耐高溫產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌在煙葉烘烤中降解淀粉的應用研究

王勇，王行，賀廣生，王軍，羅宇芬，陸麗，彭桂香，譚志遠

1 華南農(nóng)業(yè)大學，農(nóng)學院，廣州 510642；

2 廣東省煙草南雄科學研究所，南雄 512400；

3 中國煙草總公司廣東省公司，廣州 510610；

4 華南農(nóng)業(yè)大學，資源環(huán)境學院，廣州 510642

耐高溫產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌在煙葉烘烤中降解淀粉的應用研究

王勇1，王行2，賀廣生3，王軍2，羅宇芬1，陸麗1，彭桂香4，譚志遠1

1 華南農(nóng)業(yè)大學，農(nóng)學院，廣州 510642；

2 廣東省煙草南雄科學研究所，南雄 512400；

3 中國煙草總公司廣東省公司，廣州 510610；

4 華南農(nóng)業(yè)大學，資源環(huán)境學院，廣州 510642

為降低烤后煙葉的淀粉含量，本研究對分離自煙葉，具有高效降解煙葉淀粉功能的兩株細菌菌株進行了種類鑒定、發(fā)酵條件優(yōu)化及煙葉烘烤應用效果研究。結(jié)果表明，菌株YTK1為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），菌株B5221為枯草芽孢桿菌（B.subtilis）。兩株芽孢桿菌都可以耐受60℃高溫生長且長勢良好，均主要產(chǎn)α-淀粉酶，具有較強的淀粉水解能力。菌株YTK1和B5221經(jīng)發(fā)酵條件優(yōu)化后，產(chǎn)胞外淀粉酶能力比優(yōu)化前分別提高了338.52%和316.28%。將菌株YTK1和B5221制備的菌懸液均勻噴施于待烤煙葉進行密集式烘烤，烤后煙葉化學成分發(fā)生較大的變化，與對照相比，菌株YTK1處理后的中、上部煙葉淀粉分別下降了34.35%和32.66%，總糖分別增加了23.20%和16.51%，還原糖分別增加了16.69%和15.38%；菌株B5221處理后的中、上部煙葉淀粉分別下降了31.68%和30.46%，總糖分別增加了19.31%和14.25%，還原糖分別增加了12.36%和11.71%；總氮和蛋白質(zhì)含量與相應的對照(CK)比略有降低，氯和鉀含量變化不明顯。本研究篩選獲得的功能菌株將為降低煙葉淀粉含量、改善煙草品質(zhì)開辟新的途徑。

耐高溫；淀粉酶；解淀粉芽孢桿菌；枯草芽孢桿菌；煙葉淀粉

淀粉是植物體內(nèi)重要的碳水化合物，煙葉生產(chǎn)中要求鮮煙葉有一定量的碳水化合物的積累，烘烤過程中又要求淀粉盡量地降解，達到煙葉化學成分協(xié)調(diào)，提高煙葉原料品質(zhì)[1]。目前烤后煙葉淀粉含量偏高已成為制約我國煙葉品質(zhì)的主要因素之一[2]?？竞鬅熑~淀粉含量過高不僅會在卷煙燃吸時產(chǎn)生焦糊氣味，而且影響卷煙燃燒速度與燃燒完全性。烘烤過程中淀粉降解不充分，還會使煙葉的還原糖含量偏低，造成糖堿比失衡，卷煙燃吸產(chǎn)生的刺激性氣體含量增加，降低了卷煙的安全性[3]。目前國內(nèi)主要通過煙草育種、栽培、調(diào)制和醇化等方面來改善煙葉質(zhì)量。鄧云龍等[4]研究發(fā)現(xiàn)不同品種之間烤后煙葉淀粉含量差異顯著。鐘權(quán)[5]和賈宏昉等[6]分別通過不同栽培措施和施肥方式改變煙葉碳氮代謝途徑，從而降低烤后煙葉淀粉含量。崔國民等[7]和張麗等[8]通過不同溫濕度烘烤工藝進行調(diào)制煙葉，以期達到煙葉淀粉含量降低的效果。

通過微生物作用的生物技術手段達到降低煙葉淀粉含量的研究報道較少。大多數(shù)研究通過在煙葉表面添加外源淀粉酶[9-10]來降低淀粉含量，但這種外源淀粉酶高溫鈍化易失活，對煙葉淀粉只起到局部降解作用。少量研究從煙葉中篩選出產(chǎn)淀粉酶菌株[11-13]，在一定程度上能夠降低煙葉淀粉含量，但所報道的篩選菌株產(chǎn)淀粉酶活力低或僅在50℃以下存活，在烘烤過程中50℃以上對煙葉淀粉不起降解作用。某些微生物如芽孢桿菌在烘烤過程中能夠抑制霉菌的生長，減少青雜煙葉數(shù)量，增加可用煙葉比例；通過具備耐高溫高產(chǎn)淀粉酶特性菌株作用后能夠有效降解煙葉淀粉，從而為均衡煙葉內(nèi)部主要化學成分及縮減醇化時間提供可能性。因此，篩選出能夠耐50℃以上高溫且有效降解煙葉淀粉功能的微生物對煙草品質(zhì)改善具有重要的意義。

本實驗旨在分離和篩選耐50℃以上高溫和高產(chǎn)淀粉酶功能菌株，通過種類鑒定、產(chǎn)酶特性和煙葉烘烤中的應用研究，獲得了降解煙葉淀粉效果明顯的有益菌株，為改善煙葉品質(zhì)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料

功能菌株的分離材料源自2016年廣東省煙草南雄科學研究所試驗基地的粵煙97品種中部成熟期煙葉。試驗對象為粵煙97中部烤前煙葉（第11～13葉位）和上部烤前煙葉（第17～19葉位）。

1.1.2 培養(yǎng)基

淀粉培養(yǎng)基（1 L）：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，可溶性淀粉20 g，pH 7.0；固體添加瓊脂粉18 g。

基礎發(fā)酵培養(yǎng)基（1 L）：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g。培養(yǎng)條件pH 7.0，發(fā)酵溫度37℃，接種量（OD600=1）1.0%，搖床速度 150 r·min-1，發(fā)酵時間48 h。

菌株YTK1優(yōu)化培養(yǎng)基（1 L）：鮮煙葉10 g，麩皮10 g，蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05 g，MnSO4·H2O 0.05 g，CaCl20.2 g，KH2PO40.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，VB120.2 mg， 生物素0.4 mg。培養(yǎng)條件為pH 6.0，發(fā)酵溫度35℃，接種量（OD600=1）2.5%，搖床速度 150 r·min-1，發(fā)酵時間48 h。

菌株B5221優(yōu)化培養(yǎng)基（1 L）：同菌株YTK1優(yōu)化培養(yǎng)基配方。培養(yǎng)條件：pH 6.0，發(fā)酵溫度40℃，接種量（OD600=1）1.5%，搖床速度150 r·min-1，發(fā)酵時間48 h。

1.2 方法

1.2.1 功能菌株的分離篩選

從試驗基地中選取中部成熟煙葉（品種為粵煙97）樣品若干，剪碎后分別裝入含100 mL淀粉培養(yǎng)液的三角瓶中，擴大培養(yǎng)24 h。擴培后的菌液經(jīng)80℃消煮后，取500 μL菌液涂布接種于淀粉固體培養(yǎng)基上，放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后進行觀察。在長出的菌落上滴加盧戈氏碘液，挑取透明圈直徑較大的菌落，采用劃線法進行分離純化。分離純化后的菌株再次使用盧戈氏碘液確定其產(chǎn)淀粉酶活性，并測量菌株的淀粉透明圈直徑和菌落直徑，計算其比值。純化后的菌株采用15%無菌甘油管及平板保藏。

耐高溫菌的篩選在電熱恒溫培養(yǎng)箱中以不同溫度條件下進行篩選。挑取平板保存的菌體在淀粉固體培養(yǎng)基的平板上密集劃線后，密封放于不同溫度條件下培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，分別設置50℃、52℃、55℃、58℃、60℃、62℃和65℃共7個溫度梯度，確定其耐高溫特性。

1.2.2 菌種鑒定

形態(tài)特征觀察與鑒定參照《伯杰氏鑒定細菌學手冊》[14]。16S rRNA基因擴增與序列分析：DNA的提取方法參照文獻[15]；16S rRNA基因擴增引物及PCR反應條件按照文獻[16]。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。PCR 產(chǎn)物測序由北京睿博興科生物技術有限公司（廣州）完成。將所得序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行比對[17]，獲得相似性較高的公開發(fā)表的模式菌株，再用軟件GeneDoc進行格式轉(zhuǎn)換和人工比對，比對結(jié)果用軟件TREECON采用鄰比法(neighbor-joining method)[18]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 生理生化鑒定

菌株的生理生化鑒定包括H2O2酶、吲哚產(chǎn)生、M.R試驗、V.P試驗、明膠液化、蛋白酶、產(chǎn)氨試驗、硝酸鹽還原反應等，測定方法參照《微生物學實驗教程》[19]。菌株對NaCl耐受性測定，使用Bio-BIQB板進行測定[20]。

1.2.4 篩選菌株的淀粉酶活力測定

淀粉酶活力測定及底物特異性測定方法參照文獻[13]。

在基礎發(fā)酵培養(yǎng)基條件下，設置不同pH值、接種量、培養(yǎng)溫度、離子成分和最優(yōu)發(fā)酵方案處理，進行液體發(fā)酵。采用分光光度計測定菌體濃度OD600以及DNS法測定菌株產(chǎn)胞外淀粉酶活力（測定方法以下同，每處理重復3次）。

pH值處理分別為3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0和 10.0。

接種量處理分別為0，0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%，3.5%，4.0%和5.0%。

培養(yǎng)溫度處理分別為25℃，30℃，35℃，40℃，45℃，50℃，55℃和60℃。

不同離子成分（質(zhì)量濃度都為0.2 g·L-1）的添加處理分別為CK（不附加金屬離子）、FeSO4·7H2O(Fe2+)、MnSO4·H2O（Mn2+）、CaCl2（Ca2+）、KH2PO4（K+）、MgSO4·7H2O（Mg2+）、ZnSO4·7H2O（Zn2+）、NiSO4·6H2O（Ni2+）和 CuSO4（Cu2+）。

確定最優(yōu)發(fā)酵方案后在相應優(yōu)化培養(yǎng)基中進行液體發(fā)酵。測定優(yōu)化后篩選菌株菌體濃度和產(chǎn)胞外淀粉酶活力。

1.2.5 菌懸液噴施處理以及煙葉主要化學成分的測定

將菌株YTK1和B5221優(yōu)化培養(yǎng)基發(fā)酵后的菌液離心收集菌體，用無菌水配制成OD600=1的菌懸液，振蕩搖勻，對照組為等量的無菌水，然后分別均勻噴施于中部煙葉（第11～13葉位）和上部煙葉（第17～19葉位）的表面進行密集式烘烤（三段式烘烤工藝），烤后粉碎取樣進行煙葉化學成分測定。每處理重復3次。

總糖、還原糖、鉀、氯、總氮和淀粉采用連續(xù)流動分析法；煙堿測定采用分光光度法。參照以下標準進行測定：總糖、還原糖（YC/T 159-2002）、氯（YC/T 162-2011）、鉀（YC/T 217-2007）、總氮（YC/T 161-2002）、煙堿（GB/T 23225-2008）、淀粉（YC/T 216-2013）、蛋白質(zhì)（YC/T 249-2008）。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定

2.1.1 耐高溫解淀粉功能微生物的分離及形態(tài)觀察

從煙葉中分離獲得兩株耐高溫且能高效解淀粉的功能菌株，分別命名為YTK1和B5221。結(jié)果表明，菌株YTK1和B5221淀粉水解透明圈直徑與菌落直徑比值分別為3.44和2.93，兩株菌株都具有較強的淀粉降解功能，而且都可耐受60℃高溫生長。菌株YTK1和B5221的菌落均不透明，表面粗糙、褶皺、邊緣不規(guī)則；液體培養(yǎng)后均能形成菌膜；格蘭氏染色均顯陽性，桿狀，產(chǎn)生芽孢。經(jīng)形態(tài)觀察，初步判斷該兩株菌株為芽孢桿菌屬。

2.1.2 兩株芽孢桿菌的生理生化鑒定

菌株YTK1與 B5221的生理生化測定顯示，兩株芽孢桿菌都具有H2O2酶活性，產(chǎn)氨試驗和硝酸鹽還原反應都顯示為陽性；供試菌株都能利用蛋白質(zhì)中的色氨酸產(chǎn)生吲哚；M.R試驗（甲基紅反應）都顯示為陰性；V.P試驗都顯示為陽性；蛋白酶與明膠液化試驗皆為陽性。NaCl耐受性分別為1.5%和3.0%。

2.1.3 16S rRNA基因序列分析

將測序獲得菌株YTK1和B5221的16S rRNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中相似性相近的模式菌株序列采用鄰接法進行聚類分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(如圖1)。結(jié)果表明，菌株YTK1與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciensDSM 7T）親緣關系較近，相似性為99.50%；菌株B5221與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilisDSM 10T）親緣關系較近，相似性為99.06%。

圖1 兩株芽孢桿菌YTK1和B5221的16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenic tree based on 16S rRNA gene sequence analysis of twoBacillusstrains YTK1 and B5221

2.2 菌種的產(chǎn)淀粉酶特性

2.2.1 底物特異性

結(jié)果如圖2所示，菌株YTK1和B5221對不同底物的催化程度都表現(xiàn)為直鏈淀粉＞可溶性淀粉＞支鏈淀粉，說明兩株芽孢桿菌均主要產(chǎn)α-淀粉酶。菌株YTK1對直鏈淀粉、可溶性淀粉和支鏈淀粉的相對降解率比值為1：0.912：0.295。菌株B5221對直鏈淀粉、可溶性淀粉和支鏈淀粉的相對降解率比值為1：0.893：0.412。

圖2 菌株YTK1與B5221對不同底物酶活力的影響Fig.2 Effects on enzyme activities of different substrates by YTK1 and B5221

2.2.2 不同pH值對菌株YTK1和B5221產(chǎn)淀粉酶活性的影響

結(jié)果如圖3所示，YTK1和B5221在pH值為3～10條件下都能生長，偏酸偏堿條件下生長緩慢，pH 5～7之間快速生長，兩株芽孢桿菌的菌體濃度和產(chǎn)胞外淀粉酶活力皆在pH值為6時達到最高值，菌體濃度OD600值分別為2.05和1.74，產(chǎn)胞外淀粉酶活力分別為 11.16 U·mL-1和 12.45 U·mL-1。菌株 YTK1和B5221的最適pH值都為6。

圖3 兩株芽孢桿菌在不同pH值發(fā)酵條件下菌體濃度和產(chǎn)胞外淀粉酶活力Fig.3 Cell concentration and extracellular amylase activity of twoBacillusstrains under different pH values

2.2.3 不同接種量對菌株YTK1和B5221產(chǎn)淀粉酶活性的影響

結(jié)果如圖4所示，接種量對兩株芽孢桿菌的生長速度和淀粉酶活性都無明顯變化，菌株YTK1和B5221的菌體濃度和產(chǎn)胞外淀粉酶活力在接種量分別為2.5%和1.5%條件下達到最高，菌體濃度分別為1.81和1.62，產(chǎn)胞外淀粉酶活力分別為10.46 U·mL-1和13.32 U·mL-1。菌株YTK1和B5221的最適接種量分別為2.5%和1.5%。

圖4 兩株芽孢桿菌在不同接種量發(fā)酵條件下菌體濃度和產(chǎn)胞外淀粉酶活力Fig.4 Cell concentration and extracellular amylase activity of twoBacillusstrains under different inoculation amounts

2.2.4 不同溫度對菌株YTK1和B5221產(chǎn)淀粉酶活性的影響

結(jié)果如圖5所示，菌株YTK1和B5221在25℃～60℃條件下都能夠生長。菌株YTK1在35℃下菌體濃度OD600值和產(chǎn)胞外淀粉酶活力達到最高值，分別為1.99和14.06 U·mL-1；菌株B5221在40℃下菌體濃度OD600值和產(chǎn)胞外淀粉酶活力達到最高值，分別為2.06和16.40 U·mL-1。結(jié)果表明菌體YTK1與B5221分別在35℃和40℃較適合進行菌液發(fā)酵。

圖5 兩株芽孢桿菌在不同溫度發(fā)酵條件下菌體濃度和產(chǎn)胞外淀粉酶活力Fig.5 Cell concentration and extracellular amylase activity of twoBacillusstrains under different temperature

2.2.5 不同離子成分對菌株YTK1和B5221產(chǎn)淀粉酶活性的影響

結(jié)果如圖6所示，不同離子成分對菌株YTK1和B5221的菌體生長情況和產(chǎn)淀粉酶特性有著一致的規(guī)律，對照組(CK)為基礎培養(yǎng)基，從測定的菌體濃度看，F(xiàn)e2+、Mn2+、Ca2+、K+、Mg2+離子都能促進兩株芽孢桿菌的生長，Zn2+阻礙菌株的生長，Ni2+、Cu2+存在時不生長；從測定的產(chǎn)胞外淀粉酶活力來看，Ca2+、K+、Mg2+都能促進菌株YTK1和B5221產(chǎn)淀粉酶，F(xiàn)e2+、Mn2+、Zn2+皆抑制菌株YTK1和B5221淀粉酶活性，Ni2+、Cu2+存在時不產(chǎn)淀粉酶。綜合看來，Ca2+、K+、Mg2+對篩選菌株的菌體濃度和產(chǎn)胞外淀粉酶都具有促進作用。對于Fe2+、Mn2+離子存在時，可以促進菌株的生長卻阻礙菌株產(chǎn)淀粉酶，可能是由于高濃度條件下對菌株的產(chǎn)酶起到抑制作用。

2.2.6 培養(yǎng)基配方的優(yōu)化對菌株YTK1和B5221產(chǎn)淀粉酶活性的影響

通過兩株篩選菌株在不同pH值、接種量、溫度和離子成分條件下生長情況和產(chǎn)酶特性的研究中，確定了菌株生長及高效產(chǎn)胞外淀粉酶的發(fā)酵方案。結(jié)果表明（如圖7），菌株YTK1和B5221經(jīng)優(yōu)化培養(yǎng)基發(fā)酵后較基礎培養(yǎng)基發(fā)酵后菌體濃度和產(chǎn)淀粉酶活力有較明顯的增強效果，優(yōu)化前菌株YTK1和B5221的菌體濃度OD600值分別為1.47和1.57，優(yōu)化后分別為2.74和2.42，分別增加了86.70%和53.62%；優(yōu)化前菌株YTK1和B5221的產(chǎn)淀粉酶活力為10.26 U·mL-1和 9.60 U·mL-1，優(yōu)化后分別為 45.27 U·mL-1和39.98 U·mL-1，分別增加338.52%和316.28%。

圖6 兩株芽孢桿菌在不同離子成分發(fā)酵條件下菌體濃度和產(chǎn)胞外淀粉酶活力Fig.6 Cell concentration and extracellular amylase activity of twoBacillusstrains under different ion composition

圖7 兩株芽孢桿菌培養(yǎng)基改良前后發(fā)酵后菌體濃度和產(chǎn)胞外淀粉酶活力的比較Fig.7 Comparison of cell concentration and extracellular amylase activity between two Bacillus strains under different fermentation conditions

2.2.7 反應溫度對淀粉酶活性的影響

反應溫度在一定程度上影響著淀粉酶活性。結(jié)果表明（如圖8），兩株芽孢桿菌所產(chǎn)淀粉酶對可溶性淀粉水解的最適作用溫度都為60℃，在50℃～60℃都具有較高的淀粉酶活性。所以兩株芽孢桿菌淀粉酶最適反應溫度都為60℃。

圖8 菌株YTK1和B5221在不同溫度條件下的相對酶活力Fig.8 Relative activity of strain YTK1 and B5221 under different reaction temperature

2.3 菌懸液噴施對烤后煙葉內(nèi)在化學成分的影響

如表1所示，表中對照（CK）及處理煙葉均為粵煙97品種，對照組烘烤后測定數(shù)據(jù)與趙偉才等[21]測定的煙葉內(nèi)在化學成分一致。結(jié)果表明，中、上部煙葉經(jīng)YTK1和B5221菌懸液處理烘烤后總糖、還原糖和糖堿比均顯著高于對照，淀粉均顯著低于對照，達差異顯著水平。與對照相比，菌株YTK1處理后的中、上部煙葉淀粉分別下降了34.35%和32.66%，總糖分別增加了23.20%和16.51%，還原糖分別增加了16.69%和15.38%；菌株B5221處理后的中、上部煙葉淀粉分別下降了31.68%和30.46%，總糖分別增加了19.31%和14.25%，還原糖分別增加了12.36%和11.71%；煙堿、氯、鉀和氮堿比與對照比均差異不顯著；總氮和蛋白質(zhì)含量與相應的對照（CK）比略有降低，但中部葉蛋白質(zhì)與上部葉總氮均達差異顯著水平，而上部葉蛋白質(zhì)與中部葉總氮均差異不顯著，可能與煙葉本身性質(zhì)或烘烤條件等因素有關。

3 討論

在烘烤過程中利用外源淀粉酶制劑降低煙葉淀粉含量存在淀粉酶提取成本較高和體外條件下酶活性退化等問題，其生產(chǎn)應用受到了一定的限制[22-23]。胥海東等[11]和倪涵等[13]從煙葉中分離得到產(chǎn)淀粉酶菌株，但所分離的菌株不是耐50℃以上高溫的菌株，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化后作用于煙葉上，只在一定程度上降低淀粉含量。本研究從中部成熟煙葉分離獲得兩株耐60℃高溫和高產(chǎn)淀粉酶活性的菌株YTK1和B5221，均主要產(chǎn)α-淀粉酶，在優(yōu)化培養(yǎng)基發(fā)酵后產(chǎn)胞外淀粉酶活力分別達 45.27 U·mL-1和 39.98 U·mL-1，高于大多數(shù)相關報道[24-27]菌株的產(chǎn)淀粉酶活力，能夠大幅度降低煙葉淀粉含量，提高煙葉品質(zhì)。

表1 菌株YTK1和B5221菌懸液噴施處理對烘烤煙葉主要化學成分的影響Tab.1 Difference of the main chemical components of flue-cured tobacco leaves sprayed by bacterial suspensions of strain YTK1 and strain B5221

本研究所篩選的芽孢桿菌在烘烤前被均勻噴施于鮮煙葉上，在烘烤階段中附著于煙葉表面和體內(nèi)形成特殊的微環(huán)境，利用葉片排出或滲出的代謝產(chǎn)物作為自身營養(yǎng)物質(zhì)[28]，產(chǎn)生的胞外淀粉酶與目標底物接觸，將淀粉降解為小分子物質(zhì)[29]，從而降低淀粉含量及增加游離態(tài)糖類物質(zhì)含量。烘烤前期，由于溫度適宜，相對濕度較大以及煙葉水分充足，芽孢桿菌利用有利的環(huán)境條件進行大量繁殖；烘烤后期，溫度逐漸升高，相對濕度較小以及煙葉水分缺失，芽孢桿菌繁殖受到抑制，但所篩選的菌株具有60℃耐高溫生長特性，在較高溫度和干燥條件下依然可以存活，繼續(xù)利用煙葉體內(nèi)的淀粉降解為游離態(tài)糖類，直到烘烤結(jié)束大部分菌體死亡裂解并釋放自身代謝產(chǎn)物。經(jīng)過本實驗菌株處理后的烘烤煙葉淀粉含量大幅降低，總糖、還原糖含量增加，與王懷珠等[9]和趙昶靈等[10]通過外加淀粉酶處理煙葉達到降解淀粉的效果基本一致。但由于外加淀粉酶高溫鈍化易失活且酶解持久力差，煙葉淀粉只能局部降解，而所篩選耐高溫高產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌剛好能夠有效解決酶鈍化的問題。從烤后煙葉主要化學成分的數(shù)據(jù)來看，淀粉與總糖、還原糖不成線性相關[21,30]，而且總糖和還原糖含量有較大幅度的升高，可能主要因為與該2株芽孢桿菌的產(chǎn)酶特性，煙草淀粉性質(zhì)（直鏈淀粉與支鏈淀粉比例），淀粉降解產(chǎn)物（葡萄糖、果糖和麥芽糖等比例），蔗糖、纖維素含量（蔗糖轉(zhuǎn)化酶和纖維素酶的影響）等因素有關。

所篩選的兩株芽孢桿菌具備耐60℃高溫和高產(chǎn)淀粉酶功能特性，主要產(chǎn)α-淀粉酶，能夠有效地降解煙葉淀粉，改善煙葉品質(zhì)。本試驗從微生物作用的生物技術手段角度對烤后煙葉主要化學成分的影響作了相應研究，對于通過微生物的誘變改良[26,31-35]等手段來提高產(chǎn)淀粉酶活性，以達充分改善煙草品質(zhì)的目的，還需進一步深入研究。

4 結(jié)論

本研究分離、篩選獲得兩株耐60℃高溫生長且高產(chǎn)淀粉酶菌株YTK1和B5221，分別鑒定為解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）和枯草芽孢桿菌（B.subtilis）。研究確定了兩株芽孢桿菌的最優(yōu)發(fā)酵條件。菌株YTK1和B5221噴施于待烤煙葉，烤后煙葉淀粉含量明顯下降，總糖、還原糖含量升高，在烘烤過程中對改善煙葉內(nèi)在化學成分起著重要的作用。

[1]邱妙文, 凌壽軍, 王行, 等.不同烘烤濕度條件與煙葉淀粉含量變化關系[J].中國煙草科學, 2004, 25(3): 6-8.QIU Miaowen, LING Shoujun, WANG Hang, et al.Relationship between different curing humidity and the content variation of starch in tobacco leaves[J].Chinese Tobacco Science, 2004, 25(3):6-8.

[2]段麗斌, 崔國民, 趙昶靈, 等.烤煙烘烤中煙葉淀粉降解的研究進展[J].中國農(nóng)學通報, 2013, 29(18): 180-186.DUAN Libin, CUI Guomin, ZHAO Changling, et al.Researchadvances in the degradation of the leaf starch of the flue-cured tobacco during flue-curing[J].Chinese Agricultural Science Bulletin, 2013, 29(18): 180-186.

[3]董維杰, 張忠鋒, 竇玉青, 等.烤煙煙葉淀粉含量影響因素及其與煙葉質(zhì)量關系研究進展[J].廣東農(nóng)業(yè)科學, 2015(8): 11-16.DONG Weijie, ZHANG Zhongfeng, DOU Yuqing, et al.Research on in fl uencing factors of fl ue-cured tobacco starch content and its relationship with tobacco leaf quality[J].Guangdong agricultural sciences, 2015(8): 11-16.

[4]鄧云龍, 崔國民, 孔光輝, 等.品種、部位和成熟度對煙葉淀粉含量及評吸質(zhì)量的影響[J].中國煙草科學, 2006, 27(4): 18-23.DENG Yunlong, CUI Guomin, KONG Guanghui, et al.Effect of variety, leaf position and degree of maturity on starch content,fl avor and taste of tobacco leaf[J].Chinese Tobacco Science, 2006,27(4): 18-23.

[5]鐘權(quán).不同栽培措施對K326上部煙葉產(chǎn)質(zhì)量影響的研究[D].湖南農(nóng)業(yè)大學, 2010.ZHONG Quan.Effects of different cultivating measures on the growth, yield and qualities of K326 upper leaves[D].Hunan Agricultural University, 2010.

[6]賈宏昉, 陳紅麗, 黃化剛, 等.施用腐熟秸稈肥對烤煙成熟期碳代謝途徑影響的初報[J].中國煙草學報, 2014, 4(20): 48-52.JIA Hongfang, CHEN Hongli, HUANG Huagang, et al.Preliminary report on effect of applying rotten straw fertilizer on carbon metabolism in maturing flue-cured tobacco[J].Acta Tabacaria Sinica, 2014, 4(20): 48-52.

[7]崔國民, 汪伯軍, 許安定, 等.不同烘烤工藝對不同部位不同成熟度檔次煙葉淀粉含量的影響[J].農(nóng)業(yè)科學與技術, 2014,15(3): 488-492.CUI Guomin, WANG Bojun, XU Anding, et al.Effects of curing techniques on starch contents of leaves in different tobacco parts with varying maturity degrees[J].Agricultural Science &Technology, 2014, 15(3): 488-492.

[8]張麗, 劉本坤, 鄒登相, 等.不同烘烤工藝條件下煙葉淀粉含量變化規(guī)律的研究[J].湖南農(nóng)業(yè)科學, 2012(21): 89-92.ZHANG Li, LIU Benkun, ZOU Dengxiang, et al.Variation rule of starch content in tobacco leaves under different baking conditions[J].Hunan Agricultural Sciences, 2012(21): 89-92.

[9]王懷珠, 楊煥文, 郭紅英.烘烤過程中外加淀粉類酶對烤煙淀粉降解的影響[J].生物技術, 2004, 14(5): 67-69.WANG Huaizhu, YANG Huanwen, GUO Hongying.Effect of additional amylase on degradation of starch of fl ue-cured tobacco during fl ue-curing process[J].Biotechnology, 2004, 14(5): 67-69.

[10]趙昶靈, 崔國民, 孟凡來.外源淀粉酶和金屬離子對烘烤中烤煙‘KRK26’上部葉淀粉酶比活力和淀粉降解的效應[J].農(nóng)業(yè)科學與技術, 2014, 15(10): 1676-1683.ZHAO Changling, CUI Guomin, MENG Fanlai.Effects of exogenous amylases and metal ions on the amylase specific activities and starch degradation of the upper leaves of ‘KRK26’during flue-curing[J].Agricultural Science & Technology, 2014,15(10): 1676-1683.

[11]胥海東, 王永澤, 王金華.津巴布韋煙葉中淀粉酶和蛋白酶產(chǎn)生菌的分離及鑒定[J].生物技術通訊, 2011, 4(22): 536-539.XU Haidong, WANG Yongze, WANG Jinhua.Isolation and identification of protease and amylase producing bacteria strains from the Zimbabwe tobacco leaves[J].Letters in biotechnology,2011, 4(22): 536-539.

[12]李士林, 王宜君, 湯朝起, 等.耐高溫菌的分離及在固態(tài)發(fā)酵上部煙葉中的應用[J].生物加工過程, 2015, 13(1): 35-41.LI Shilin, WANG Yijun, TANG Zhaoqi, et al.Isolation and application of thermotolerant bacterials to solid-state fermentation of upper-leaves of tobacco[J].Chinese Journal of Bioprocess Engineering, 2015, 13(1): 35-41.

[13]倪涵, 馬永凱, 林連兵, 等.玉溪醇化煙葉表面細菌酶制劑對煙葉中淀粉和纖維素的降解作用[J].農(nóng)業(yè)生物技術學報, 2012,20(3): 268-274.NI Han, MA Yongkai, LIN Lianbing, et al.Degrading starch and cellulose in tobacco leaves by bacteria enzyme agents isolated from Yuxi tobacco leaf surface[J].Journal of Agricultural Biotechnology,2012, 20(3): 268-274.

[14]R.E.布坎南, N.E.吉本斯.伯杰細菌鑒定手冊[M].北京: 科學出版社, 1984.R.E.Buchanan, N.E.Gibbons.Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology[M].Beijing: Science Press, 1984.

[15]ZHANG Guoxia, REN Suizhou, XU Meiying, et al.Rhizobium borbori sp.nov., aniline-degrading bacteria isolated from activated sludge[J].Int J Syst Evol Microbiol, 2011, 61(Pt 4): 816-822.

[16]胡文哲, 譚澤文, 王勇, 等.藤縣藥用野生稻內(nèi)生固氮菌分離鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析[J].生物技術通報, 2016, 32(6): 111-119.HU Wenzhe, TAN Zewen, WANG Yong, et al.Isolation，Identi fi cation and phylogenetic analysis of endophytic diazotrophs in Tengxian medical-use Oryza of fi cinalis.Biotechnology bulletin,2016, 32(6): 111-119.

[17]Thompson J D, Gibson T J, Plewniak F, et al.The CLUSTAL-X windows interface: Flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[J].Nucleic Acids Res,1997, 24(25): 4876-4882.

[18]Pvandamme P, Pot B, Gillis M.Polyphasic taxonomy, a consensus approach to bacterial systematics[J].Microbiology Review, 1996,2( 60) : 407-438.

[19]趙斌, 何紹江.微生物學實驗.北京: 科學出版社, 2002．ZHAO Bin, HE Shaojiang.Microbiological Test[M].Science Press,Beijing, China.2002.

[20]陽潔, 江院, 王曉甜, 等.幾株高效溶磷解鉀藥用稻內(nèi)生固氮菌的篩選與鑒定[J].農(nóng)業(yè)生物技術學報, 2016, 24(2): 186-195.YANG Jie, JIANG Yuan, WANG Xiaotian, et al.Screening and identification of several endophytic diazotrophs with high capability of phosphate solubilizing and potassium decomposing fromOryzaofficinalis[J].Journal of Agricultural Biotechnology,2016, 24(2): 186-195.

[21]趙偉才, 邱妙文, 羅慧紅, 等.烤煙新品種粵煙97的選育及其特征特性[J].中國煙草科學, 2010, 31(2): 10-14.ZHAO Weicai, QIU Miaowen, LUO Huihong, et al.Breeding and selection of fl ue-cured tobacco new variety Yueyan 97 and its characteristics[J].Chinese Tobacco Science, 2010, 31(2): 10-14.

[22]余詩慶, 董曉燕.耐高溫α-淀粉酶發(fā)酵培養(yǎng)基和工藝的優(yōu)化[J].食品與發(fā)酵工業(yè), 2007, 7(33): 67-70.YU Shiqing, DONG Xiaoyan.Study on the optimization of medium and technology for fermentation of thermostable α-amylase[J].Food Fermentation Industries, 2007, 7(33): 67-70.

[23]張強, 蒲小平.耐高溫α-淀粉酶產(chǎn)生菌產(chǎn)酶條件的研究[J].食品工業(yè)科技, 2008, 8(29): 109-112.ZHANG Qiang, PU Xiaoping.Study on enzyme-producing conditions of thermostable α-amylase-producing strain[J].Science and Technology of Food Industry, 2008, 8(29): 109-112.

[24]Dash B K, Rahman M M, Sarker P K.Molecular Identification of a Newly IsolatedBacillus subtilisBI19 and Optimization of Production Conditions for Enhanced Production of Extracellular Amylase[J].Biomed Res Int, Volume 2015, Article ID 859805, 9 pages.doi: 10.1155/2015/859805.

[25]YING Qi, ZHANG Chong, GUO Fangfang, et al.Secreted expression of a hyperthermophilic alpha-amylase gene from Thermococcus sp.HJ21 inBacillus subtilis[J].J Mol Microbiol Biotechnol, 2012, 22(6): 392-398.

[26]謝鳳行, 趙玉潔, 周可, 等.產(chǎn)胞外淀粉酶枯草芽孢桿菌的分離篩選及其紫外誘變育種[J].華北農(nóng)學報, 2009, 24(3): 78-82.XIE Fengxing, ZHAO Yujie, ZHOU Ke, et al.The isolation,screening and ultraviolet mutation breeding ofBacillus subtilisstrains producing extracellular amylase[J].Acta Agriculturae Boreali-Sinica, 2009, 24(3): 78-82.

[27]孫佑赫, 周開艷, 熊智.一株產(chǎn)α-淀粉酶細菌的分離、鑒定及酶學性質(zhì)初步研究[J].華北農(nóng)學報, 2012 , 27(增刊) : 250-253.SUN Youhe, ZHOU Kaiyan, XIONG Zhi.Screening, identi fi cation and characterization of an α-amylase-producingBacillus subtilis2N02[J].Acta Agriculturae Boreali-Sinica, 2012, 27(Suppl) : 250-253.

[28]宮長榮, 程龍, 宋朝鵬, 等.烤煙烘烤過程中微生物的動態(tài)變化[J].中國煙草科學, 2010, 31(1): 44-46, 52.GONG Changrong, CHENG Long, SONG Zhaopeng, et al.Microorganism dynamic change of flue-cured tobacco leaves during curing process[J].Chinese Tobacco Science, 2010, 31(1):44-46, 52.

[29]王懷珠, 楊煥文, 郭紅英, 等.淀粉類酶降解鮮煙葉中淀粉的研究[J].中國煙草科學, 2005(2): 37-39.WANG Huaizhu, YANG Huanwen, GUO Hongying, et al.Effects of additional amylase on degradation of starch in fresh tobacco leaves during flue-curing[J].Chinese Tobacco Science, 2005(2):37-39.

[30]邱妙文, 王軍, 畢慶文, 等.有機肥對紫色土田烤煙產(chǎn)量與品質(zhì)的影響[J].煙草科技, 2009(2): 53-56.QIU Miaowen, WANG Jun, BI Qingwen, et al.Effects of organic fertilizers on yield and quality of flue-cured tobacco in field of purple soil[J].Tobacco Science ＆ Technology, 2009(2): 53-56.

[31]陳曉明, 張良, 張建國, 等.枯草芽孢桿菌淀粉酶高產(chǎn)菌株的輻射誘變研究[J].輻射研究與輻射工藝學報, 2008, 3(26): 177-182.CHEN Xiaoming, ZHANG Liang, ZHANG Jianguo, et al.The studies on radiation mutation breeding ofBacillus subtiliswith high-yield of amylase[J].Journal of radiation research and radiation processing, 2008, 3(26): 177-182.

[32]張家磊.產(chǎn)耐高溫淀粉酶菌株的篩選及離子束誘變研究[D].安徽農(nóng)業(yè)大學, 2008.ZHANG Jialei.Screening of thermostable amylase-producing strain and ion beam mutation breeding[D].Anhui Agricultural University,2008.

[33]Li X Y, Zhang J L, Zhu S W.Improved thermostable alphaamylase activity ofBacillus amyloliquefaciensby low-energy ion implantation[J].Genet Mol Res, 2011, 10(3): 2181-2189.

[34]Tuzlakoglu O M, Akbulut N, Issever O S, et al.Ligase-independent cloning of amylase gene from a localBacillus subtilisisolate and biochemical characterization of the puri fi ed enzyme[J].Appl Biochem Biotechnol, 2013, 171(2): 263-278.

[35]Emtenani S, Asoodeh A, Emtenani S.Gene cloning and characterization of a thermostable organic-tolerant alpha-amylase fromBacillus subtilisDR8806[J].Int J Biol Macromol, 2015, 72:290-298.

Effects of amylase producing thermophilicBacillusstrains on starch degradation in tobacco during fl ue-curing

WANG Yong1, WANG Hang2, HE Guangsheng3, WANG Jun2, LUO Yufen1, LU Li1, PENG Guixiang4, TAN Zhiyuan1*
1 College of Agriculture, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China;
2 Guangdong Nanxiong Tobacco Research Institute, Nanxiong 512400, China;
3 Guangdong Provincial Tobacco Corporation, Guangzhou 510610, China;
4 College of Resources Environment, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China

In order to reduce content of starch in fl ue-cured tobacco, functional microorganisms with ef fi cient starch degradation were screened from tobacco leaves.Species identi fi cation, optimization of fermentation conditions and application possibility in tobacco fl uecuring of the isolates were performed.Results showed that two strains YTK1 and B5221 belonged toB.amyloliquefaciens and B.subtilisrespectively.They could withstand 60℃ with strong ability of starch hydrolysis.Two Bacillus strains mainly produced alpha-amylase.After optimized fermentation, cell growth and activity of amylase were signi fi cantly changed.The extracellular amylase activity of strains YTK1 and B5221 increased by 338.52% and 316.28%, respectively.The bacterial suspension of YTK1 and B5221 was evenly sprayed on cured tobacco leaves.The chemical composition of tobacco leaves after curing was greatly changed.Compared with control, the content of starch in middle and upper tobacco leaves by spraying strain YTK1 was decreased by 34.35% and 32.66%, the content of total sugar increased by 23.20% and 16.51%, the content of reducing sugar in tobacco leaves increased by 16.69% and 15.38% respectively.In sprayed treatments by strain B5221, the content of starch in middle and upper tobacco leaves was decreased by 31.68% and 30.46%, the content of total sugar increased by 19.31% and 14.25%, the content of reducing sugar increased by 12.36% and 11.71%, respectively.The contents of total nitrogen and protein were decreased slightly compared with the control (CK).The contents of chlorine and kalium showed no obvious change.The functional strains with ef fi cient degradation of starch obtained in this study will provide strong scienti fi c basis for tobacco quality improvement.

high temperature tolerance; amylase;B.amyloliquefaciens;B.subtilis; tobacco starch

王勇，王行，賀廣生，等.耐高溫產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌在煙葉烘烤中降解淀粉的應用研究[J].中國煙草學報，2017, 23（4）

國家自然科學基金（31370052）、廣東省科技計劃項目（2014A050503058，2014A050503059）；廣東省煙草專賣局（公司）科技項目（粵煙科[2012]26號，201402）

王 勇（1992—），碩士研究生，主要研究方向：微生物發(fā)酵、煙草化學檢測、煙葉烘烤工藝，Email：1195082671@qq.com

譚志遠（1968—），Tel：020-38604857，Email：zytan@scau.edu.cn

2016-12-16；< class="emphasis_bold">網(wǎng)絡出版日期：

日期：2017-06-02

：WANG Yong, WANG Hang, HE Guangsheng, et al.Effects of amylase producing thermophilicBacillusstrains on starch degradation in tobacco during fl ue-curing [J].Acta Tabacaria Sinica, 2017, 23(4)

*Corresponding author.Email：zytan@scau.edu.cn