褪黑素對(duì)大鼠胰島瘤細(xì)胞INS-1胰島素和Gαi/o蛋白基因表達(dá)的影響

趙益文，趙佳，龐全海

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褪黑素對(duì)大鼠胰島瘤細(xì)胞INS-1胰島素和Gαi/o蛋白基因表達(dá)的影響

趙益文1，趙佳2，龐全海1

（1山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷030801；2北京大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究所，北京100871）

【目的】研究褪黑素對(duì)大鼠胰島瘤細(xì)胞INS-1中胰島素和Gαi/o蛋白基因表達(dá)的影響，探究褪黑素在mRNA水平對(duì)和1調(diào)節(jié)作用中可能存在的分子機(jī)制。褪黑素(melatonin, MT)是松果腺分泌的一種吲哚類神經(jīng)內(nèi)分泌激素，在機(jī)體內(nèi)可調(diào)節(jié)胰島素的分泌而使其呈現(xiàn)晝夜節(jié)律性分泌，影響葡萄糖晝夜代謝水平的變化進(jìn)而維持機(jī)體血糖的相對(duì)恒定，故對(duì)于褪黑素影響胰島素表達(dá)的研究可能會(huì)對(duì)褪黑素在胰島素晝夜節(jié)律性分泌中的調(diào)控作用提供依據(jù)?！痉椒ā繉龃娴腎NS-1細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)至第三代，INS-1細(xì)胞傳代后,用RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)INS-1細(xì)胞約24—48 h，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)60%—70%時(shí)，使用無(wú)血清無(wú)葡萄糖的RPMI1640洗2次，然后在INS-1細(xì)胞培養(yǎng)外液中分別加入不同濃度（0、10、20、30、50 mmol·L-1）的葡萄糖及100 nmol·L-1褪黑素和不同濃度葡萄糖孵育INS-1細(xì)胞12 h，觀察和統(tǒng)計(jì)INS-1細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。利用EasyPure? RNA Kit 提取INS-1細(xì)胞的總RNA，核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定細(xì)胞總RNA的濃度和純度，其次利用甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)細(xì)胞的總RNA質(zhì)量，TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。利用Primer Premier 5.0引物設(shè)計(jì)軟件，參考GenBank上已登錄的基因序列進(jìn)行1、12、和引物的設(shè)計(jì)。應(yīng)用qRT-PCR法進(jìn)行檢測(cè)處理后的INS-1細(xì)胞1、12、和mRNA水平的變化。【結(jié)果】用含不同濃度葡萄糖培養(yǎng)液孵育INS-1細(xì)胞后，觀察發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)基中葡萄糖濃度含量的增加INS-1細(xì)胞突觸的增長(zhǎng)呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，其中20 mmol·L-1葡萄糖處理組INS-1細(xì)胞突觸的增長(zhǎng)明顯，而20 mmol·L-1葡萄糖和100 nmol·L-1褪黑素處理組INS-1細(xì)胞表面積增大，但突觸增長(zhǎng)卻不明顯；培養(yǎng)基中含不同濃度葡萄糖的處理組中，Insulin1 mRNA水平呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，Gαi1 mRNA水平則呈現(xiàn)先降后升的趨勢(shì)，其中20 mmol·L-1葡萄糖處理組，Insulin1 mRNA水平顯著增加（＜0.05），Gαi1 mRNA水平顯著減少（＜0.05），而Gαi2和Gαo則無(wú)顯著變化（＞0.05），因而Gαi1表現(xiàn)出與Insulin1 mRNA水平呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性而非Gαi2、Gαo與Insulin1 mRNA水平呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性；20 mmol·L-1葡萄糖和褪黑素處理組和20 mmol·L-1葡萄糖處理組相比，20 mmol·L-1葡萄糖和褪黑素處理組的Gαi1 mRNA水平顯著增高（＜0.05），且Insulin1和PKCα mRNA水平顯著減少（＜0.05），PKA mRNA水平則減少不顯著（＞0.05）?！窘Y(jié)論】褪黑素能夠抑制INS-1細(xì)胞1的表達(dá)，減少胰島素的分泌導(dǎo)致INS-1細(xì)胞適應(yīng)性增生。褪黑素與其受體結(jié)合后可促進(jìn)1 mRNA水平增高而抑制的表達(dá)，使得1的表達(dá)受到抑制，胰島素分泌減少，使血糖在夜間得以維持相對(duì)恒定。

褪黑素；INS-1細(xì)胞；葡萄糖；胰島素；Gαi/o

0 引言

【研究意義】褪黑素（melatonin, MT）是由松果腺（pineal gland）分泌的一種吲哚類神經(jīng)內(nèi)分泌激素，由于其具有良好的水溶性和脂溶性，故可以通過(guò)各種膜結(jié)構(gòu)進(jìn)入細(xì)胞器而發(fā)揮作用[1]。MT在機(jī)體內(nèi)可調(diào)節(jié)胰島素（insulin）分泌，使其呈晝夜節(jié)律性分泌進(jìn)而影響葡萄糖晝夜代謝水平的變化，維持機(jī)體血糖的相對(duì)恒定[2-3]，還可在一定程度上改善糖尿病的后遺癥[4]。MT對(duì)胰島素晝夜節(jié)律性分泌作用的發(fā)揮是通過(guò)Gi蛋白調(diào)節(jié)其下游的cAMP[5]、cGMP[6-7]水平而實(shí)現(xiàn)的。Gαi/o蛋白有多種亞型，不同亞型在胰島素分泌的不同方面起著調(diào)節(jié)作用。Gαi2/3可抑制腺苷酸環(huán)化酶（adenylyl cyclase, AC）的活性，Gαo1抑制L型Ca2+通道，Gαi1、Gαi2、Gαi3及 Gαo2還可在胰島素釋放時(shí)發(fā)揮抑制作用[8-9]。研究MT對(duì)INS-1細(xì)胞胰島素和Gαi/o蛋白表達(dá)的影響可從mRNA水平上闡明其作用機(jī)制，對(duì)進(jìn)一步探討胰島素晝夜節(jié)律性分泌具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】VAN CAUTER[10]等研究發(fā)現(xiàn)，夜晚攝入食物后血漿糖濃度相較于清晨會(huì)顯著升高，而胰島素的敏感性及β細(xì)胞對(duì)葡萄糖的響應(yīng)能力則低于清晨，呈現(xiàn)晝夜節(jié)律的特性。然而當(dāng)消除這種亮暗晝夜差異使其一直處于暗環(huán)境下并保持清醒狀態(tài)時(shí)，血漿糖濃度水平在早晚所表現(xiàn)的這種節(jié)律性就會(huì)極大程度的減弱[11]，晝夜節(jié)律系統(tǒng)與葡萄糖代謝極其相關(guān)[12-14]，晝夜節(jié)律性一旦被打亂則有可能會(huì)導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生[15-16]。PESCHKE等[17]和BODEN等[2]研究均表明，在白天血漿中胰島素的濃度升高，夜晚胰島素的濃度降低，而血漿中褪黑素濃度的變化則與胰島素相反?；诖?，許多學(xué)者研究了MT對(duì)胰島素分泌的影響。SRINIVASAN等[18-19]研究發(fā)現(xiàn)，MT可抑制胰腺β細(xì)胞胰島素的分泌，提高胰島素的敏感性。BONNEFOND等[20-21]等的研究表明MT受體基因與二型糖尿病密切相關(guān)，可能有利于二型糖尿病的治療。而MT對(duì)胰島素的這種調(diào)節(jié)作用可能是通過(guò)Gαi/o蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn)的[5-7]。然而，也有一些在體以及離體[22-23]的研究表明，MT可促進(jìn)β細(xì)胞胰島素的分泌。【本研究切入點(diǎn)】對(duì)于在mRNA水平上MT調(diào)控1和表達(dá)的作用機(jī)制，目前在國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道，MT在胰島素分泌的晝夜節(jié)律性中的作用也尚不明確?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究通過(guò)在INS-1細(xì)胞培養(yǎng)外液中加入不同濃度的MT，觀察和統(tǒng)計(jì)INS-1細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化及1、12、和表達(dá)的變化，揭示MT調(diào)控胰島素和Gαi/o蛋白基因表達(dá)的作用機(jī)制，為進(jìn)一步探討MT在胰島素分泌的晝夜節(jié)律性中的作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間及地點(diǎn)

本試驗(yàn)于2015年12月至2016年9月在北京大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞分泌與代謝實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)材料

1.2.1 試驗(yàn)試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基（ThermoFisher）；胎牛血清（FBS）（Gibco）；丙酮酸鈉（Sigma）；0.25%胰蛋白酶（Gibco）；β巰基乙醇（Gibco）；褪黑素（Solarbio）；D-(+)-葡萄糖（Sigma）；EasyPure? RNA Kit（TRANSGEN）；HotMaster DNA polymerase（TIANGEN）；TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix （TIANGEN）；其他常用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2.2 試驗(yàn)材料 大鼠胰島瘤細(xì)胞系（INS-1）購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(American type culture collection, ATCC)。將大鼠胰島瘤細(xì)胞INS-1培養(yǎng)于含10%的新生胎牛血清、1%的丙酮酸鈉、1‰ β-巰基乙醇的RPMI 1640培養(yǎng)基中，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 INS-1細(xì)胞培養(yǎng) 將凍存的INS-1細(xì)胞自液氮罐中取出后放入37℃水浴，搖晃使其盡快融化。融化后用移液槍移入無(wú)菌離心管，加10倍體積培養(yǎng)液，混勻，1 000 r/min-1離心8 min，去上清，加少量新鮮培養(yǎng)液，將沉淀細(xì)胞吹打成細(xì)胞懸液，按1×105密度接種于培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)箱孵育24 h使細(xì)胞復(fù)蘇，48 h換液，培養(yǎng)至第4天即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)至第三代即可用其進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.2 INS-1細(xì)胞的刺激試驗(yàn) 將生長(zhǎng)良好的INS-1細(xì)胞進(jìn)行傳代，以1×105/24cm2密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿，約24—48 h后細(xì)胞密度達(dá)60%—70%，使用無(wú)血清無(wú)葡萄糖的RPMI1640洗兩次：

（1）換用無(wú)血清含不同濃度葡萄糖（0、10、20、30、50 mmol·L-1）的RPMI1640刺激12 h，提取總RNA；

（2）換用無(wú)血清含100 nmol·L-1褪黑素[5]及不同濃度葡萄糖（0、10、20、30、50 mmol·L-1）的RPMI1640刺激12 h，提取總RNA。

1.3.3 cDNA合成 按照 EasyPure? RNA Kit試劑盒操作說(shuō)明提取總RNA，核酸蛋白測(cè)定儀ND-1000（Thermo）測(cè)定總RNA的濃度和純度。0.9%—1.2%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA質(zhì)量。利用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒合成cDNA，采用20 μL反應(yīng)體系：Total RNA 1 μL，Anchored Oligo(dT)18Primer 1 μL，2×TS Reaction Mix 10 μL，TS Enzyme Mix1 μL，gDNA Remover1μL，RNase-free Water 6 μL；反應(yīng)條件：42℃ 30 min，85℃ 5 min；反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可于-20℃長(zhǎng)期保存。

1.3.4 引物設(shè)計(jì)與合成 利用Primer Premier 5.0引物設(shè)計(jì)軟件，參考GenBank上已登錄的1、2、、1、、和序列，設(shè)計(jì)7對(duì)特異性引物，由北京華大科技有限公司合成（表1）。

1.3.5 qRT-PCR 利用HotMaster DNA polymerase進(jìn)行反應(yīng)，每個(gè)樣本設(shè)3次重復(fù)，另加3個(gè)無(wú)模板陰性對(duì)照。25 μL反應(yīng)體系：ddH2O 18.25 μL，10×HotMaster Taq Buffer 2.5 μL，dNTP（2.5 mmol?L-1）1 μL，5×SYBR 1 μL，正反向引物（10 μmol?L-1）各0.5 μL，HotMaster DNA polymerase 0.25 μL，cDNA模板1.0 μL。反應(yīng)條件：95℃ 10 s；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 20 s，95℃ 15 s，溶解曲線；4℃ forever。根據(jù)熒光曲線的CT值計(jì)算定量結(jié)果。

1.4 圖像分析與數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2013進(jìn)行基本統(tǒng)計(jì)分析，采用GraphPad Prism 6軟件進(jìn)行圖形繪制，結(jié)果均用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Means±SD）”表示，全部數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 褪黑素及葡萄糖對(duì)INS-1細(xì)胞形態(tài)學(xué)影響

將INS-1細(xì)胞分為5組，每組用不同濃度葡萄糖（0、10、20、30、50 mmol·L-1）的培養(yǎng)液進(jìn)行孵育，12 h后倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)隨著葡萄糖濃度的增加，INS-1細(xì)胞表面積沒有明顯變化，但細(xì)胞突觸的增長(zhǎng)呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，表現(xiàn)為貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)特征（圖1-A-E）。此外，在用不同濃度葡萄糖處理的基礎(chǔ)上加入100 nmol·L-1MT處理細(xì)胞12 h，分別對(duì)比加入MT前后INS-1細(xì)胞的變化，可見在20 mmol·L-1葡萄糖處理組細(xì)胞突觸增長(zhǎng)最為明顯，而加入MT后細(xì)胞突觸增長(zhǎng)不明顯，但細(xì)胞表面積明顯增大（圖1-C、H、K）。其他葡萄糖濃度與MT處理組細(xì)胞形態(tài)則沒有明顯變化（圖1-A-K）。

2.21抑制INS-1細(xì)胞1的表達(dá)

為了篩選出與1表達(dá)相關(guān)的Gαi/o蛋白，將INS-1細(xì)胞分別用0、10、20、30、50 mmol·L-1葡萄糖和MT處理后，檢測(cè)了12、及1基因的表達(dá)水平（圖2-A-F）。如圖2所示，1的表達(dá)水平在不同濃度葡萄糖處理組表現(xiàn)為先升后降的趨勢(shì)，其中在20 mmol·L-1葡萄糖處理組表達(dá)顯著升高（＜0.05），而加入MT處理后1在各濃度葡萄糖處理組的表達(dá)水平均無(wú)顯著差異（＞0.05）。1的表達(dá)水平在不同濃度葡萄糖處理組表現(xiàn)為先降后升的趨勢(shì)，其中在20 mmol·L-1葡萄糖處理組表達(dá)顯著降低（＜0.05），而加入MT處理后1在各濃度葡萄糖處理組的表達(dá)水平亦均無(wú)顯著差異（＞0.05）（圖2-A、D）。2在10 mmol·L-1葡萄糖處理組表達(dá)水平顯著降低（＜0.05），加入MT處理后2在10 mmol·L-1葡萄糖處理組表達(dá)水平降低極顯著（＜0.01）（圖2-B、E）。的表達(dá)水平在MT處理前后均無(wú)顯著差異（＞0.05）（圖2-C、F）。此外，分別統(tǒng)計(jì)對(duì)比了在MT處理前和處理后12、及1在葡萄糖各濃度處理組的表達(dá)水平，20 mmol·L-1葡萄糖處理組1表達(dá)水平在MT處理后較處理前顯著增加（＜0.05）（圖2-G），1表達(dá)水平在MT處理后較處理前顯著減少（＜0.05）（圖2-I），其他組在MT處理前后無(wú)顯著差異（＞0.05）（圖2-G-J）。

2.3 褪黑素抑制INS-1細(xì)胞1的表達(dá)

為了進(jìn)一步探究MT與1間的相互作用關(guān)系，筆者分別檢測(cè)了20 mmol·L-1葡萄糖處理INS-1細(xì)胞及20 mmol·L-1葡萄糖和MT同時(shí)處理INS-1細(xì)胞時(shí)1的表達(dá)水平并將兩者進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果顯示，20 mmol·L-1葡萄糖處理INS-1細(xì)胞時(shí)，1表達(dá)水平顯著降低（＜0.05），加入MT處理INS-1細(xì)胞時(shí)，1表達(dá)水平無(wú)顯著差異（＞0.05），但MT處理組1表達(dá)水平顯著高于只有20 mmol·L-1葡萄糖處理組（＜0.05）（圖3-A）。此外為了篩選MT抑制1表達(dá)相關(guān)的蛋白激酶，分別檢測(cè)了20 mmol·L-1葡萄糖處理組及20 mmol·L-1葡萄糖和MT處理組1、的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，20 mmol·L-1葡萄糖和MT處理組1和表達(dá)水平顯著降低（＜0.05），表達(dá)水平則無(wú)顯著差異（＞0.05）（圖3-B）。

表1 基因引物序列

3 討論

3.1 褪黑素抑制INS-1細(xì)胞增殖及1的表達(dá)

褪黑素是松果腺在夜間產(chǎn)生的一種胺類激素，光的刺激會(huì)抑制其分泌，并且MT作為晝夜節(jié)律性的周期信號(hào)，對(duì)機(jī)體的晝夜節(jié)律性的周期調(diào)節(jié)極其重要[24]。近年來(lái)許多研究均表明，MT對(duì)β細(xì)胞胰島素分泌的晝夜節(jié)律具有調(diào)節(jié)作用[5-7]，并可抑制β細(xì)胞胰島素的分泌[5,18-19,25]，但在mRNA水平上MT對(duì)胰島素表達(dá)的影響卻未見有報(bào)道。本試驗(yàn)中用不同濃度葡萄糖（0、10、20、30、50 mmol·L-1）的培養(yǎng)液孵育INS-1細(xì)胞，隨著葡萄糖濃度的增加INS-1細(xì)胞突觸的增長(zhǎng)呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，與ZHANG等[26]報(bào)道的高濃度葡萄糖抑制INS-1細(xì)胞增長(zhǎng)低濃度葡萄糖促進(jìn)INS-1細(xì)胞增長(zhǎng)相一致，表現(xiàn)為貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)特征（圖1-A-E），且20 mmol·L-1葡萄糖處理組細(xì)胞突觸增長(zhǎng)最為明顯。然而，加入100 nmol·L-1MT處理INS-1細(xì)胞后，20 mmol·L-1葡萄糖及MT處理組突觸增長(zhǎng)不明顯，細(xì)胞表面積卻明顯增大（圖1-C、H），結(jié)合兩組1的表達(dá)水平，20 mmol·L-1葡萄糖處理組1表達(dá)顯著增加，20 mmol·L-1葡萄糖及MT處理組1表達(dá)增加不顯著，且相較于20 mmol·L-1葡萄糖處理組1表達(dá)顯著降低（圖2），由此可知，20 mmol·L-1葡萄糖可促進(jìn)INS-1細(xì)胞胰島素的分泌并可促進(jìn)細(xì)胞的增殖，當(dāng)加入MT后，MT抑制了1的表達(dá)，胰島素分泌減少[27]，葡萄糖刺激INS-1細(xì)胞導(dǎo)致其適應(yīng)性增生[28]。如上分析說(shuō)明，MT能夠抑制INS-1細(xì)胞的增殖，并可抑制INS-1細(xì)胞1的表達(dá)，減少胰島素的分泌，導(dǎo)致INS-1細(xì)胞的增生。

3.2 褪黑素通過(guò)1抑制INS-1細(xì)胞1的表達(dá)

有研究顯示， MT對(duì)胰島素晝夜節(jié)律性分泌作用的發(fā)揮是通過(guò)Gi蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn)的[5-7]，但Gαi/o抑制型蛋白有多種亞型，MT是通過(guò)何種Gi蛋白抑制胰島素分泌的目前尚未有明確報(bào)道。為了篩選出與1表達(dá)相關(guān)的Gαi/o蛋白，本試驗(yàn)首先檢測(cè)了1及Gαi/o蛋白各亞型12的表達(dá)水平，統(tǒng)計(jì)比較了1與Gαi/o抑制型蛋白各基因表達(dá)水平的相關(guān)性。試驗(yàn)結(jié)果顯示，的表達(dá)水平在20 mmol·L-1葡萄糖處理組及20 mmol·L-1葡萄糖和MT處理組均無(wú)顯著差異（圖2-C、F），表明與MT抑制1的表達(dá)無(wú)關(guān)。2雖然在10 mmol·L-1葡萄糖處理組及10 mmol·L-1葡萄糖和MT處理組表達(dá)水平均有顯著性降低，但10 mmol·L-1葡萄糖處理組及10 mmol·L-1葡萄糖和MT處理組1表達(dá)水平卻無(wú)顯著性差異（圖2-B、E），亦表明2與MT抑制1的表達(dá)無(wú)關(guān)。試驗(yàn)中1的表達(dá)水平在不同濃度葡萄糖處理組表現(xiàn)為先降后升的趨勢(shì)，1的表達(dá)水平表現(xiàn)為先升后降的趨勢(shì)，其中在20 mmol·L-1葡萄糖處理組1的表達(dá)顯著升高，1表達(dá)顯著降低，而加入MT處理后，1和1在各濃度葡萄糖處理組的表達(dá)水平均無(wú)顯著差異（圖2-A、D），而且1表達(dá)水平在MT處理后較處理前顯著增加，1表達(dá)水平則顯著減少，表明MT對(duì)1具有上調(diào)作用對(duì)1具有下調(diào)作用，由此表明，1與MT抑制1的表達(dá)不僅具有相關(guān)性且可抑制1的表達(dá)，而這種抑制作用可能是由于葡萄糖刺激INS-1細(xì)胞胰島素分泌時(shí)，1可在一定程度上抑制細(xì)胞外液胰島素濃度的上升以使其不至于升高過(guò)猛[29]。

A—C. 葡萄糖處理Insulin1和Gαi1 (A), Gαi2 (B), Gαo (C)表達(dá)水平；D—F. 葡萄糖和100 nmol·L-1褪黑素處理Insulin1和Gαi1(D), Gαi2 (E), Gαo (F)表達(dá)水平；G-J.褪黑素處理前后Gαi1(G), Gαi2 (H), Insulin1(I), Gαo (J)表達(dá)水平對(duì)比；ns表示無(wú)顯著差異；*表示差異顯著（P＜0.05）；**表示差異極顯著（P＜0.01）。下同

A. 褪黑素促進(jìn)Gαi1的表達(dá)；B. 褪黑素處理Insulin1、PKA、PKCα表達(dá)水平

以上試驗(yàn)證明了1可抑制1的表達(dá)，而MT亦可抑制1的表達(dá)，為了進(jìn)一步驗(yàn)證MT是否通過(guò)1而抑制1的表達(dá)，本試驗(yàn)檢測(cè)了20 mmol·L-1葡萄糖處理組及20 mmol·L-1葡萄糖和MT處理組INS-1細(xì)胞1表達(dá)水平的變化并將兩者進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果顯示，20 mmol·L-1葡萄糖處理組，1表達(dá)水平顯著降低，20 mmol·L-1葡萄糖和MT處理組，1表達(dá)水平無(wú)顯著差異，而20 mmol·L-1葡萄糖和MT處理組1的表達(dá)水平則顯著高于20 mmol·L-1葡萄糖處理組（圖3-A），由此表明，MT可促進(jìn)1的表達(dá)。

以上分析說(shuō)明，1抑制INS-1細(xì)胞1的表達(dá)，MT促進(jìn)INS-1細(xì)胞1的表達(dá)，而MT可抑制INS-1細(xì)胞1的表達(dá)，綜上可知，MT可通過(guò)促進(jìn)抑制型G蛋白1的表達(dá)從而抑制INS-1細(xì)胞1的表達(dá)，抑制胰島素的分泌。

3.31通過(guò)抑制INS-1細(xì)胞1的表達(dá)

Gi蛋白可調(diào)節(jié)MT對(duì)胰島素晝夜節(jié)律性的分泌，而這種調(diào)節(jié)作用的發(fā)揮是通過(guò)其下游cAMP[5]、cGMP[6-7]、PKA和PKC[30]等實(shí)現(xiàn)的。為了篩選MT抑制1表達(dá)相關(guān)的蛋白激酶，本試驗(yàn)檢測(cè)了20 mmol·L-1葡萄糖處理組及20 mmol·L-1葡萄糖和MT處理組1、的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，20 mmol·L-1葡萄糖和MT處理組1和表達(dá)水平顯著降低，表達(dá)水平則無(wú)顯著差異（圖3-B），表明表達(dá)水平的降低可抑制1的表達(dá)。此外，20 mmol·L-1葡萄糖和MT處理組1、和1的表達(dá)水平與20 mmol·L-1葡萄糖處理組相比，1表達(dá)水平顯著增高，和1表達(dá)水平顯著降低（圖3），表明1表達(dá)水平的增高可抑制的表達(dá)。如上分析說(shuō)明，加入MT處理INS-1細(xì)胞后，1表達(dá)水平增高，抑制了的表達(dá)，進(jìn)而抑制了1的表達(dá)，由此表明1是通過(guò)來(lái)抑制INS-1細(xì)胞1表達(dá)的。

3.4 褪黑素抑制INS-1細(xì)胞1表達(dá)模式圖

MT在機(jī)體內(nèi)可調(diào)節(jié)胰島素的分泌，使其呈晝夜節(jié)律性分泌進(jìn)而影響葡萄糖晝夜代謝水平的變化，維持機(jī)體血糖的相對(duì)恒定[2-3]。夜晚胰腺β細(xì)胞分泌的胰島素對(duì)MT非常敏感，胰島素或MT稍有變動(dòng)就有可能發(fā)生糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)[27]。有研究報(bào)道，葡萄糖在體內(nèi)代謝后通過(guò)cAMP信號(hào)通路激活PKA蛋白激酶，促進(jìn)胰島素的分泌，而MT可作用于Gi蛋白抑制腺苷酸環(huán)化酶（Adenylyl cyclase）的活性進(jìn)而抑制cAMP的產(chǎn)生，從而抑制胰島素的分泌[17,30]。本試驗(yàn)中首先檢測(cè)了MT確實(shí)對(duì)葡萄糖誘導(dǎo)的1表達(dá)具有抑制作用（圖4），與前人報(bào)道相符[18-19,30]。其次，本試驗(yàn)對(duì)與1表達(dá)抑制相關(guān)的抑制型Gαi/o蛋白進(jìn)行了篩選，結(jié)果表明1表達(dá)的抑制與1的表達(dá)相關(guān)而與和2的表達(dá)無(wú)關(guān)（圖2-A、D），且1可抑制1的表達(dá)。再次，本試驗(yàn)檢測(cè)并對(duì)比了葡萄糖組及葡萄糖和MT組INS-1細(xì)胞1表達(dá)水平，結(jié)果表明MT可促進(jìn)INS-1細(xì)胞1的表達(dá)（圖3-A）。本試驗(yàn)檢測(cè)了和蛋白激酶與1和1間的相互關(guān)系，發(fā)現(xiàn)1可抑制的表達(dá)進(jìn)而抑制1的表達(dá)（圖3-B）。以上分析表明，MT與MT受體結(jié)合后會(huì)促進(jìn)與之偶聯(lián)的1蛋白的表達(dá)，1的表達(dá)水平增高會(huì)抑制的表達(dá)，進(jìn)而使得1的表達(dá)受到抑制，胰島素分泌減少，使血糖在夜間得以維持相對(duì)恒定。

Melatonin：褪黑素；MT1-R：褪黑素受體1；MT2-R：褪黑素受體2；Adenylyl cyclase：腺苷酸環(huán)化酶；cAMP：環(huán)化腺核苷一磷酸；PKA：蛋白激酶A；PKCα：蛋白激酶Cα；Glucose：葡萄糖；Metabolism：代謝

4 結(jié)論

褪黑素能夠抑制INS-1細(xì)胞1的表達(dá)，減少胰島素的分泌，進(jìn)而導(dǎo)致INS-1細(xì)胞適應(yīng)性增生。夜間松果腺分泌的褪黑素與其受體結(jié)合后，可促進(jìn)褪黑素受體偶聯(lián)的抑制型Gαi1蛋白的表達(dá)，1的表達(dá)水平增高會(huì)抑制的表達(dá)，進(jìn)而使得1的表達(dá)受到抑制，胰島素分泌減少，使血糖在夜間得以維持相對(duì)恒定。

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（責(zé)任編輯 林鑒非）

Effect of Melatonin onandExpression in Rat Insulinoma Cell Line

ZHAO Yiwen1, ZHAO Jia2, PANG Quanhai1

(1College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi;2Institute of Molecular Medicine, Peking University, Beijing 100871)

【Objective】To demonstrate the role of melatonin in the circadian secretion of insulin, the effect of melatonin onandexpression in rat insulinoma cell line (INS-1) and molecular mechanism were studied. As melatonin can regulate insulin secretion in a circadian manner, maintaining a homeostasis of blood glucose by regulating diurnal glucose metabolism, thus study on the effect of melatonin on expression of insulin may provide a basis for regulation of melatonin in circadian secretion of insulin.【Method】The cryopreserved INS-1 cells were passaged for at least three generations. After the passage of cells, INS-1 cells were cultured in RPMI1640 medium for about 24-48 h. When the cell confluency reached 60%-70%, washed with RPMI1640 without serum and glucose for two times. INS-1 cells were cultured in media supplemented with different concentrations of glucose(0, 10, 20, 30, and 50 mmol·L-1) and 100 nmol·L-1melatonin for 12 h treatment, then observation of morphological changes of INS-1 cells and statistical analysis were performed. The total RNA extracted from INS-1 cells by Easypure RNA kit, measuring the cells total RNA concentration and purity, then the quality of total RNA was measured by formaldehyde denaturing agarose gel electrophoresis. TranScript One-step Removal and Synthesis Supermix were used to synthesize cDNA by reverse transcription. Primer Premier 5.0 primer design software, reference gene sequence of GenBank were used to design primers. qRT-PCR was used to detect the changes of1,1,2,,andinmRNA level.【Result】After incubation of INS-1 cells with different concentrations of glucose, it was observed that the growth of cell synapse first increased and then decreased along with the increase of the concentration of glucose in the culture medium. In the 20 mmol·L-1glucose treatment group, the synaptic growth of INS-1 cells was increased significantly; in the 20 mmol·L-1glucose and melatonin co-treatment group, the area of INS-1 cells was increased, but the synaptic growth was not obvious. In the glucose treatment group, the mRNA level of1 showed a trend of increase and then reduction, especially was increased at 20 mmol·L-1(＜0.05). The mRNA level of1 showed a trend of reduction and then increase, especially was reduced at 20 mmol·L-1(＜0.05). The mRNA level of2 andwas not significantly reduced (＞0.05). Thus,1 but not2 andshowed a negative correlation with1 mRNA level. Compared with 20 mmol·L-1glucose treatment group, the mRNA level of1 was significantly increased (＜0.05) at 20 mmol·L-1glucose and melatonin co-treatment group, the mRNA level of1 andα was significantly reduced (＜0.05), whereas the mRNA level ofwas not significantly reduced (＞0.05).【Conclusion】Melatonin inhibits the expression of1 in INS-1 cells and reduces insulin secretion resulting in the adaptive hyperplasia of INS-1 cells. The binding of melatonin to its receptor can promote the increase of1 mRNA levels and inhibit the expression of, which leads to the inhibited expression of1 and decreased insulin secretion, so that blood glucose remains homeostatic during the night.

melatonin; INS-1 cells; glucose; insulin; Gαi/o

2017-03-21；接受日期：2017-06-28

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（30972223，31272628）

趙益文，E-mail:yiwenz1103@163.com