3種精油對(duì)水果病原菌的抑菌效果研究

余 興， 孔慶軍， 任雪艷

（1.石河子大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，新疆 石河子832000；2.陜西師范大學(xué) 食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安710119）

3種精油對(duì)水果病原菌的抑菌效果研究

余 興1， 孔慶軍*2， 任雪艷2

（1.石河子大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，新疆 石河子832000；2.陜西師范大學(xué) 食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安710119）

通過采用濾紙片熏蒸和直接接觸作用的方法研究了薰衣草精油，薄荷精油和葡萄籽精油對(duì)鏈格孢霉，擴(kuò)展青霉和酸腐菌的作用效果。結(jié)果顯示，抑菌效果與精油濃度和處理方式有關(guān)。在精油熏蒸實(shí)驗(yàn)中，體積分?jǐn)?shù)為1、2、3、4、5 μL/L的3種植物精油對(duì)鏈格孢霉，擴(kuò)展青霉和酸腐菌的抑菌效果均不同，對(duì)薰衣草精油的敏感強(qiáng)弱程度為：鏈格孢霉＞擴(kuò)展青霉＞酸腐菌；對(duì)薄荷精油的敏感程度為鏈格孢霉＞酸腐菌＞擴(kuò)展青霉；對(duì)葡萄籽精油的敏感強(qiáng)弱程度為擴(kuò)展青霉＞鏈格孢霉＞酸腐菌。而在直接接觸作用實(shí)驗(yàn)中，體積分?jǐn)?shù)為100、200、300、400、500 μL/L的3種植物精油對(duì)鏈格孢霉，擴(kuò)展青霉和酸腐菌的抑菌效果也不同，對(duì)薰衣草精油的敏感強(qiáng)弱程度為：酸腐菌＞鏈格孢霉＞擴(kuò)展青霉；對(duì)薄荷精油的敏感強(qiáng)弱程度為酸腐菌＞鏈格孢霉＞擴(kuò)展青霉；對(duì)葡萄籽精油的敏感強(qiáng)弱程度為擴(kuò)展青霉＞酸腐菌＞鏈格孢霉。

熏蒸；植物精油；抑菌效果

中國(guó)是一個(gè)水果生產(chǎn)大國(guó)，水果年總產(chǎn)量多達(dá)8500萬余噸，占世界水果總產(chǎn)量40%，但水果出口量卻不足總產(chǎn)量1%，并且貯藏保鮮量也不足總產(chǎn)量的20%[1]。因此保證水果采摘后的品質(zhì)、延長(zhǎng)其保存期限、防止其腐敗變質(zhì)、減小損失是亟待解決的問題?；瘜W(xué)保鮮劑一直以來就是人們防治食品腐敗的重要手段之一，但由于有些化學(xué)保鮮劑在使用時(shí)必須控制劑量，否則會(huì)對(duì)人體造成危害[2-4]。植物精油 （Essential oil）是從植物組織中提取的一類天然化合物[5]。研究發(fā)現(xiàn)，許多植物精油具有良好的抑菌活性，有作為天然防腐劑的潛在價(jià)值[6-9]。一定濃度的某些的植物精油可抑制甚至殺死細(xì)菌，精油的化學(xué)組成，濃度會(huì)影響它的抑菌效果，且酚類物質(zhì)的抑菌活性強(qiáng)于單萜醇類物質(zhì)，此外，醚類和醛類化合物也有一定的抑菌活性，精油對(duì)水果病原菌的抑制作用主要由這些物質(zhì)發(fā)揮，且精油中的這些物質(zhì)對(duì)人體毒性小，對(duì)環(huán)境的影響也小，因此，它可作為安全有效、無公害的抑菌劑[10-12]，作者選擇對(duì)薰衣草精油，薄荷精油和葡萄籽精油進(jìn)行研究。而鏈格孢霉，擴(kuò)展青霉和酸腐菌是常見的水果病原微生物，研究對(duì)鏈格孢霉，擴(kuò)展青霉和酸腐菌的抑菌作用可為水果的貯藏和保鮮方式提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

薰衣草精油，薄荷精油，葡萄籽精油：購(gòu)自伊帕爾汗香料有限公司；鏈格孢霉，擴(kuò)展青霉，酸腐菌：作者所在實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種的活化及菌懸液的制備 挑取適量的供試病原真菌孢子，在PDA斜面上劃線，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)進(jìn)行菌種活化，在28℃下培養(yǎng)7 d后，倒入5 mL的無菌水，用接種環(huán)刮下孢子，形成孢子濃度大約在5×104個(gè)/mL的懸浮液。

1.2.2 3種植物精油對(duì)病原菌的體外濾紙熏蒸實(shí)驗(yàn)用打孔器將定性濾紙打成直徑6 mm的濾紙片，置于培養(yǎng)皿中于121℃高壓蒸汽滅菌15 min。用移液槍吸取100 μL的孢子懸浮液加到的PDA平板上，用滅菌的涂布棒涂勻。在28℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。用無菌的打孔器在培養(yǎng)7 d的病原菌平板打取直徑為6 mm菌塊置于無菌PDA平板中。將平板倒置，取一片無菌的直徑為6 mm的濾紙片放在平板蓋子中央。用移液槍分別移取1、2、3、4、5 μL的植物精油滴于濾紙片上，以濾紙片上不添加植物精油的平板為對(duì)照。將平板用保鮮膜密封，放入28℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后觀察抑菌效果。測(cè)量菌落直徑，通過以下公式計(jì)算出抑制率。每個(gè)濃度梯度3個(gè)平板，試驗(yàn)重復(fù)3次。

C為對(duì)照菌落直徑（cm），T為菌落直徑（cm）。

1.2.3 3種植物精油對(duì)病原菌的體外直接接觸實(shí)驗(yàn)將融化的PDA培養(yǎng)基冷卻到40℃左右，用移液槍吸取一定體積的植物精油到培養(yǎng)基中，并且充分振蕩混合，使其最終體積分?jǐn)?shù)為100、200、300、400和500 μL/L。然后倒平板，每個(gè)平板15 mL。以培養(yǎng)基中不添加植物精油的平板為對(duì)照。用無菌的打孔器在病原菌（培養(yǎng)7 d）平板上打取直徑為6 mm菌塊放入平板中央。放入28℃生化培養(yǎng)箱中養(yǎng)7 d后觀察抑菌效果。測(cè)量菌落直徑，計(jì)算出抑制率。每個(gè)濃度梯度3個(gè)板，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 對(duì)抑菌作用最明顯的精油進(jìn)行鏈格孢霉孢子萌發(fā)實(shí)驗(yàn) 通過以上實(shí)驗(yàn)，選出抑菌效果較好的精油。在PDB培養(yǎng)基中配置一定濃度的鏈格孢霉孢子懸浮液，再將適量的乳化好的精油加入到小試管中，使精油的最終體積分?jǐn)?shù)為100，300，500 μL/L，并設(shè)置空白對(duì)照。進(jìn)行液體培養(yǎng)，12 h后用普通光學(xué)顯微鏡輔助以Digit Camera顯微攝像鏡頭和血球計(jì)數(shù)板測(cè)量，統(tǒng)計(jì)各處理中病原菌孢子萌發(fā)率，從而研究精油對(duì)病原孢子萌發(fā)影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 3種植物精油對(duì)病原菌的體外熏蒸抑制效果比較

2.1.1 薰衣草精油對(duì)3種病原菌的濾紙片熏蒸效果 表1、2分別1～5 μL/L 5個(gè)體積分?jǐn)?shù)梯度的薰衣草精油熏蒸作用下，3種病原菌的菌胎直徑（cm）及抑菌率（%）。

由表2可以看出，不同體積分?jǐn)?shù)的薰衣草精油對(duì)3種病原菌均有一定的抑制效果，對(duì)鏈格孢霉而言，薰衣草精油體積分?jǐn)?shù)在4 μL/L時(shí)抑菌率達(dá)到32.00%，5 μL/L時(shí)，其抑菌率達(dá)69.64%；對(duì)擴(kuò)展青霉而言，5 μL/L時(shí)的抑菌率為10.57%，抑制作用不明顯；而對(duì)酸腐而言，在5 μL/L濃度下的抑菌率僅為2.00%，基本不受抑制。

2.1.2 薄荷精油對(duì)3種病原菌的濾紙熏蒸效果表3、4為分別1～5 μL/L 5個(gè)體積分?jǐn)?shù)梯度的薄荷精油熏蒸作用下，3種病原菌的菌胎直徑（cm）及抑菌率（%）。

表1 不同體積分?jǐn)?shù)的薰衣草精油對(duì)3種測(cè)試菌的濾紙熏蒸作用下的菌胎直徑Table 1 Bacterial lawn diameter affected by disc diffusion with different concentrations of lavender essential oil cm

表2 薰衣草精油濾紙熏蒸作用下的抑菌率Table 2 Antimicrobial activity of disc diffusion with lavender essential oil %

表3 不同體積分?jǐn)?shù)的薄荷精油對(duì)三種測(cè)試菌的濾紙熏蒸作用下的菌胎直徑Table 3 Bacterial lawn diameter affected by disc diffusion with different concentrations of peppermint oil cm

表4 薄荷精油濾紙熏蒸作用抑菌率Table 4 Antimicrobial activity of disc diffusion with peppermint oil %

由表4可以看出，對(duì)鏈格孢霉而言，當(dāng)薄荷精油體積分?jǐn)?shù)為2 μL/L時(shí)，抑菌率就達(dá)到了54.55%，5 μL/L時(shí)的抑菌率高達(dá)90.36%，接近完全抑制；對(duì)酸腐菌而言，5 μL/L時(shí)的抑菌率達(dá)到了58.55%，抑制作用明顯。相對(duì)而言，對(duì)擴(kuò)展青霉的抑菌效果較低，但表現(xiàn)也很明顯，5 μL/L時(shí)的抑菌率為49.43%，抑菌作用明顯。

2.1.3 葡萄籽精油對(duì)3種病原菌的熏蒸效果 表5、6分別為1～5 μL/L 5個(gè)體積分?jǐn)?shù)梯度的葡萄籽精油濾紙熏蒸作用下，3種病原菌的菌胎直徑及抑菌率。

由表6不難發(fā)現(xiàn)，對(duì)擴(kuò)展青霉而言，葡萄籽精油體積分?jǐn)?shù)為4 μL/L時(shí)的抑菌率為61.71%，當(dāng)5μL/L時(shí)高達(dá)80.86%，抑菌效果很明顯；而對(duì)鏈格孢

霉而言，為5 μL/L時(shí)的抑菌率僅為10.55%，抑制不明顯；對(duì)酸腐菌而言，抑菌率最高僅為2.91%，基本不受抑制。

2.2 3種植物精油對(duì)病原菌的體外直接接觸實(shí)驗(yàn)

2.2.1 薰衣草精油對(duì)3種測(cè)試菌的直接接觸作用效果 表7、8分別為100～500 μL/L 5個(gè)體積分?jǐn)?shù)梯度的薰衣草精油直接接觸作用下3種病原菌的菌胎直徑及抑菌率。

表5 不同體積分?jǐn)?shù)的葡萄籽精油對(duì)3種測(cè)試菌的濾紙熏蒸作用下的菌胎直徑Table 5 Bacterial lawn diameter affected by disc diffusion with different concentrations of grape seed oil cm

表6 葡萄籽精油濾紙熏蒸作用抑菌率Table 6 Antimicrobial activity of disc diffusion with grape seed oil %

表7 不同體積分?jǐn)?shù)的薰衣草精油對(duì)3種測(cè)試菌的直接接觸作用下的菌胎直徑Table 7 Bacterial lawn diameter affected by direct contacting of different concentrations of lavender essential oil and fruit pathogenic bacteria cm

表8 薰衣草精油直接接觸作用抑菌率Table 8 Antimicrobial activity of direct contacting of lavender essential oil and fruit pathogenic bacteria %

由表8可以發(fā)現(xiàn)，直接接觸作用比熏蒸作用的抑菌效果明顯。對(duì)鏈格孢霉而言，體積分?jǐn)?shù)為100 μL/L時(shí)，其生長(zhǎng)明顯受到抑制，此時(shí)的抑菌率已經(jīng)達(dá)到了30.00%；400 μL/L時(shí)基本接近完全抑制，此時(shí)抑菌率達(dá)到89.82%。酸腐菌也是如此，100 μL/L時(shí)，抑菌率為33.09%；而400 μL/L時(shí)同樣接近完全抑制，抑菌率高達(dá)90.91%。對(duì)于擴(kuò)展青霉，抑制作用于200 μL/L開始明顯出現(xiàn)，當(dāng)500 μL/L時(shí)，抑菌率達(dá)到了32.86%，抑菌效果一般。

2.2.2 薄荷精油對(duì)3種病原菌的直接接觸效果表9、10分別為100～500 μL/L 5個(gè)體積分?jǐn)?shù)梯度的薄荷精油直接接觸作用下，3種病原菌的菌胎直徑及抑菌率。

由表10可以看出，鏈格孢霉于體積分?jǐn)?shù)為500μL/L時(shí)接近完全抑制，抑菌率達(dá)到87.09%。酸腐菌于400 μL/L時(shí)接近完全抑制，抑菌率達(dá)到90.91%。之前效果一般的擴(kuò)展青霉于體積分?jǐn)?shù)為100 μL/L時(shí)就受到抑制，直到400 μL/L時(shí)接近完全抑制，此時(shí)抑菌率為84.00%。

2.2.3 葡萄籽精油對(duì)3種病原菌的直接接觸效果表11和12分別為100～500 μL/L 5個(gè)體積分?jǐn)?shù)梯度的葡萄籽精油直接接觸作用下，3種病原菌的菌胎直徑及抑菌率。

表9 不同體積分?jǐn)?shù)的薄荷精油對(duì)3種測(cè)試菌的直接接觸作用下的菌胎直徑Table 9 Bacterial lawn diameter affected by direct contacting of different concentrations of peppermint oil and fruit pathogenic bacteria cm

表10 薄荷精油直接接觸作用抑菌率Table 10 Antimicrobial activity of direct contacting of peppermint oil and fruit pathogenic bacteria %

表11 不同體積分?jǐn)?shù)的葡萄籽精油對(duì)3種測(cè)試菌的直接接觸作用下的菌胎直徑Table 11 Bacterial lawn diameter affected by direct contacting of different concentrations of grape seed oil and fruit pathogenic bacteria cm

表12 葡萄籽精油直接接觸作用抑菌率Table 12 Antimicrobial activity of direct contacting of grape seed oil and fruit pathogenic bacteria %

通過表12發(fā)現(xiàn)，葡萄籽精油對(duì)鏈格孢霉和酸腐菌的抑菌率都比較低，基本沒有抑菌作用。而對(duì)于擴(kuò)展青霉，在體積分?jǐn)?shù)為100 μL/L時(shí)就已明顯受到抑制，當(dāng)體積分?jǐn)?shù)達(dá)到500 μL/L時(shí)，抑菌率達(dá)到62.86%。

2.3 孢子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

下表為在3種體積分?jǐn)?shù)梯度的薄荷精油作用下鏈格孢霉孢子的出芽率情況。

表13 3種體積分?jǐn)?shù)梯度的薄荷精油作用下鏈格孢霉孢子的出芽率Table 13 Germination rate affected by direct contacting of peppermint oil and alternaria alternata

由表13可以看出，隨著薄荷精油體積分?jǐn)?shù)的升高，孢子萌發(fā)率隨之降低，芽管長(zhǎng)度也隨之變短。對(duì)照組的鏈格孢霉孢子在培養(yǎng)12 h后，絕大多數(shù)的孢子均已萌發(fā)，芽管長(zhǎng)度較長(zhǎng)，并且相互纏繞。在含有300 μL/L的薄荷精油的培養(yǎng)基中，鏈格孢霉孢子萌發(fā)率為33.80%，在含有500 μL/L的薄荷精油的培養(yǎng)基中，鏈格孢霉孢子的萌發(fā)率僅為8.60%。

3 結(jié)語

經(jīng)過采用1～5 μL/L的薰衣草精油，薄荷精油和葡萄籽精油對(duì)鏈格孢霉，擴(kuò)展青霉，酸腐菌進(jìn)行濾紙熏蒸實(shí)驗(yàn)和100～500 μL/L 3種精油對(duì)以上3種病原菌的直接接觸實(shí)驗(yàn)研究，5 μL/L的薄荷精油濾紙熏蒸和500 μL/L薰衣草精油直接接觸對(duì)鏈格孢霉的抑菌率可分別高達(dá)90.36%和90.18%，這兩種處理方式是對(duì)鏈格孢霉的作用效果極強(qiáng)；而500 μL/L的薄荷精油對(duì)擴(kuò)展青霉的直接接觸抑菌率也達(dá)85.71%，抑菌效果也很不錯(cuò)；500 μL/L薰衣草精油和薄荷精油對(duì)酸腐菌的直接接觸抑菌率都高達(dá)90.91%，相同體積分?jǐn)?shù)的這兩種精油的對(duì)酸腐菌的抑制作用也很強(qiáng)。此外，在孢子萌發(fā)試驗(yàn)中，500 μL/ L的薄荷精油幾乎完全抑制了鏈格孢霉的萌發(fā)，且顯微照片顯示，萌發(fā)的孢子芽管生長(zhǎng)畸形，容易折斷。實(shí)驗(yàn)也證明了高濃度的薄荷精油一方面會(huì)抑制鏈格孢霉孢子萌發(fā)，另一方面，它還會(huì)使鏈格孢霉孢子畸形生長(zhǎng)，且生長(zhǎng)過程中容易折斷，由此，作者推測(cè)，植物精油在抑制病原菌生長(zhǎng)的過程中，一方面抑制新生孢子的萌發(fā)，另一方面使已經(jīng)萌發(fā)的孢子生長(zhǎng)畸形，并導(dǎo)致孢子在生長(zhǎng)過程中因芽管折斷而死亡?？偠灾?，植物精油確實(shí)有抑菌性和抗菌廣譜性。

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Study of Three Kinds of Essential Oil on Antimicrobial Activity of Fruit Pathogenic Bacteria

YU Xing1， KONG Qingjun*2， REN Xueyan2
（1.College of Life Science，Shihezi University，Shihezi 832000，China；2.College of Food Engineering and Nutrition Science，Shanxi Normal University，Xi'an 710119，China）

Disc diffusion and direct contacting of essential oil and fruit pathogenic bacterias are utilized to study the effects of plant essential oil lavender essential oil，peppermint oil and grape seed oil on alternaria alternata，penicillium expansum and geotrichum candidum in this research.After analyzing the result of the research，we find out that in 1 μL/L，2 μL/L，3 μL/L，4 μL/L，5 μL/L concentrations of these plant oils have unlike effects in fruit pathogenic bacteria of alternaria alternata，penicillium expansum and geotrichum candidum.And how we dealwith the materials can influence the final result as well.In disc diffusion experiment the sensitivity towards lavender essential oil are alternaria alternate＞penicillium expansum＞geotrichum candidum，while the sensitivity towards peppermint oil are alternaria alternate＞geotrichum candidum＞penicilliumexpansum，and towards grape seed oil are penicillium expansum＞alternaria alternate＞geotrichum candidum.Whereas in the experiment of contacting essential oil and fruit pathogenic bacteria we got a different result.In 100 μL/L，200 μL/L，300 μL/L，400 μL/L，500 μL/L concentrations of the plant oils.The sensitivity towards lavender essential oil are geotrichum candidum ＞alternaria alternata＞penicillium expansum，which towards peppermint oil are geotrichum candidum ＞alternaria alternate＞penicillium expansum，and that towards grape seed oil are penicillium expansum＞geotrichum candidum＞alternaria alternata.

disc diffusion，essential oil，antimicrobial activity

S 436.5

：A

：1673—1689（2017）07—0714—06

2015-06-30

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31260402，31460411，31671904）。

*通信作者：孔慶軍（1976—），男，黑龍江依安人，理學(xué)博士，副教授，主要從事食品化學(xué)研究。E-mail：kongqingjun1976@snnu.edu.cn

余興，孔慶軍，任雪艷.3種精油對(duì)水果病原菌的抑菌效果研究[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2017，36（07）：714-719.