ToMV外殼蛋白互作IP-L蛋白的亞細胞定位及表達分析

彭浩然，蒲運丹，張永至，薛楊，武改霞，青玲，孫現(xiàn)超

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ToMV外殼蛋白互作IP-L蛋白的亞細胞定位及表達分析

彭浩然，蒲運丹，張永至，薛楊，武改霞，青玲，孫現(xiàn)超

（西南大學植物保護學院，重慶 400716）

【目的】前期研究顯示ToMV外殼蛋白（coat protein，CP）可以與煙草蛋白L（CP-interacting protein-L，IP-L）相互作用，本研究旨在明確ToMV CP與IP-L的共定位情況、IP-L的組織表達和在ToMV侵染條件下煙草及其編碼蛋白的表達變化情況，為進一步明確IP-L的功能提供依據(jù)?！痉椒ā客ㄟ^雙酶切法從筆者實驗室構(gòu)建保存的pGBKT7-CP和pGADT7-IP-L重組載體上切下ToMV CP和IP-L目的片段，構(gòu)建融合蛋白植物表達載體pPZP-IP-L-N-EGFP和pPZP-CP-N-DsRed及原核表達載體pEGX-IP-L。通過熱激法將融合表達的植物表達載體轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌EHA105，在煙草表皮細胞瞬時表達IP-L-N-EGFP和CP-N-DsRed，共聚焦熒光顯微鏡下觀察IP-L和ToMV CP共定位情況。用實時熒光定量RT-PCR(qRT-PCR)分析在本氏煙各組織部位的表達量。原核表達載體pEGX-IP-L，轉(zhuǎn)化原核表達菌BL21，優(yōu)化GST-IP-L可溶性表達條件后大量表達該蛋白，用GST親和層析法純化獲得可溶性GST-IP-L蛋白，免疫家兔制備多克隆抗體。ELISA測定抗體效價，Western印跡法明確抗體的特異性后，利用該抗體分析ToMV侵染條件下番茄IP-L蛋白表達情況，用qRT-PCR檢測表達變化與蛋白水平是否一致?！窘Y(jié)果】ToMV CP在本氏煙葉片表皮細胞的細胞質(zhì)和細胞質(zhì)膜以及葉綠體均有分布，而IP-L只在本氏煙葉片表皮細胞質(zhì)膜表達，二者共定位在細胞質(zhì)膜。在本氏煙葉片中特異高表達，顯著高于莖、根和花中的相對表達量。在溫度為30℃，IPTG誘導濃度為0.3 mmol·L-1條件下表達出大小為42.8 kD的可溶性GST-IP-L融合蛋白。純化獲得約4.2 mg可溶性蛋白，免疫家兔制備了效價為1/6400的多克隆抗體。Western印跡結(jié)果表明，該抗體可以與IP-L的原核產(chǎn)物特異性結(jié)合。在ToMV侵染本氏煙1、3、7 d后，Western印跡分析表明IP-L在葉片內(nèi)表達量隨接種時間呈明顯上調(diào)趨勢。qRT-PCR檢測結(jié)果與Western印跡結(jié)果一致，顯示在ToMV侵染本氏煙第7天后的葉片內(nèi)表達量是健康對照的3倍多，差異達到顯著水平?！窘Y(jié)論】ToMV CP和IP-L共定位于本氏煙表皮細胞質(zhì)膜，在本氏煙葉片內(nèi)特異高表達。制備的IP-L多克隆抗體具有良好的免疫反應活性，可以用于IP-L表達量檢測；ToMV侵染煙草可誘導及其編碼蛋白表達量顯著上調(diào)。

IP-L；亞細胞定位；表達；分析；番茄花葉病毒

0 引言

【研究意義】植物病毒作為一種專性寄生物，其生活史的完成必須依賴寄主。它侵染寄主后，在寄主細胞中進行病毒的脫殼、病毒基因組的復制及在寄主細胞間系統(tǒng)運動過程中，都有寄主成分參與其中[1-3]。因此，明確與病毒編碼蛋白互作的寄主蛋白在寄主細胞中的定位、組織表達情況，并分析其在病毒侵染條件下的表達變化，對解析互作蛋白的功能及二者互作的生物學意義具有重要價值?！厩叭搜芯窟M展】番茄花葉病毒（，ToMV）是煙草花葉病毒屬（）的重要成員。其寄主包括茄科、十字花科、禾本科、藜科、豆科等許多植物，番茄也作為主要寄主受其危害[4]。ToMV引起的病毒病1909年在美國首次被報道，并已廣泛分布于世界各國的番茄生產(chǎn)區(qū)，在中國各地番茄生產(chǎn)區(qū)也嚴重發(fā)生[5]。ToMV與同屬的煙草花葉病毒（，TMV）血清學關(guān)系較近。ToMV曾被認為是TMV的一個株系，但研究發(fā)現(xiàn)二者在寄主范圍和基因組序列方面存在一定的差異，自1971年將其作為單一病毒從TMV中分離出來。1996年，周雪平等[4]首次對中國番茄上發(fā)生的ToMV進行了系統(tǒng)的研究報道。至今，國內(nèi)外研究者對ToMV生物學和分子生物學特性方面做了大量的研究，為防治該病毒引起的病害積累了豐富的資料[6-10]。在ToMV與寄主相互作用研究方面，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)煙草的RIO激酶、轉(zhuǎn)錄輔助活化因子MBF1和KELP與ToMV運動蛋白直接相互作用[11-13]。FUJISAKI等[14]在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了一個與ToMV RNA結(jié)合的BTR1蛋白，該蛋白對病毒的復制有一定的調(diào)控作用。IP-L（interaction protein L）是從煙草cDNA文庫中篩選出的與ToMV CP互作的寄主蛋白，其序列與普通煙中的一個未知功能的激發(fā)子應答蛋白（AB040409）同源性達到100%[15]。前期用酵母雙雜交和GST-Pull down技術(shù)對ToMV CP和IP-L相互作用的位點分析發(fā)現(xiàn)，二者依靠各自的-螺旋區(qū)相互作用，IP-L N端的-螺旋區(qū)域（1—20位氨基酸）為二者相互作用所必需，并且明確ToMV CP中兩個-螺旋區(qū)域（16—31位氨基酸、138—149位氨基酸）參與二者的相互作用，進一步的定點突變分析表明IPL中L9A、H12G和ToMV CP中N26A、T29A、N30A、N143A和T144A等突變會導致二者失去相互作用能力[16]?！颈狙芯壳腥朦c】筆者課題組一直致力于植物病毒與寄主互作研究，前期已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并證實ToMV CP可以與普通煙草鐵氧還蛋白I（ferredoxin I，F(xiàn)dn-I）在體內(nèi)外互作[17]，并且用制備的Fdn-I證實ToMV侵染可導致普通煙中的Fdn-I蛋白表達明顯下降[18]。IP-L作為與ToMV CP互作的寄主蛋白，其功能尚不明確。ToMV CP與IP-L互助定位在細胞何處？其表達是否有組織特異性？在病毒侵染條件下IP-L及其編碼蛋白其表達量變化如何？這些問題的回答將有助于對其功能的解析?！緮M解決的關(guān)鍵問題】分別將DsRed和GFP融合在ToMV CP與IP-L的C端，表達分析二者共定位情況；分析在本氏煙各組織的表達情況；構(gòu)建番茄IP-L原核表達載體，表達并純化制備可溶性蛋白，免疫家兔獲得IP-L多克隆抗體，并用抗體分析ToMV侵染番茄對IP-L蛋白表達的影響，用實時熒光定量RT-PCR（qRT-PCR）檢測表達變化與蛋白水平是否一致。

1 材料與方法

試驗于2012—2016年在西南大學植物保護學院植物病毒研究室完成。

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 原核表達菌株BL21和谷胱甘肽疏基轉(zhuǎn)移酶（GST）融合表達載體pEGX-6p-1由筆者實驗室長期保存；植物表達載體pPZP-RCS1和中間載體pSAT1-N-EGFP、pSAT1-N-DsRed由美國紐約州立大學石溪分校Vitaly教授饋贈；pGBKT7-CP和pGADT7-IP-L由筆者實驗室構(gòu)建保存；供試本氏煙（）在溫室育苗盆中播種，培養(yǎng)至4—6葉期備用。

1.1.2 試劑和引物 DNA純化回收試劑盒和質(zhì)粒取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、高保真ExTaqTMDNA聚合酶、T4 DNA連接酶購自大連TaKaRa公司；T載體試劑盒和總RNA提取試劑盒購自普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司；實時熒光試劑盒使用 QuantiNovaTMSYBR Green PCR Kit（QLAGEN，GER）；限制性內(nèi)切酶購自NEB公司；ToMV CP抗體由筆者實驗室制備保存。

1.2 方法

1.2.1 熒光蛋白融合表達載體及原核表達載體的構(gòu)建 用HⅠ和Ⅰ分別從pGBKT7-CP和pGADT7-IP-L載體上切下CP和IP-L，試劑盒純化回收目的片段后，IP-L分別連接至相同雙酶切的GFP融合表達載體中間載體pSAT1-N-EGFP和原核表達載體pEGX-6p-1上，CP連接至相同雙酶切的pSAT1- N-DsRed，所有連接產(chǎn)物經(jīng)大腸桿菌BL21轉(zhuǎn)化挑取陽性單克隆由華大基因公司測序，成功的重組質(zhì)粒分別命名為pSAT1-IP-L-N-EGFP、pSAT1-CP-N-DsRed和pEGX-IP-L。自pSAT1-IP-L-N-EGFP和pSAT1-CP- N-DsRed上，用I酶分別切下表達盒IP-L-N-EGFP和CP-N-DsRed，連接到經(jīng)相同酶切的pPZP-RCS1載體上，在含有500 mg·L-1壯觀霉素的LB平板培養(yǎng)，PCR鑒定篩選陽性克隆，并再次酶切鑒定，陽性克隆命名為pPZP-IP-L-N-EGFP和pPZP-CP-N-DsRed。

1.2.2 ToMV CP與IP-L在本氏煙表皮細胞的共定位分析 參考劉兆明等[19]方法將pPZP-IP-L-N-EGFP和pPZP-CP-N-DsRed以熱擊法分別轉(zhuǎn)化到根癌土壤桿菌EHA105感受態(tài)細胞中。瞬時表達方法參 照Voinnet等[20]的方法：挑選單菌落接種于含500 mg·L-1壯觀霉素的YEP液體培養(yǎng)基中搖菌12—16 h，緩沖液（10 mmol·L-1MgCl2；10 mmol·L-1MES以及0.1 mmol·L-1AS）重懸菌體至OD600為1.0，室溫靜置3 h。選取培養(yǎng)至4—6葉期健康的本氏煙幼苗，用滅菌注射器注射上述根癌土壤桿菌懸浮液。接種后的本氏煙置于25℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。72 h后，取下注射的本氏煙葉片，制作臨時玻片，在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察葉片注射孔附近IP-L-GFP定位情況。

1.2.3的組織表達分析 采用real-time PCR分析本氏煙不同組織的表達情況，用Eastep?Super總RNA提取試劑盒提取等量的開花期本氏煙根、莖、葉和花的總RNA，根據(jù)Prime-ScriptTMRT Reagent試劑盒方法合成cDNA，反應引物見表1。應用Bio-Rad CFX實時定量PCR儀器，每個樣品設3次重復，Ct值取平均值。按照QuantiNovaTMSYBR Green PCR Kit使用說明進行，real-time PCR體系：2×Green PCR Master Mix 10 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O補齊至20 μL。反應條件：95℃3 min；95℃10 s，57℃ 30 s，72℃ 40 s，40個循環(huán)。利用2-△△CT法計算各個時間點對的相對表達量。

表1 本研究所用引物序列

1.2.4 GST-IP-L融合蛋白的大量表達及純化 將上述陽性克隆接種于含100 μg·mL-1Ampicilin的2×YT液體培養(yǎng)基中，37℃搖床振蕩過夜培養(yǎng)，4 000 r/min，4℃離心10 min收集菌體，用2×YT液體培養(yǎng)基重懸后，接種于5 L含100 μg·mL-1Ampicilin的2×YT液體培養(yǎng)基中，在30℃，0.3 mmol·L-1IPTG濃度下誘導3 h后離心收集菌體，用PBS緩沖液重懸菌體，超聲破碎菌體細胞壁，用TritonX-100調(diào)整終濃度至1%?；靹蛞罕?0 min后15 000 r/min，4℃離心30 min，上清液室溫下自然通過親和層析柱，裂解緩沖液洗柱后再以洗脫緩沖液（100 mmol·L-1Tris；6.15 g·L-1谷胱甘肽及2 mmol·L-1PMSF，pH 8.0）洗脫，Bradford法檢測洗脫液中的蛋白濃度，取純化產(chǎn)物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。

1.2.5 IP-L多克隆抗體的制備、效價測定和特異性檢測 在大白兔雙肩周圍皮下和后大腿肌肉處，以多點注射的方式用純化的GST-IP-L融合蛋白免疫大白兔，總共免疫6次，每次間隔7 d，每次免疫劑量約0.7 mg融合蛋白。最后一次注射7 d后一次性動脈采血，制備抗體，酶聯(lián)免疫吸附實驗測定其效價。分別將含pEGX-IP-L陽性單克隆和含pEGX6P-1載體的菌株表達總蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，用封閉液室溫封閉過夜。然后以1﹕500的融合蛋白抗體作為一抗孵育2 h，經(jīng)TBST（150 mmol·L-1NaCl；20 mmol·L-1Tris-HCl，pH 7.5；0.05% Tween 20）洗滌3次，辣根過氧化物酶標記的Anti-Rabbit（1/5 000）作為二抗常溫孵育1 h，用PBST于脫色搖床上洗膜10 min，共3次。避光條件下，ECL（Amersham biosciences）顯色，觀察記錄結(jié)果。

1.2.6 ToMV侵染對IP-L及其編碼蛋白在葉片內(nèi)表達影響分析 汁液摩擦接種ToMV于6葉期的本氏煙葉片。在接種后第1、3、7天，在接種葉位分別取250 mg的健康和ToMV接種本氏煙葉片兩份樣品，其中一份樣品在0.4 mL蛋白提取緩沖液（250 mmol·L-1蔗糖；220 mmol·L-1Tris-HCl，pH 7.4；1 mmol·L-1MgCl2；50 mmol·L-1KCl；2 mmol·L-1PMSF；10 mmol·L-1-巰基乙醇）中研磨，4℃離心收集上清液，Bradford法[21]檢測蛋白濃度，取等量總蛋白樣品在兩塊獨立的聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳，然后分別轉(zhuǎn)印硝酸纖維素膜，按照1.2.5中方法進行蛋白免疫印跡分析。以ToMV CP抗體為一抗檢測ToMV侵染情況對比以GST-IP-L融合蛋白抗體作為一抗檢測IP-L表達情況，試驗重復3次。另一份樣品按照1.2.3的方法進行表達的定量分析。

2 結(jié)果

2.1 ToMV CP與IP-L在本氏煙表皮細胞的共定位情況

ToMV CP與IP-L是在酵母細胞和體外直接相互作用的蛋白，理論上二者在植物細胞中也應該存在共定位情況。為了明確這一推論，分別構(gòu)建了pPZP-IP- L-N-EGFP和pPZP-CP-N-DsRed兩個植物表達載體，二者分別轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌EHA105后，挑取菌落在YEP液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，菌懸液等量混合后，在本氏煙葉片中共表達。共聚焦熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ToMV CP-N-DsRed表達量較高，在多數(shù)細胞中均能看到紅色熒光，且在細胞的細胞質(zhì)中均有分布，在細胞質(zhì)膜亮度較高，葉綠體片層中也有表達，而IP-L-N-EGFP表達量相對較低，僅在少數(shù)細胞中能觀察到綠色熒光，且IP-L-N-EGFP僅分布在細胞質(zhì)膜部位，二者在細胞質(zhì)膜共定位，兩種熒光共同存在（圖1）。

2.2的組織表達

為了明確是否存在組織特異表達，用qRT- PCR方法分析在本氏煙根、莖、葉和花組織中的表達量。結(jié)果顯示（圖2）在葉中特異高表達，相對表達量達到3.28，顯著高于其在其他組織中的相對表達量（＜0.05）。在根、莖和花中相對表達量極低，雖然在莖中的相對表達量大于根和葉，但是差異不顯著。

圖1 ToMV CP與IP-L在本氏煙表皮細胞的共定位情況

圖2 IP-L在不同本氏煙組織中的表達模式

2.3 IP-L原核表達載體構(gòu)建及誘導表達

回收片段用HⅠ和Ⅰ雙酶切并連接到載體pEGX-6p-1，成功的重組質(zhì)粒命名為pEGX- IP-L。酶切電泳圖及華大基因公司測序結(jié)果表明基因正確構(gòu)建到載體pEGX-6p-1上，形成了GST-IP-L融合基因。將pEGX-IP-L質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6—1.0時，加入終濃度為0.3 mmol·L-1的IPTG 30℃誘導表達。pGEX-6P-1空載體表達的GST蛋白的分子量為26 kD，IP-L蛋白預測的分子量為16.8 kD，融合蛋白GST-IP-L的分子量為42.8 kD。誘導菌體經(jīng)處理后，12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分析顯示目的蛋白所處位置與預測蛋白大小一致，表明成功表達了GST-IP-L融合蛋白（42.8 kD，圖3）。

2.4 GST-IP-L融合蛋白的純化

在30℃，0.3 mmol·L-1IPTG條件下成功誘導表達融合蛋白GST-IP-L，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測后，發(fā)現(xiàn)可溶性融合蛋白的表達量比較高。經(jīng)親和層析純化得到純化的GST-IP-L融合蛋白，且條帶大?。?2.8 kD）與預期結(jié)果相符，純化蛋白條帶下邊出現(xiàn)一個約26 kD大小的蛋白條帶，推測是掉下來的GST標簽蛋白（圖4）。經(jīng)Bradford法[21]檢測，5 L的培養(yǎng)誘導菌液經(jīng)純化可獲得可溶性蛋白約為4.2 mg。

2.5 抗血清的制備、效價測定和特異性檢測

將分離的融合蛋白與福氏不完全佐劑等體積混合，乳化后作為抗原免疫家兔，第5次注射7 d后，測定血清效價為1/1 600，加強免疫1次，7 d后采血制備抗血清。以1/800、1/1 600、1/3 200、1 /6 400、1/12 800、1/25 600、1/51 200、1/102 400的濃度梯度酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測血清效價。檢測結(jié)果顯示待測組顏色濃度由高到低呈現(xiàn)明顯的顏色梯度，陰性對照和底板無顏色反應，最終確定IP-L抗血清的效價為1/6 400。用獲得的抗體檢測分別表達GST-IP-L和GST的菌株BL21總蛋白，蛋白免疫印跡實驗檢測結(jié)果顯示抗體可以特異識別IP-L原核表達產(chǎn)物GST-IP-L融合蛋白和GST蛋白（圖5），表明IP-L抗血清具有良好的免疫反應性。

M：低分子量蛋白marker Low molecular weight marker；1：上樣緩沖液 Loading buffer；2、3：含pEGX-IP-L大腸桿菌BL21表達總蛋白 Total protein expressed by E. coil BL21 containing pEGX-IP-L；4：含pEGX-6p-1對照大腸桿菌BL21表達總蛋白 Total protein expressed by E. coil BL21 containing pEGX-6p-1

M：低分子量蛋白marker Low molecular weight marker；1：空白載體Empty vector group；2：上樣緩沖液Loading buffer；3：純化蛋白Purified fusion protein

M：低分子量蛋白marker Low molecular weight marker；1：表達GST-IP-L的菌株BL21總蛋白Total protein of BL21 expressed GST-IP-L；2：表達GST的菌株BL21總蛋白Total protein of BL21 expressed GST；3：GST-IP-L Western印跡檢測Western blot of GST-IP-L； 4：GST Western印跡檢測Western blot of GST

2.6 ToMV侵染對IP-L在本氏煙葉片內(nèi)表達影響分析

為了探究ToMV侵染后本氏煙體內(nèi)IP-L的變化情況，汁液摩擦接種6葉期的本氏煙葉片，分別在接種后第1、3和7天取樣，分別提取接種葉位的健康本氏煙葉片和ToMV侵染的本氏煙葉片的總蛋白，12% SDS-PAGE電泳檢測等量的總蛋白，轉(zhuǎn)印后分別用ToMV CP抗體和獲得的IP-L抗體Western blot分析ToMV的侵染和IP-L表達情況。結(jié)果顯示，在接種后第1天健康植株葉片沒病毒侵染，在接種葉檢測到微量ToMV，葉片內(nèi)的IP-L表達量與健康對照相比沒有變化。在接種ToMV后的第3天和第7天，接種葉片中明顯檢測到ToMV積累，并且ToMV積累量隨時間增加，同期，葉片內(nèi)IP-L表達量隨著病毒的積累量增加也明顯提高（圖6）。qRT-PCR結(jié)果顯示（圖7）表達量與其編碼蛋白變化基本一致，在接種ToMV后第1天，在處理植株中的表達量低于健康對照，第3天表達量比第1天提高1倍，仍低于健康對照，但沒有明顯差異。在接種ToMV后第7天，表達量明顯上升，達到健康對照的3倍，差異顯著（＜0.05）。

a：接種1、3、7 d后ToMV CP的Western印跡檢測Western blot analysis of ToMV CP 1, 3 and 7 days after inoculation；b：接種1、3、7 d后IP-L的Western印跡檢測Western blot analysis of IP-L 1, 3 and 7 days after inoculation；c：SDS-PAGE的上樣量對照The loading quantity of sample of SDS-PAGE

圖7 實時熒光定量RT-PCR分析ToMV侵染本氏煙葉片IP-L表達量

3 討論

CP是病毒粒子的結(jié)構(gòu)亞基，是在病毒侵染過程中最早接觸寄主植物并與寄主因子發(fā)生作用的病毒蛋白[22]，也是的抗原表位所在[23]。除形成外殼保護病毒RNA外，CP還具有其他多種功能。大量的研究證實TMV的CP在病毒侵染寄主導致病毒病癥狀的過程中起重要作用[24-26]。因此，TMV的CP在被侵染細胞的細胞質(zhì)各部位都有分布。本研究用DsRed標記的ToMV CP同樣觀察到紅色熒光在細胞質(zhì)的大量分布。IP-L是煙草內(nèi)能與ToMV CP互作的蛋白，Zhang等[16]對本氏煙葉片的葉綠體及其組分的分級分離后進行SDS-PAGE和Western blot分析，確定IP-L是存在于葉綠體中的類囊體膜上，推測其可能與光合作用有關(guān)。本研究用EGFP標記的IP-L，只在細胞質(zhì)膜上觀察到綠色熒光存在，且在此處與ToMV CP共定位。造成這兩種結(jié)果差異的原因可能是Zhang等根據(jù)預測只分析了葉綠體中IP-L的可能定位，未對整個細胞進行全面分析。由于IP-L在細胞質(zhì)膜上表達量遠遠高于葉綠體中的類囊體膜上表達量，導致IP-L在葉綠體中的類囊體膜上表達量太低而無法觀察到熒光。

本研究用qRT-PCR分析的組織表達情況，發(fā)現(xiàn)具有明顯的組織表達特異性，在葉片中表達量最高，而在莖、根和花中表達量很低。Zhang等[16]根據(jù)IP-L定位于類囊體膜推測其可能與光合作用有關(guān)，筆者通過克隆的啟動子，分析發(fā)現(xiàn)其啟動子含有許多光應答元件，推測其為光效應啟動子，IP-L在植物的表達可能受光調(diào)控[27]。而植物進行光合作用的部位主要是葉片，因此，在葉片中特異高表達。

Park等[28]發(fā)現(xiàn)了一個與PVX CP互作的蛋白NbPCIP1，該蛋白與IP-L氨基酸同源性達到89%，在本氏煙中，PVX侵染引起NbPCIP1 RNA表達量上調(diào)，且瞬時過量表達NbPCIP1有利于PVX的侵染移動，沉默NbPCIP1抑制PVX的侵染積累和移動。本研究發(fā)現(xiàn)，ToMV侵染本氏煙后，及其編碼蛋白表達均上調(diào)，與IP-L同源蛋白NbPCIP1一致。近期，在筆者實驗室的另一項研究中發(fā)現(xiàn)番茄在ToMV侵染后也呈現(xiàn)上升的變化趨勢[29]，這些對于病毒侵染響應明顯的基因在通路中是否有相似或者相互作用也值得進一步研究。

4 結(jié)論

ToMV CP和IP-L共定位于本氏煙表皮細胞質(zhì)膜。在本氏煙葉片內(nèi)特異高表達。制備的IP-L多克隆抗體具有良好的免疫反應活性，可以用于IP-L表達量檢測；ToMV侵染番茄可誘導及其編碼蛋白表達量在接種后第7天顯著上調(diào)。

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（責任編輯 岳梅）

Subcellular localization and expression Analyses of IP-L Protein interacting with ToMV Coat Protein

PENG HaoRan, PU YunDan, ZHANG YongZhi, XUE Yang, WU GaiXia, QING Ling, SUN XianChao

(College of Plant Protection, Southwest University, Chongqing 400716)

【Objective】Previous studies showed that the coat protein (CP) of ToMV could interact with protein L (IP-L) in. The objectives of this study are to understand the collocation of ToMV CP and IP-L, investigate the expression ofin different tissues of, and investigate the IP-L expression in tomato leaves in response to ToMV infection.【Method】The ToMVandtarget fragments were isolated from the recombinant pGBKT7-CP and pGADT7-IP-L recombinant vectors by digestion with corresponded enzymes. Then the plant expression vectors pPZP-IP-L-N-EGFP and pPZP -CP-N-DsRed and prokaryotic expression vector pEGX-IP-L were constructed. The plant expression vectors were transformed intoEHA105 by heat shock method. The transient expression of ToMV CP and IP-L in tobacco epidermal cells was observed under the fluorescent microscope. Real-time quantitative RT-PCR (qRT-PCR) was used to analyze the expression level ofin different tobacco tissues. The recombinant plasmid pEGX-IP-L was transformed intoBL21 to express the soluble GST-IP-L protein in the optimized condition. GST-IP-L protein was purified with high-affinity GST resin to immunize rabbit for preparing anti-IP-L antibody in a rabbit. The title was determined by enzyme-linked immunosorbant assay (ELISA). The specificity of anti-IP-L antibody and the expression of IP-L in tobacco leaves infected by ToMV were detected by Western blot method and verified it by qRT-PCR.【Result】The ToMV CP was found in cell cytoplasm, cell membrane and chloroplasts, but IP-L only present in leaf epidermal cells membrane. They both co-localized in the plasma membrane. The relative expression ofin the tobacco leaves has the specific high expression, significantly higher than that in stem, root and flower. The soluble GST-IP-L protein with molecular weight 42.8 kD was successfully expressed inBL21 induced with 0.3 mmol·L-1IPTG at 30℃. About 4.2 mg fusion protein was purified and used to immunized rabbit. Anti-IP-L antibody with the title of 1/6 400 was obtained. Western blot analysis showed that the antibody could specially bind with IP-L. After the tobacco leaves were infected by ToMV for 1, 3 and 7 d, western blot analysis showed that IP-L was significantly up-regulated in leaves after 7 days of ToMV infection. qRT-PCR also got the same results, the expression level of IP-L was significantly (more than 200%) higher than that in healthy controls. 【Conclusion】The ToMV CP and IP-L were co-located in the plasma membrane of the tobacco epidermis cell.specifically expressed in the tobacco leaves at high level. The high title and specificity antibody of tomato’s IP-L were successfully achieved. The results of qRT-PCR and Western blot with the polyclonal antibody showed that the expression of IP-L in tobacco leaves was increased by the infection of ToMV.

IP-L; subcellular localization; expression; analysis;(ToMV)

2017-03-07；接受日期：2017-04-14

國家自然科學基金（31670148）、重慶市社會事業(yè)與民生保障創(chuàng)新專項（cstc2015shms-ztzx80012）、中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金（XDJK2016A009，2362015xk04）

彭浩然，E-mail：re4ever@163.com。通信作者孫現(xiàn)超，E-mail：sunxianchao@163.com