵花葉提取物和抗壞血酸都對(duì)NaNO2具有一定的清除作用，三者IC50分別為0.71mg/ml、1.5mg/ml、0.053mg/ml，即對(duì)NaNO2的清除作用：抗壞血酸>金花葵提取物>葵花葉提取物。

【參考文獻(xiàn)】

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【7】聶國(guó)朝.中藥木瓜多糖的提取分離及含量測(cè)定[J].微量元素與健康研究，2003（5）：30-38.endprint