白菜類作物開花時間的全基因組關(guān)聯(lián)分析

高寶禎，劉博，李石開，梁建麗，程鋒，王曉武，武劍

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白菜類作物開花時間的全基因組關(guān)聯(lián)分析

高寶禎1，劉博1，李石開2，梁建麗1，程鋒1，王曉武1，武劍1

（1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081；2云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所，昆明 650205）

【目的】解析白菜類作物開花時間的調(diào)控位點，定位白菜類作物開花時間相關(guān)的候選基因，為白菜類作物抽薹開花時間的遺傳改良提供依據(jù)?！痉椒ā恳?16份白菜類作物組成的自然群體作為研究材料，分別種植在溫室與露地2個獨立的環(huán)境中，進行開花時間調(diào)查。同時，提取試驗材料的DNA樣品進行深度為1.2x的重測序，對測序數(shù)據(jù)用Pooled Mapping法進行過濾、與參考基因組比對，獲得全基因組高密度SNP集合。經(jīng)過條件過濾后，對高質(zhì)量的SNP集合進行生物信息分析，包括試驗材料的群體結(jié)構(gòu)分析和全基因組連鎖不平衡分析。從高質(zhì)量的SNP集合中，隨機挑選出2 000個變異位點，用PhyML軟件以最大似然法對116份試驗材料進行系統(tǒng)發(fā)育樹分析。用全部的高質(zhì)量SNP集合位點通過軟件Haploview進行全基因組連鎖不平衡分析。最后，將高質(zhì)量的SNP集合與開花時間數(shù)據(jù)結(jié)合，通過TASSEL和GAPIT軟件包以及R程序語言進行全基因組關(guān)聯(lián)分析。根據(jù)強關(guān)聯(lián)峰值信號點位置和連鎖不平衡區(qū)間定位開花時間候選位點，再通過白菜與同源物種擬南芥的基因共線性關(guān)系以及基因功能注釋分析來預(yù)測白菜類作物開花時間相關(guān)的候選基因?！窘Y(jié)果】不同種植條件下、不同類型的白菜類作物在開花時間上存在廣泛差異。試驗材料在露地環(huán)境下的開花時間高峰期明顯早于溫室環(huán)境下的材料；試驗材料在露地環(huán)境下的開花時間總體表現(xiàn)出偏正態(tài)分布，而在溫室環(huán)境下，開花時間各個階段呈現(xiàn)出較為均衡的分布。溫室與露地環(huán)境下的開花時間呈顯著正相關(guān)。通過生物信息學(xué)分析最終得到的高質(zhì)量SNP位點共103萬個。試驗材料的群體結(jié)構(gòu)分析表明在系統(tǒng)發(fā)育樹上各亞群內(nèi)部分布較為集中，不同亞群之間的分布與材料的地理起源密切相關(guān)。全基因組衰減平均LD為2.3 kb，表明在116份白菜類作物構(gòu)建的群體內(nèi)存在較為頻繁的重組和突變。對不同條件下的開花時間進行全基因組關(guān)聯(lián)分析，用復(fù)合模型檢測到54個（＞4）強關(guān)聯(lián)峰值信號點，一般模型檢測到87個（＞5）。通過進一步分析強關(guān)聯(lián)信號點的連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD）區(qū)段，得到存在強連鎖關(guān)系（2＞0.33）的峰值信號點共33個（溫室環(huán)境下27個，露地環(huán)境下19個）。其中，在溫室與露地環(huán)境下的共定位位點13個。根據(jù)33個關(guān)聯(lián)候選位點，再通過白菜與同源物種擬南芥的基因共線性關(guān)系以及基因功能注釋分析篩選出白菜類作物開花時間相關(guān)的候選基因14個，其中溫室與露地環(huán)境下共定位候選基因3個（、和）。在露地條件下定位到開花關(guān)鍵基因?！窘Y(jié)論】不同條件下開花時間的相關(guān)性分析表明，遺傳效應(yīng)在開花早晚中起著決定性作用。全基因組關(guān)聯(lián)分析共鑒定出33個與開花時間相關(guān)的顯著關(guān)聯(lián)信號。通過連鎖不平衡分析、白菜與同源物種擬南芥的基因共線性關(guān)系以及基因功能注釋分析初步鑒定出14個白菜類作物開花時間相關(guān)的候選基因。

白菜類作物；開花時間；連鎖不平衡；全基因組關(guān)聯(lián)分析；候選基因

0 引言

【研究意義】白菜類作物（）屬于十字花科蕓薹屬（genusof the familyBrassicaceae），是中國乃至世界范圍內(nèi)重要的蔬菜和油料作物，主要包括大白菜、小白菜、蕪菁、菜薹、紫菜薹、白菜型油菜等豐富的類型。抽薹開花是白菜類作物生產(chǎn)中很重要的農(nóng)藝性狀。在中國春季及高寒地區(qū)的秋冬白菜類作物生產(chǎn)中，先期抽薹開花常常成為降低蔬菜產(chǎn)量和品質(zhì)的重要難題。因此，挖掘白菜類作物抽薹開花調(diào)控位點和基因，培育晚抽薹開花品種，對于保證蔬菜質(zhì)量和產(chǎn)量、降低菜農(nóng)損失具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】植物開花是基因網(wǎng)絡(luò)與環(huán)境因素相互作用的結(jié)果。植物開花的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在模式植物擬南芥中已有了深入的研究[1-6]，目前，已發(fā)現(xiàn)有180多個基因與調(diào)控抽薹開花有關(guān)，且花期調(diào)控存在多條調(diào)控路徑（光周期路徑、春化路徑、自主路徑、赤霉素路徑、年齡路徑等）。WANG等[7-8]研究認為，雖然白菜類作物與擬南芥具有很近的親緣關(guān)系，但白菜類作物在與擬南芥分化后經(jīng)歷了基因組三倍化事件，復(fù)制的開花基因在白菜類作物基因組二倍化過程中有些保留了多拷貝，有些則仍然保持單拷貝，有的則丟失。因而白菜類作物的開花調(diào)控相比擬南芥而言更為復(fù)雜。前人開展了許多白菜類作物開花時間的分子遺傳分析，但主要的研究策略是利用分離群體進行QTL分析，以鑒定出可能的候選基因。LOU等[8]用多種白菜類作物（包括159份高代自交系群體、50份自然群體和8份野生群體材料）進行QTL分析，發(fā)現(xiàn)開花時間QTL部分與生物鐘重疊；WU等[9]通過對159份白菜類作物序列分析，發(fā)現(xiàn)的一個InDel變異與開花時間關(guān)聯(lián)，并在分離群體中驗證；XIAO等[10]利用90份DH材料通過轉(zhuǎn)錄共表達分析發(fā)現(xiàn)是調(diào)控白菜類作物開花時間的關(guān)鍵因子；KITAMOTO 等[11]利用白菜類作物F2群體材料開發(fā)了SSR標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)在第一個內(nèi)含子的長插入片段可導(dǎo)致晚抽薹。目前，GWAS已經(jīng)在模式植物擬南芥[12-13]、玉米[14]、水稻[15-16]、大豆[17]等重要農(nóng)作物中有所應(yīng)用，并找到了比較可靠的關(guān)聯(lián)信號。隨著各物種全基因組測序的完成，大規(guī)模重測序的開展和SNP標(biāo)記的大量開發(fā)，利用GWAS研究植物復(fù)雜數(shù)量性狀成為強有力的工具?！颈狙芯壳腥朦c】QTL定位的方法僅能對在分離群體的親本材料間存在差異的基因的效應(yīng)進行分析，無法在全基因組范圍廣泛挖掘參與開花調(diào)控的基因。而白菜類作物開花時間的GWAS研究尚未見報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】采用GWAS鑒定目標(biāo)性狀顯著關(guān)聯(lián)SNP，根據(jù)連鎖不平衡強度和基因注釋信息，確定控制性狀變異的候選基因。為分子標(biāo)記輔助選擇育種，培育晚抽薹開花品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

室內(nèi)試驗和分析于2015—2016年在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所完成。

1.1 試驗材料

供試材料共116份，來自于國內(nèi)外廣泛收集的代表性白菜類作物資源，大白菜、小白菜、菜薹、紫菜薹、白菜型油菜主要來自中國和日本，蕪菁、意大利菜心主要來自歐洲，黃籽沙遜油菜來自南亞（表1）。所有材料均為自然群體，所有材料的名稱、編號、屬性及來源見電子附表1。

1.2 種植處理

試驗1：2009年10月至2010年4月，將116份試驗材料種植于云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗基地的露地大田。試驗2：2010年10月至2011年3月，將116份試驗材料種植于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所的玻璃溫室。2個獨立試驗均在25℃催芽，出芽后播種于穴盤育苗。播種30 d后，分別定植到露地（試驗1）和塑料花盆（10 cm×10 cm）（試驗2）中。試驗2中花盆內(nèi)的土壤為3﹕1的草炭﹕蛭石。栽培過程中采用常規(guī)管理，視需要適當(dāng)施肥，無其他特殊處理。每份材料設(shè)置4個重復(fù)單株。

1.3 開花時間調(diào)查

從播種到出現(xiàn)第一朵花所需的時間作為開花時間（days to flowering，DTF）。每日對開花情況進行記錄。待調(diào)查試驗結(jié)束后，取每份材料的花期平均值作為表型數(shù)據(jù)，進行關(guān)聯(lián)分析。根據(jù)調(diào)查截止時間，將未開花的材料的開花時間定為150 d。

1.4 全基因組重測序

選取苗期的白菜幼嫩葉片，采用改良CTAB法提取每一份材料的DNA樣品。取樣時對溫室環(huán)境下的每份材料選1個單株取樣。提取的DNA樣品采用Illumina HiSeqTM2000 平臺（Illumina Inc., San Diego, CA, USA）進行雙末端重測序，產(chǎn)生100 bp長的pair-end（PE）reads。116份重測序材料的總數(shù)據(jù)量為77G，平均每個樣本的測序深度為1.2x。

1.5 重測序分析與基因分型

將116份材料的reads集合利用FU等[18]的方法對低深度重測序進行過濾、參考基因組比對，得到單核苷酸多態(tài)性變異（SNP）集合。采用臨近算法（KNN）[16]對SNP集合的缺失數(shù)據(jù)進行填補處理。

對填補后的數(shù)據(jù)進行過濾：（1）過濾掉基因型缺失度超過70%的變異位點；（2）過濾掉最小等位基因頻率（MAF）＜0.05的變異位點；（3）只保留二態(tài)的變異位點。過濾后得到高質(zhì)量的SNP矩陣用于后續(xù)分析。

1.6 群體結(jié)構(gòu)分析

從上述SNP集合中，利用隨機函數(shù)挑選出2 000個變異位點進行如下分析：采用PhyML version 3.0[19]軟件以默認參數(shù)對116份白菜類作物進行系統(tǒng)發(fā)育分析（最大似然法，maximum likelihood）。

1.7 全基因組連鎖不平衡分析

用過濾后SNP集合位點進行全基因組連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD）分析[20]，分析采用軟件Haploview[21]進行。

1.8 全基因組關(guān)聯(lián)分析

將花期調(diào)查的表型數(shù)據(jù)和過濾后構(gòu)建的高質(zhì)量SNP矩陣，通過一般線性模型（general linear model，GLM）和壓縮復(fù)合線性模型（compressed mixed linear model，cMLM）分別對116份白菜類作物的花期性狀進行全基因組關(guān)聯(lián)分析。GLM使用軟件TASSEL version 3.0[22]，cMLM使用GAPITR軟件包[23]。

1.9 候選基因預(yù)測

根據(jù)GWAS結(jié)果獲得的強關(guān)聯(lián)信號（一般線性模型＞5；壓縮復(fù)合線性模型＞4）和白菜基因組LD區(qū)段，來確定強選擇位點處LD區(qū)段上的白菜開花時間的候選基因，再結(jié)合白菜的近緣物種擬南芥與白菜基因的共線性分析結(jié)果和功能注釋信息（database，http://brassicadb.org /brad/），從而找到開花相關(guān)的候選基因。

2 結(jié)果

2.1 白菜類作物開花時間表型數(shù)據(jù)

在溫室和露地大田對116份試驗材料進行開花時間調(diào)查，結(jié)果表明，白菜類作物在開花時間上存在廣泛的差異（表1），溫室條件下開花時間的變異范圍為46—150 d；大田條件下開花時間的變異范圍為52—150 d。在不同類型的白菜類作物間開花時間也存在差異，蕪菁開花普遍最晚，結(jié)球白菜次之，非結(jié)球白菜類（小白菜、意大利菜心、菜薹、紫菜薹、烏塌菜）較早，而白菜型油菜的開花時間則早晚均有，這與其包含春油菜和冬油菜有關(guān)。

表1 試驗材料類型及其在露地和溫室的開花時間

圖1 116份白菜類作物開花時間的頻數(shù)分布圖

由圖1可知，在41—60 d中，露地環(huán)境下只有3份材料開花，溫室環(huán)境下有17份；61—80 d和81—100 d中，露地環(huán)境下的材料開花數(shù)目達到高峰，分別有26、28份材料開花，而溫室環(huán)境下則分別有18、20份材料開花；在101—120 d和121—140 d內(nèi)，溫室環(huán)境與露地環(huán)境的材料開花數(shù)目差異不明顯。這說明試驗材料在不同環(huán)境中開花時間存在差別。在露地環(huán)境下61—80 d和81—100 d中開花的材料，在溫室環(huán)境下的開花時間提早至41—60 d；露地環(huán)境下的材料開花高峰期卻明顯早于溫室環(huán)境下的材料；試驗材料在露地環(huán)境下的開花時間總體表現(xiàn)出偏正態(tài)分布，而在溫室環(huán)境下，開花時間各個階段呈現(xiàn)出較為均衡的分布。

對溫室與露地環(huán)境下的開花時間做相關(guān)性分析（圖2），結(jié)果表明，2個環(huán)境下的開花時間之間存在高度正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.89，說明遺傳效應(yīng)在開花早晚中起著決定性作用。

2.2 群體結(jié)構(gòu)分析及全基因組連鎖不平衡分析

由于樣本的全基因組重測序覆蓋度較低，平均為1.2x左右，因此，導(dǎo)致一些樣本的基因型缺失，通過KNN算法，對缺失基因型進行了填補。經(jīng)過填補和過濾后，最終得到高質(zhì)量的SNP集合共有103萬個SNP變異位點。

從上述SNP集合中隨機挑選出2 000個SNP位點進行了系統(tǒng)發(fā)育樹分析（圖3），結(jié)果顯示，同為歐洲-地中海一帶起源的蕪菁和意大利菜心在發(fā)育樹上更為接近，而主要起源于東亞、同屬非結(jié)球白菜類的小白菜、菜薹、紫菜薹、烏塌菜在發(fā)育樹上更為接近，白菜型油菜則分到2個明顯的分支上。表明116份白菜類試驗材料在系統(tǒng)發(fā)育樹上各亞群內(nèi)部分布較為集中，不同亞群之間的分布與材料的地理起源密切相關(guān)。

圖2 溫室與露地環(huán)境下開花時間的相關(guān)性

粉紅：非結(jié)球白菜類（小白菜、菜薹、紫菜薹、烏塌菜）；綠色：白菜型油菜（春油菜、冬油菜、黃籽沙遜油菜）；紅色：大白菜；藍色：歐洲類型（蕪菁、意大利菜心） Pink: Non-heading leafy type (ssp. chinensis, ssp. parachinensis, ssp. chinensis var. purpurea, ssp. chinensis); Green: Oilseed type (spring oilseed, winter oilseed, subsp. trilocularis); Red: ssp. pekinensis; Dark blue: ssp. rapa; Light blue: ssp. broccoletto

用上述全部SNP位點進行全基因組連鎖不平衡分析（圖4），可知，當(dāng)2從0.48衰減到0.26時，所對應(yīng)的物理距離為2.3 kb，因此，白菜類作物的全基因組平均LD為2.3 kb（當(dāng)2值衰減到其最大值一半時對應(yīng)的物理長度，即為全基因組平均LD）。

圖4 116份白菜類作物全基因組連鎖不平衡衰減

分別利用GLM和cMLM模型對開花時間進行全基因組關(guān)聯(lián)分析（圖5）。對獲得的顯著信號點進行連鎖強度分析過濾，得到存在強連鎖關(guān)系（2＞0.33）的峰值信號點共33個（溫室環(huán)境下27個，露地環(huán)境下19個）。其中，在溫室與露地環(huán)境下的共定位位點有13個（表2）。

對33個強關(guān)聯(lián)信號位點的功能注釋信息分析（表2）可知，有21個位點位于基因間區(qū)，4個點位于內(nèi)含子，7個點位于外顯子區(qū)域，其中只有2個點（SNP=A02_25176329，SNP=A09_26670099）是非同義突變，前者由異亮氨酸（Ile）變?yōu)樘K氨酸（Thr），后者由丙氨酸（Ala）變?yōu)榻z氨酸（Ser），兩者都發(fā)生了氨基酸極性性質(zhì)的改變，這可能會引起其編碼蛋白發(fā)生較大的功能變異。

2.3 候選基因預(yù)測

通過溫室與露地環(huán)境下定位到的開花時間強關(guān)聯(lián)信號位點，分析其所在的連鎖不平衡區(qū)段，同時，根據(jù)白菜與擬南芥基因的共線性分析與功能注釋結(jié)果（database，http://brassicadb.org/brad/），共定位到14個白菜花期控制的候選基因與擬南芥存在共線性同源關(guān)系，同時，對候選基因進行了GO注釋分析（電子版附表2）。14個白菜開花時間候選基因中，溫室與露地環(huán)境下共定位3個候選基因（、和），在露地條件下定位到開花時間關(guān)鍵因子（表3）。

A：溫室試驗_一般模型；B：溫室試驗_復(fù)合模型；C：露地試驗_一般模型；D：露地試驗_復(fù)合模型

3 討論

隨著測序技術(shù)的發(fā)展，基因組測序和重測序已經(jīng)在重要農(nóng)作物研究中普及應(yīng)用，通過全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）來挖掘目標(biāo)性狀的候選基因成為可能。GWAS比傳統(tǒng)QTL研究有明顯的優(yōu)勢，且已在多個模式植物和重要農(nóng)作物中得到應(yīng)用[12,15,17]。

開花時間是影響白菜類作物產(chǎn)量和質(zhì)量的重要農(nóng)藝學(xué)性狀，因此，利用GWAS分析挖掘白菜類作物晚開花基因?qū)τ诎撞四拖绕诔檗酚N具有重要的價值。目前關(guān)于白菜類作物開花時間變異的關(guān)聯(lián)分析還未見報道。白菜類具有非常豐富的亞群，各亞群的開花時間存在很大差異。本研究選取了來自于東亞、歐洲、南亞的白菜類作物材料，盡可能覆蓋了白菜類作物栽培的不同地域，構(gòu)建了一個具有豐富開花時間變異的自然群體材料作為試驗樣本，保證了表型數(shù)據(jù)的多樣性。此外，本研究通過全基因組低乘數(shù)重測序的方法，獲得了大量的SNP標(biāo)記，數(shù)量級達到百萬，且經(jīng)過嚴格的過濾篩選，在達到全基因組分布密度的基礎(chǔ)上保證了標(biāo)記的可靠性。并采用了2個環(huán)境對關(guān)聯(lián)結(jié)果進行LD連鎖強度（2＞0.33）篩選，進一步提高了關(guān)聯(lián)分析的準(zhǔn)確性。

表2 強關(guān)聯(lián)信號位點及注釋信息

粗體表示溫室與露地環(huán)境下的13個共定位位點信息

Bold font refers to information of 13 co-identity signals under greenhouse and open-field environment

表3 白菜開花時間的候選基因

BARCHI等[24]報道擬南芥184份材料組成的自然群體在露地和嚴格控制環(huán)境條件的溫室中開花時間的相關(guān)性低，并由此得出在自然條件而非嚴格控制的環(huán)境條件下研究開花時間的基因型與環(huán)境互作非常重要。本研究的表型調(diào)查分別在日光溫室和露地條件下進行，均為白菜生產(chǎn)上的栽培條件，以期獲得可以用于耐抽薹育種的位點或分子標(biāo)記。研究結(jié)果顯示，116份材料在2種不同的栽培條件下的開花時間顯著相關(guān)，并且通過GWAS分析共鑒定出33個強關(guān)聯(lián)信號點，其中13個是在露地和溫室條件下共定位的關(guān)聯(lián)信號。

本研究中有34份材料屬于高代自交系材料（電子版附表1），付麗霞[25]對包含這批自交系材料的白菜類作物進行了低深度重測序材料的CAPS/dCAPS分型驗證。結(jié)果顯示，通過本研究中的Pooled Mapping法獲得的位點基因型與CAPS/dCAPS試驗的分型結(jié)果完全一致。驗證的位點一致性說明Pooled Mapping法在低深度重測序中進行SNPs分型結(jié)果具有可靠性。同樣的基因分型方法應(yīng)用于甘藍的低深度測序中，驗證結(jié)果同樣證明了Pooled Mapping法具有可靠性[18]。

利用白菜與擬南芥的共線性關(guān)系[26]，本研究在強信號關(guān)聯(lián)位點共找到14個白菜開花時間相關(guān)的候選基因，其中，既包括已報道的開花調(diào)控基因如開花信號整合因子（），也包括一些功能未知的基因。這些基因?qū)τ谥笇?dǎo)白菜耐抽薹性選育具有參考價值。

本研究中，溫室與露地環(huán)境下共定位到3個候選基因（、和）。在模式植物擬南芥中，已經(jīng)被證實具有促進開花的作用，在開花通路中參與到開花應(yīng)答與組織發(fā)育路徑中[27-29]。MELZER等[27]研究發(fā)現(xiàn)，不僅能調(diào)控開花時間，而且影響組織確定性。FUL蛋白活性可以有效增加植物壽命而不受開花時間影響。Teper-Bamnolker等[28]發(fā)現(xiàn)，開花時間調(diào)控的開關(guān)基因可以調(diào)控在葉片中的積累。在組織中的積累與開花轉(zhuǎn)變相關(guān)，并且對其具有促進作用。Ferrándiz等[29]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)作用元件MADS-box變異與和一起出現(xiàn)時，會導(dǎo)致其突變體植株不開花，而在開花位置不斷地生成葉片分生組織。此外，研究發(fā)現(xiàn)，小麥中的與擬南芥中的有高度同源性，且在分生組織發(fā)育過程中與花期調(diào)控相關(guān)[30]。雖然目前在白菜類作物開花調(diào)控中還未見相關(guān)報道，但是根據(jù)Melzer等[27]的研究，不管環(huán)境條件如何影響開花時間，都能夠參與到組織發(fā)育過程中，由此推測，在本研究中，雖然溫室和露地環(huán)境的差異造成了開花時間上的差異，但是卻都定位到了。因此，結(jié)合目前已知作物的研究可推測其在白菜類作物中參與到花期調(diào)控的組織發(fā)育階段和路徑中。

在擬南芥的開花調(diào)控中參與到光周期路徑中，與紅光/遠紅光的光受體作用有關(guān)。光周期路徑中，植物開花不僅受光照長度影響，還受到光譜影響。PHYB蛋白可以作為光受體吸收紅光/遠紅光，促進CO蛋白降解，抑制表達，從而延遲開花，其突變體在長/短日照下都能表現(xiàn)出早開花[31-33]。低強度或低頻率的紅光/遠紅光會降低PHYB蛋白光受體（光敏色素B）的活性，這使得PHYTOCHROME INTERACTING FACTORS（PIFs）直接激活生長素合成基因的翻譯表達，而引起避光反應(yīng)，包括擬南芥早開花和莖部伸長[34]。前人對植物中光受體信號網(wǎng)絡(luò)的研究發(fā)現(xiàn)，不同的物種中，PHYB蛋白擁有其他伙伴成員，但是PHYB是最重要的一類與遮陰反應(yīng)有關(guān)的光受體。擬南芥中有PHYB、PHYD、PHYE[35-38]，番茄中有PHYB、PHYB2、PHYE[39]，還有黃瓜[40]、白菜[41-42]、高粱[43]等都含有PHYB蛋白受體[44]。Robson等[45]對擬南芥和白菜作物的突變進行了研究，的變異可降低感受紅光﹕遠紅光的比例。由此推測，白菜中的候選基因可能參與到光周期路徑中。

目前，關(guān)于的研究主要集中于擬南芥中，有報道指出，通過赤霉素（GA）信號途徑，擬南芥在長/短日照下都能引起早開花[46-47]?？梢愿淖兯镜拈_花時間和根部發(fā)育狀況[48]。黃瓊?cè)A等[49]將擬南芥早花基因通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化獲得了再生轉(zhuǎn)基因植株，受體為白菜類作物的近源物種甘藍型油菜的下胚軸。但是沒有進一步研究其對轉(zhuǎn)基因甘藍型油菜開花時間的影響。

另外，本研究中，白菜類作物的連鎖不平衡衰減距離為2.3 kb，與最新的研究結(jié)果[50]（~3 kb）相近，小于擬南芥基因組的LD衰減率[51]（~10 kb），而遠遠小于水稻基因組平均LD[16]（＞100 kb）。這可能與白菜類作物是異花授粉植物，具有自交不親和性有關(guān)，說明在116份白菜類作物構(gòu)建的群體內(nèi)存在較為頻繁的重組和突變。

GWAS可以作為白菜類作物開花時間候選基因定位的有力工具，通過這一分析獲得的候選基因為分子輔助育種提供依據(jù)，下一步將深入開展上述候選基因的功能研究，進一步揭示開花時間調(diào)控的分子遺傳機理，為選育白菜類作物耐抽薹品種打下基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

GWAS分析檢測到33個與白菜類作物開花時間顯著關(guān)聯(lián)的SNP信號（溫室環(huán)境下27個，露地環(huán)境下19個），其中溫室與露地環(huán)境下的共定位位點13個。白菜與同源物種擬南芥的基因共線性關(guān)系以及基因功能注釋分析初步鑒定出14個白菜類作物開花時間相關(guān)的候選基因。

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（責(zé)任編輯 李莉，岳梅）

附表1 本研究所用的植物材料及其開花時間表型

Table S1 Plant materials used in this study and their flowering time phenotype data

編號Code亞群Sub-population品種名稱accessions name類型Type試驗1Trait 1試驗2 Trait 2 開花時間DTF (d)開花時間 DTF (d) NE001蕪菁Turnip CGN07164高代自交系 AIL150±0.00150±0.00 NE002蕪菁Turnip CGN11010高代自交系 AILNA150±0.00 NE004蕪菁TurnipCGN15201高代自交系 AIL95±1.0099±0.63 NE007蕪菁TurnipCGN19961高代自交系 AILNA123±1.26 NE009蕪菁TurnipCGN06709高代自交系 AIL150±0.00150±0.00 NE010小白菜Pak ChoiUnknown高代自交系 AIL100±1.20121±2.37 NE013蕪菁TurnipCGN20735高代自交系 AIL149±1.40150±0.00 NE014蕪菁TurnipHong Man Jing高代自交系 AIL150±0.00150±0.00 NE015蕪菁TurnipPu Da Cuo Wu Jing高代自交系 AIL150±0.00149±0.15 NE016蕪菁TurnipKu Wu Jing高代自交系 AILNA148±0.50 NE017蕪菁TurnipHong Yuan Man Jing高代自交系 AIL150±0.00150±0.00 NE019蕪菁TurnipMian Tian Huang Man Jing高代自交系 AILNA150±0.00 NE020蕪菁TurnipHuang Chang Man Jing高代自交系 AIL147±2.20149±1.25 NE021蕪菁TurnipDan Huang Man Jing高代自交系 AIL143±3.50148±1.46 NE022蕪菁TurnipTe Hao Chi Man Jing高代自交系 AIL140±8.70150±0.00 NE023蕪菁TurnipZi Yuan Man Jing高代自交系 AIL129±1.26150±0.00 NE024大白菜Chinese cabbageZ16DH134±1.20144±0.97 NE025大白菜Chinese cabbageVO2A0014高代自交系 AIL136±0.50147±0.60 NE026大白菜Chinese cabbageV02A0555DH99±1.5569±1.80 NE027大白菜Chinese cabbageCGN07201高代自交系 AIL124±0.70109±1.15 NE030小白菜Pak ChoiVO2B0613高代自交系 AIL129±1.41138±1.55 NE031小白菜Pak Choi225 Bai Cai-Vs-2DH110±0.0097±0.83 NE032小白菜Pak ChoiVO2B0697高代自交系 AIL103±0.5056±0.06 NE033小白菜Pak ChoiVO2B1223高代自交系 AILNA107±3.01 NE034小白菜Pak ChoiShang Hai Wu Yue ManDH103±1.5574±2.32 NE035小白菜Pak ChoiShang Hai Si Yue ManDH149±0.70148±1.38 NE036小白菜Pak ChoiHua Guan Qing Geng Bai CaiDH150±0.00148±0.89 NE037小白菜Pak ChoiFang Zhen Hei You Yi HaoDH118±1.55129±1.43 NE038小白菜Pak ChoiJin Sha Qing Jiang Bai CaiDH134±1.41132±3.46 NE039小白菜Pak ChoiLv Xin Qing CaiDH136±2.50147±1.55 NE040小白菜Pak ChoiSi Ji Xiang Cui Xiao Bai CaiDH111±2.0688±2.06 NE041小白菜Pak ChoiRi Ben Shu Yao Da Tou Qing Jiang BaiDH120±5.07137±4.00 NE042小白菜Pak Choi1263C IIDH120±0.82120±2.60 NE043小白菜Pak ChoiTai Wan Da Tou Qing Jiang Bai CaiDH140±5.35118±2.50 NE044小白菜Pak ChoiXiu Li Piao Er BaiDH129±1.16132±2.06 NE045小白菜Pak ChoiV02B0002DH111±1.74121±1.60 NE046蕪菁TurnipUnknownDH124±4.00127±1.73 NE047小白菜Pak ChoiHei You Bai CaiDH131±1.41132±0.05 NE048小白菜Pak ChoiV02B0591DH136±4.92150±0.00 續(xù)附表1 Continued table S1 編號Code亞群Sub-population品種名稱accessions name類型Type試驗1Trait 1試驗2 Trait 2 開花時間DTF (d)開花時間 DTF (d) NE049小白菜Pak ChoiV02B0544DH149±0.20135±0.60 NE051小白菜Pak ChoiJing Guan Wang Qing Geng Cai ZhongDH127±0.07122±0.70 NE052小白菜Pak ChoiShang Hai QingDHNA130±1.05 NE053小白菜Pak ChoiGao Jiao Si Ji Qing Bai CaiDH104±1.56101±1.45 NE054小白菜Pak ChoiHuang Yang Xiao Bai CaiDH117±2.30128±2.66 NE055小白菜Pak ChoiHuang Xin Wu高代自交系 AIL122±1.15126±1.55 NE056小白菜Pak ChoiHuang Xin Wu高代自交系 AIL110±2.5292±2.03 NE057小白菜Pak ChoiHuang Xin Wu Bai Cai高代自交系 AIL122±1.50128±1.50 NE058菜心CaixinV02D0130DH83±2.06102±1.58 NE059菜心CaixinV02D0136DH67±4.4047±4.00 NE060菜心CaixinV02D0172DH99±1.1799±0.99 NE061菜心CaixinV02D0212DH62±2.3256±2.30 NE063菜心CaixinV02D0152DH84±0.8767±1.00 NE064蕪菁TurnipUnknownDH122±2.00119±1.77 NE066菜心CaixinLiu Ye 70 Tian You Qing Cai XinDH53±2.8953±3.00 NE067菜心CaixinChuan Shan Liu Ye Cai XinDHNA63±0.77 NE068菜心CaixinSi Jiu Cai Xin L58高代自交系 AILNA53±1.69 NE069意大利菜心BroccolettoCGN06825DH99±1.7376±1.50 NE070菜心CaixinUnknownDH52±3.7050±4.00 NE071意大利菜心BroccolettoCGN17278高代自交系 AIL74±3.5690±3.52 NE072意大利菜心BroccolettoCGN15190高代自交系 AIL90±1.2980±1.56 NE073紫菜薹Zi CaitaiW55DH103±3.58111±3.47 NE074紫菜薹Zi CaitaiW184高代自交系 AIL149±0.50150±0.00 NE076紫菜薹Zi CaitaiV02D0107DH97±0.0093±0.06 NE077紫菜薹Zi CaitaiV02D0140DH108±0.71126±0.55 NE078紫菜薹Zi CaitaiV02D0194DH52±1.3255±1.43 NE079紫菜薹Zi CaitaiGai Liang Shi Yue HongDH92±2.6194±2.03 NE083烏塌菜WutacaiLv Ling Wu Ta CaiDH115±3.28135±2.98 NE084烏塌菜WutacaiZhong Ba Ye Wu Ta CaiDH130±0.28150±0.00 NE087油用白菜 OilseedCGN06834高代自交系 AIL139±1.50121±1.37 NE088油用白菜 OilseedCGN06837高代自交系 AIL107±0.00120±0.06 NE089油用白菜 OilseedCGN06839DH72±0.0049±0.03 NE090油用白菜 OilseedCGN06840DH72±0.7655±1.00 NE091蕪菁TurnipUnknownDH122±2.45133±1.98 NE092油用白菜 OilseedL39高代自交系 AIL70±3.6456±4.00 NE094油用白菜 OilseedL33高代自交系 AIL72±0.2846±0.56 NE097油用白菜 Oilseedoil0115高代自交系 AIL77±0.15104±0.22 NE108油用白菜 OilseedL143高代自交系 AIL86±2.47120±2.38 NE109黃籽沙遜油菜Yellow SarsonR-O-18高代自交系 AIL118±0.16101±0.10 續(xù)附表1 Continued table S1 編號Code亞群Sub-population品種名稱accessions name類型Type試驗1Trait 1試驗2 Trait 2 開花時間DTF (d)開花時間 DTF (d) NE110蕪菁TurnipUnknown高代自交系 AIL115±2.31108±2.55 NE111小白菜Pak ChoiUnknown高代自交系 AIL79±0.0753±1.00 NE112油用白菜 OilseedQian Feng 3地方品種 LV87±0.8298±0.77 NE113油用白菜 OilseedQian Feng 6地方品種 LV101±4.0088±3.90 NE115油用白菜 OilseedXiao Shi Qiao 14地方品種 LV72±3.4660±4.00 NE116油用白菜 OilseedCha He 10地方品種 LV72±1.4157±1.50 NE118油用白菜 OilseedYao An Hei Cai Zi地方品種 LV94±3.6167±4.00 NE119油用白菜 OilseedQi Lu Hei Cai Zi地方品種 LV98±3.10111±3.55 NE121油用白菜 OilseedHua Ning Ai Jiao Hei Cai Zi地方品種 LV74±1.5878±1.98 NE122油用白菜 OilseedHua Ping Ai Jiao Hei Cai Zi地方品種 LV93±5.29NA NE124油用白菜 OilseedWen Shan Ai You Cai地方品種 LV72±2.3264±3.48 NE125油用白菜 OilseedMeng Zi Ai Jiao Hei Cai Zi地方品種 LV72±1.1587±2.28 NE126油用白菜 OilseedJing Dong Bao Dian Ai Jiao You Cai地方品種 LV72±2.8977±3.00 NE127油用白菜 OilseedMeng Zi Shui Tian Xiang Hei Cai Zi 1地方品種 LV72±1.5091±1.05 NE128油用白菜 OilseedMeng Zi Shui Tian Xiang Hei Cai Zi 2地方品種 LV72±3.1057±2.99 NE129油用白菜 OilseedMeng Zi Hei Ai Jiao Cai Zi地方品種 LV76±1.41101±1.50 NE131油用白菜 OilseedZhao Tong Hei Cai Zi地方品種 LV70±1.4156±1.30 NE133油用白菜 OilseedYuan Yang Hei Cai Zi地方品種 LV78±2.5271±3.10 NE134油用白菜 OilseedYu Xi You Cai地方品種 LV80±2.8373±3.00 NE135油用白菜 OilseedMeng Zi Qiao Tou Xiang Hei Cai Zi地方品種 LV88±5.2985±4.99 NE136油用白菜 OilseedZhen Kang Hong You Cai地方品種 LV85±1.7391±1.90 NE139小白菜Pak ChoiUnknown地方品種 LV94±5.35111±5.00 NE140油用白菜 OilseedFeng Yi Hei Cai Zi地方品種 LV93±4.00122±3.60 NE142油用白菜 OilseedJian Chuan Ai Jiao You Cai地方品種 LVNA83±1.55 NE144油用白菜 OilseedMeng Zi Lao Jia Hei Cai Zi地方品種 LV83±3.5481±4.00 NE145油用白菜 OilseedCheng Gong Da Pi Zi 2地方品種 LV81±2.5260±2.50 NE146油用白菜 OilseedHuang Yang Bai You Cai地方品種 LV79±2.8981±3.20 NE149油用白菜 OilseedYong Ping Yan Bei Hei Cai Zi地方品種 LV98±5.0090±4.55 NE150油用白菜 OilseedHe Qing Niu Jie Ai Jiao Zi地方品種 LV100±2.38107±3.00 NE152油用白菜 OilseedYu Xi Yao Ke地方品種 LV90±1.5094±1.71 NE153油用白菜 OilseedLu Shi 1地方品種 LV79±3.5474±3.95 NE154油用白菜 OilseedNan Hua Zhang He Tun Hei Cai Zi地方品種 LV88±8.7271±6.30 NE155油用白菜 OilseedYu Xi Zhou Yong Da Hei Cai Zi地方品種 LV79±5.0068±3.83 NE156油用白菜oilseedHong Cheng Hei Cai Zi地方品種 LV90±2.5282±3.00 NE157油用白菜oilseedZhen Yuan Xin Tang Li Hong You Cai地方品種 LV82±2.38106±3.10 NE158小白菜Pak ChoiUnknown地方品種 LV72±1.1567±1.30 NE159油用白菜oilseedWan Gang Xiang 2地方品種 LV86±3.7076±5.00 NE160油用白菜oilseed Chu Xiong Dong Ping Xiang Hei Cai Zi地方品種 LV72±4.6969±3.50

“NA”表示缺失數(shù)據(jù)，開花時間為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差

“NA” refers to the missing data, Days to flowering (DTF) are means±SD. AIL: advanced inbred line; LV: local variety

附表2 白菜開花時間候選基因的GO注釋

Table S2 GO annotation of candidate genes for significant association signals for flowering time in

候選基因Candidate geneGO注釋GO annotation Bra023629GO:0000785染色質(zhì)；細胞組成 Chromatin; Cellular component GO:0003682染色質(zhì)結(jié)合；分子功能 Chromatin binding; Molecular function GO:0005634細胞核；細胞組成 Nucleus; Cellular component GO:0006333染色質(zhì)組裝或解體；生化過程 Chromatin assembly or disassembly; Biological process Bra029347GO:0003700轉(zhuǎn)錄因子活性；分子功能 Transcription factor activity; Molecular function GO:0005634細胞核；細胞組成 Nucleus; Cellular component GO:0006355依賴于DNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控；生化過程 Regulation of transcription, DNA-dependent; Biological process GO:0043565DNA綁定特異序列；分子功能 Sequence-specific DNA binding; Molecular function Bra006322GO:0003700轉(zhuǎn)錄因子活性；分子功能 Transcription factor activity; Molecular function GO:0005634細胞核；細胞組成 Nucleus; Cellular component GO:0006355依賴于DNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控；生化過程 Regulation of transcription, DNA-dependent; Biological process GO:0043565DNA綁定特異序列；分子功能 Sequence-specific DNA binding; Molecular function Bra025655GO:0003677DNA綁定；分子功能 DNA binding; Molecular function GO:0008270鋅離子結(jié)合；分子功能 Zinc ion binding; Molecular function GO:0045449轉(zhuǎn)錄調(diào)控；生化過程 Regulation of transcription; Biological process Bra030284GO:0003676核酸結(jié)合；分子功能 Nucleic acid binding; Molecular function Bra022192GO:0000155雙傳感器活性；分子功能 Two-component sensor activity; Molecular function GO:0004673蛋白組氨酸激酶活性；分子功能 Protein histidine kinase activity; Molecular function GO:0004871信號轉(zhuǎn)運活性；分子功能 Signal transducer activity; Molecular function GO:0004872受體活性；分子功能 Receptor activity; Molecular function GO:0005524ATP結(jié)合；分子功能 ATP binding; Molecular function GO:0006355依賴于DNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控；生化過程 Regulation of transcription, DNA-dependent; Biological process GO:0007165信號轉(zhuǎn)換；生化過程 Signal transduction; Biological process GO:0007600感官直覺；生化過程 Sensory perception; Biological process 續(xù)附表2 Continued table S2 候選基因Candidate geneGO注釋GO annotation GO:0008020G蛋白偶聯(lián)的光受體活性；分子功能 G-protein coupled photoreceptor activity; Molecular function GO:0016020生物膜；細胞組成 Membrane; Cellular component GO:0018106肽組氨酸磷酸化；生化過程 Peptidyl-histidine phosphorylation; Biological process GO:0018298蛋白發(fā)色團聯(lián)動；生化過程 Protein-chromophore linkage; Biological process GO:0045449轉(zhuǎn)錄調(diào)控；生化過程 Regulation of transcription; Biological process Bra024329GO:0005525GTP結(jié)合；分子功能 GTP binding; Molecular function GO:0005622細胞內(nèi)的；細胞組成 Intracellular; Cellular component GO:0007264小GTP酶介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；生化過程 Small GTPase mediated signal transduction; Biological process GO:0015031蛋白運輸；生化過程 Protein transport; Biological process Bra017569GO:0006511泛素依賴的蛋白講解過程；生化過程 Ubiquitin-dependent protein catabolic process; Biological process GO:0031461cullin-RING泛素連接酶復(fù)合體；細胞組成 Cullin-RING ubiquitin ligase complex; Cellular component GO:0031625范素蛋白連接酶綁定；分子功能Ubiquitin protein ligase binding; Molecular function Bra009510GO:0003700轉(zhuǎn)錄因子活性；分子功能Transcription factor activity; Molecular function GO:0005634細胞核；細胞組成Nucleus; Cellular component GO:0006355依賴于DNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控；生化過程Regulation of transcription, DNA-dependent; Biological process GO:0030528轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性；分子功能Transcription regulator activity; Molecular function GO:0043565DNA綁定特異序列；分子功能Sequence-specific DNA binding; Molecular function

Genome-Wide Association Studies for Flowering Time in

GAO BaoZhen1, LIU Bo1, LI ShiKai2, LIANG JianLi1, CHENG Feng1, WANG XiaoWu1, WU Jian1

(1Institute of Vegetables and Flowers, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081;2Institute of horticultural crops, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kunming 650205)

【Objective】To identify the genetic loci or candidate genes for flowering time regulation infor improvement of pre-mature bolting resistance of. 【Method】In this study, 116germplasm accessions were selected to evaluate flowering time variations in greenhouse and open-field, respectively. Total genomic DNA was extracted with 1.2x re-sequenced depth. filtering, mapping with reference by Pooled Mapping was conducted to obtain a genomic high quality SNP set. Then the population structure and linkage disequilibrium (LD) were analyzed using SNP set after condition filtering. In total 2000 SNP points were selected from all SNPs randomly to conduct phylogenetic tree analysis using PhyML software with maximum likelihood method. all high quality SNPs were used to conduct genomic linkage disequilibrium analysis with Haploview software. Genome-wide association study (GWAS) for flowering time variations was then conducted based on software TASSEL, GAPIT and R. According to the position of strong association signals and LD block, the candidate signals for flowering time were identified. Eventually, flowering time candidate genes inwere predicted by gene colinearity relationship betweenand, and gene function annotation.【Result】The 116accessions showed extensive variations in flowering time. Significant variation was also observed between greenhouse and open-field environments. The distribution of flowering time under open-field was partial normal, while the flowering time distributed evenly under greenhouse. Phenotypes of flowering time were significantly correlated between different environments, indicating that genetic effect played a crucial role in regulation of flowering time. A total of 1.03 million SNPs covering genome-wide were generated by biotechnology analysis. Population structure showed that accessions from each sub-group were clustered, and had a close relationship with geographic origin in phylogenetic tree. The linkage disequilibrium decay across genome-wide was 2.3 kb, demonstrating that there were frequent recombinations and variants in 116accessions. A total of 54 strong signals (＞4) were detected using mixed linear model and 87 (＞5) using general linear model under two different environments. Thirty-three strong signals (27 loci under greenhouse, 19 loci under open-field) were saved after considering LD block (2＞0.33), including 13 co-identified SNPs. Based on genome colinearity betweenand, and gene function annotation, 14 candidate genes were predicted. Three candidate genes,,,, were co-identified under greenhouse and open-field environments., a key gene involved in flowering time regulation was also identified under open-field condition.【Conclusion】Correlation analysis of flowering time under different environments indicated that genetic control is a decisive effect on flowering time. A total of 33 significant associated SNPs controlling flowering time were identified by GWAS. By combining LD block, genome colinearity betweenand, and gene annotation, 14 flowering time candidate genes were predicted.

; flowering time; linkage disequilibrium; genome-wide association study; candidate gene

2017-01-20；接受日期：2017-03-15

國家自然科學(xué)基金（31272179）

高寶禎，E-mail：18853812686@163.com。通信作者武劍，Tel：010-82105971；E-mail：wujian@caas.cn