HPLC波長(zhǎng)切換聯(lián)合梯度洗脫法同時(shí)測(cè)定冰梅上清丸中兒茶素、表兒茶素、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E和桔梗皂苷D3

嚴(yán) 鶯

HPLC波長(zhǎng)切換聯(lián)合梯度洗脫法同時(shí)測(cè)定冰梅上清丸中兒茶素、表兒茶素、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E和桔梗皂苷D3

嚴(yán) 鶯

目的建立HPLC波長(zhǎng)切換聯(lián)合梯度洗脫法同時(shí)測(cè)定冰梅上清丸中的兒茶素、表兒茶素、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E和桔梗皂苷D3。方法采用Kromasil C18色譜柱；流動(dòng)相：乙腈-0.2%磷酸溶液，進(jìn)行梯度洗脫；流速：0.9 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)分別規(guī)定為280 nm (兒茶素、表兒茶素)和210 nm (去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3)。結(jié)果兒茶素、表兒茶素、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E和桔梗皂苷D3分別在18.16～363.20 μg/mL (r=0.999 9)、14.89～297.80 μg/mL (r=0.999 7)、5.35～107.00 μg/mL (r=0.999 6)、4.92～98.40 μg/mL (r=0.999 4)、4.15～83.00 μg/mL (r=0.999 9)范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，平均加樣回收率分別為98.74%、97.57%、99.37%、97.74%、98.13%，RSD分別為1.21%、0.96%、0.80%、1.10%、1.68%。結(jié)論本文建立的方法可作為冰梅上清丸的質(zhì)量控制方法。

HPLC；波長(zhǎng)切換法；梯度洗脫法；冰梅上清丸；兒茶素；表兒茶素；去芹糖桔梗皂苷E；桔梗皂苷E；桔梗皂苷D3

0 引言

冰梅上清丸是由兒茶、桔梗等十一味中藥材加工制成的水丸制劑，具有清熱退火的功效，臨床上主要用于上焦積熱、喉腫疼痛、鼻干口苦、口舌生瘡等疾病的治療。本品服用方便，療效確切。冰梅上清丸收載于衛(wèi)生部頒藥品標(biāo)準(zhǔn)(中藥成方制劑第7冊(cè))，現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)僅規(guī)定了性狀及丸劑的檢查項(xiàng)[1],未對(duì)該制劑處方中的任何藥物所含成分進(jìn)行定量測(cè)定，現(xiàn)文獻(xiàn)報(bào)道中也未檢索到對(duì)該制劑進(jìn)行定量測(cè)定的文獻(xiàn)報(bào)道，兒茶和桔梗為冰梅上清丸中的主要藥物，為確保冰梅上清丸質(zhì)量穩(wěn)定和療效一致性，本文以方中兒茶所含兒茶素、表兒茶素和桔梗[2]中所含去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3為指標(biāo)成分[2]，采用HPLC波長(zhǎng)切換聯(lián)合梯度洗脫法同時(shí)進(jìn)行測(cè)定，為冰梅上清丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高提供有效依據(jù)。

1 儀器與試藥

島津LC-20AT高效液相色譜儀(SPD-M20A檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱CTO-10ACvp)(島津公司)；BS423S 型分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)，KQ-250B超聲波發(fā)生器(昆山市超聲波儀器有限公司)。乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純；桔梗皂苷E對(duì)照品(237068-41-6)來源于成都德思特生物技術(shù)有限公司；兒茶素對(duì)照品(110877-201604)、表兒茶素對(duì)照品(110878-200102)來源于中國食品藥品檢定研究院；桔梗皂苷D3對(duì)照品(67884-03-1)來源于湖北巨勝科技有限公司；去芹糖桔梗皂苷E對(duì)照品(849758-42-5)來源于武漢天植生物技術(shù)有限公司；冰梅上清丸(每30粒重1 g；批號(hào)：151105、160307、160412)來源于成都九芝堂金鼎藥業(yè)有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 采用Kromasil C18色譜柱；流速：0.9 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相A：乙腈，流動(dòng)相B：0.2%磷酸溶液，梯度洗脫(0～8 min，10.0%A；8～14 min，10.0%A→16.0%A；14～23 min，16.0%A→32.0%A；23～30 min，32.0%A→10.0%A)[3-5]；0～14 min時(shí)在280 nm[6-7]波長(zhǎng)下檢測(cè)兒茶素和表兒茶素，14～30 min在210 nm[8]波長(zhǎng)下檢測(cè)去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E和桔梗皂苷D3。此系統(tǒng)條件下所測(cè)組分與其他組分分離效果良好，理論塔板數(shù)按兒茶素、表兒茶素、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E和桔梗皂苷D3計(jì)均不低于3 000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液的制備 取對(duì)照品兒茶素、表兒茶素、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E和桔梗皂苷D3各適量，精密稱定，加60%甲醇溶解并稀釋，分別制成質(zhì)量濃度分別為1.816、1.489、0.535、0.492、0.415 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。再分別依次吸取配制好的以上對(duì)照品儲(chǔ)備液各5.0、5.0、1.0、2.5、1.0 mL，置50 mL量瓶中，用60%甲醇稀釋至刻度，即得冰梅上清丸混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取冰梅上清丸適量，研成細(xì)粉，取約3.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加60%甲醇50 mL，稱定重量，KQ-250B超聲波發(fā)生器超聲處理30 min，放冷至室溫，用60%甲醇補(bǔ)足減失重量，充分振搖均勻，過濾，取續(xù)濾液，即得冰梅上清丸供試品溶液。

2.3 陰性對(duì)照專屬性實(shí)驗(yàn) 按照冰梅上清丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下載明的處方比例，制備缺兒茶和桔梗的水丸，再按照“2.3”項(xiàng)的方法制備陰性樣品溶液。取陰性樣品溶液、混合對(duì)照品溶液和供試品溶液各 10 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下依法進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果在與兒茶素、表兒茶素、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E和桔梗皂苷D3對(duì)照品色譜圖相應(yīng)的保留時(shí)間處，供試品溶液色譜圖中有兒茶素、表兒茶素、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E和桔梗皂苷D3吸收峰，而陰性樣品溶液色譜圖中未顯示對(duì)應(yīng)的吸收峰，說明陰性無干擾，色譜圖見圖1。

圖1 對(duì)照品(A)、樣品(B)、陰性(C)色譜圖

注：1.兒茶素，2.表兒茶素，3.去芹糖桔梗皂苷E，4.桔梗皂苷E，5.桔梗皂苷D3

2.4 線性關(guān)系考察 取6個(gè)10 mL量瓶，依次精密吸取上述制備的兒茶素、表兒茶素、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E和桔梗皂苷D3單一成分對(duì)照品儲(chǔ)備液各0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，分別用60%甲醇稀釋并定容，搖勻，制得6個(gè)系列濃度的混合對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣10 μL進(jìn)行測(cè)定，以峰面積Y作為縱坐標(biāo)，對(duì)照品質(zhì)量濃度X作為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程，見表1。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取批號(hào)為151105的冰梅上清丸，按“2.3”項(xiàng)的制備方法制備6份供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下的方法進(jìn)樣檢測(cè)，分別計(jì)算兒茶素、表兒茶素、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E和桔梗皂苷D3的含量，并計(jì)算各組分含量的RSD，結(jié)果各組分含量的RSD分別為1.16%、1.09%、0.76%、1.25%、1.57%。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批號(hào)的同一供試品溶液，在室溫下放置0、2、4、6、8、12 h后，分別進(jìn)樣兒茶素、表兒茶素、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E和桔梗皂苷D3。結(jié)果表明，冰梅上清丸供試品溶液在室溫下12 h內(nèi)穩(wěn)定，兒茶素、表兒茶素、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E和桔梗皂苷D3的峰面積的RSD分別為0.78%、0.85%、1.21%、1.04%和1.03%。

2.7 儀器精密度試驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下規(guī)定的色譜條件和測(cè)定方法重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄兒茶素、表兒茶素、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E和桔梗皂苷D3的峰面積，計(jì)算其RSD值，結(jié)果所測(cè)各組分峰面積的RSD分別為1.02%、0.83%、1.23%、0.74%、1.01%。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 分別稱取兒茶素、表兒茶素、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E和桔梗皂苷D3對(duì)照品各適量，用60%甲醇制成濃度為0.879、0.637、0.292、0.571、0.235 mg/mL的對(duì)照品溶液，備用。取冰梅上清丸(批號(hào)：151105)6份，每份約1.5 g，研成細(xì)粉，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入上述備用對(duì)照品溶液適量，按“2.3”項(xiàng)下方法制備加樣回收樣品溶液。按照“2.1” 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，計(jì)算5個(gè)組分的回收率及RSD，結(jié)果見表2。

表1 線性關(guān)系實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 兒茶素、表兒茶素、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E和桔梗皂苷D3回收率

2.9 樣品測(cè)定 取3個(gè)批號(hào)的冰梅上清丸，按文中規(guī)定的供試品制備方法，在本文規(guī)定的色譜條件下，進(jìn)樣測(cè)定，每次進(jìn)樣量為 10 μL，依法測(cè)定冰梅上清丸中兒茶素、表兒茶素、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E和桔梗皂苷D3含量，結(jié)果見表3。

表3 含量測(cè)定結(jié)果(n=3，mg/g)

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法的確定 為了能同時(shí)滿足兒茶素、表兒茶素、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E和桔梗皂苷D3對(duì)提取溶劑的要求，筆者分別選取超聲提取和水浴回流2種方式，以所測(cè)成分兒茶素、表兒茶素、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3的提取率為考察指標(biāo)，優(yōu)選最佳的提取方式，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在相同提取時(shí)間條件下，超聲提取和水浴回流提取所測(cè)各成分的提取率差異不大，因超聲提取較為簡(jiǎn)便穩(wěn)定，故選取超聲提取作為冰梅上清丸供試品溶液的提取方式；同時(shí)，筆者對(duì)提取溶劑進(jìn)行了對(duì)比考察(乙醇、30%甲醇、60%甲醇、甲醇)，結(jié)果以60%甲醇為提取溶劑時(shí)，所測(cè)各成分的綜合提取率最高。在此基礎(chǔ)上，筆者分別對(duì)不同提取時(shí)間(20、30、40 min)進(jìn)行考察，結(jié)果超聲提取30 min和超聲提取40 min所測(cè)各成分提取率差異不大，但明顯優(yōu)于超聲提取20 min。故冰梅上清丸供試品溶液最佳提取方法為60%甲醇超聲提取30 min。

3.2 兒茶素、表兒茶素、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E和桔梗皂苷D3含量限度的確定 根據(jù)兒茶素、表兒茶素、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E和桔梗皂苷D3含量的平均值的80%，建議暫定本品每1 g含兒茶以兒茶素計(jì)，不得少于2.8 mg，以表兒茶素計(jì)不得低于1.7 mg；含桔梗以去芹糖桔梗皂苷E計(jì)不得低于0.15 mg，以桔梗皂苷E計(jì)不得低于0.30 mg，以桔梗皂苷D3計(jì)不得低于0.12 mg。

4 結(jié)論

高效液相波長(zhǎng)切換聯(lián)合梯度洗脫法同時(shí)測(cè)定冰梅上清丸中兒茶素、表兒茶素、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E和桔梗皂苷D3的方法，操作簡(jiǎn)便，可以作為冰梅上清丸的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，為確保用藥安全提供有力保障。

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Simultaneousdeterminationofcatechin,epicatechin,deapioplatycodinE,platycodinEandplatycodinD3inBingmeiShangqingpillbyHPLCwavelengthswitchingcombinedwithgradientelutionmethod

YAN Ying

(Tongren Hospital Shanghai Jiao Tong University School of Medicine,Shanghai 200336,China)

ObjectiveTo develop a method of HPLC wavelength switching combined with gradient elution method for the simultaneous determination of the content of catechin,epicatechin,deapio platycodin E,platycodin E and platycodin D3in Bingmei Shangqing pill.MethodsA Kromasil C18column was used as the chromatographic column,the mobile phase was acetonitrile-0.2% phosphoric acid solution for gradient elution;the flow rate was 0.9 mL/min,and the column temperature was set at 30 ℃.Catechin and epicatechin were detected at 280 nm,while deapio platycodin E,platycodin E and platycodin D3were detected at 210 nm.ResultsCatechin,epicatechin,deapio platycodin E,platycodin E and platycodin D3had a good linear relationship with peak area respectively within 18.16～363.20 μg/mL (r=0.999 9),14.89～297.80 μg/mL (r=0.999 7),5.35～107.00 μg/mL (r=0.999 6),4.92～98.40 μg/mL (r=0.999 4) and 4.15～83.00 μg/mL (r=0.999 9).The average recoveries (RSD) were 98.74% (1.21%),97.57% (0.96%),99.37% (0.80%),97.74% (1.10%) and 98.13% (1.68%) respectively.ConclusionThe method has been successfully established for quality control of Bingmei Shangqing pill.

HPLC;Wavelength switching method;Gradient elution method;Bingmei Shangqing pill;Catechin;Epicatechin;Deapio platycodin E;Platycodin E;Platycodin D3

2016-12-25

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院，上海200336

10.14053/j.cnki.ppcr.201709024