鈣蛋白酶抑制劑在深低溫停循環(huán)中肺保護機制的實驗研究

董莉亞，張韞佼，黃雅筠，許喜樂

·基礎研究·

鈣蛋白酶抑制劑在深低溫停循環(huán)中肺保護機制的實驗研究

董莉亞，張韞佼，黃雅筠，許喜樂

目的評估鈣蛋白酶(calpain)抑制劑對心臟手術深低溫停循環(huán)(DHCA)中炎癥反應性肺損傷的保護機制，并探討其作用是否通過核轉(zhuǎn)錄因子kappa B(NF-κB)介導。方法16只幼豬建立體外循環(huán)(CPB)DHCA模型，隨機分為對照組和實驗組，實驗組CPB前1 h靜脈注射calpain抑制劑LLY-FMK(芐氧羧基-亮氨酸-亮氨酸-酪氨酸-熒光甲基酮)1 mg/kg，對照組則注射同劑量的生理鹽水。檢測兩組CPB前和CPB/DHCA后肺靜態(tài)順應性、肺血管阻力指數(shù)、肺濕干質(zhì)量比、支氣管肺泡灌洗液腫瘤壞死因子-α(TNF-α)濃度以及肺組織NF-κB水平；CPB/DHCA結束取肺組織HE染色光鏡觀察肺組織水腫和炎細胞浸潤情況。結果與CPB前相比， CPB后兩組的肺靜態(tài)順應性下降，肺血管阻力、肺濕干重比和肺組織NF-κB表達增加(P<0.05)，但兩組相比，實驗組的改變顯著輕于對照組(P<0.05)，實驗組支氣管肺泡灌注液中的TNF-α含量顯著低于對照組(P<0.05)，光鏡下中性粒細胞滲出、肺水腫和肺泡損傷程度輕于對照組。結論calpain抑制劑LLY-FMK能減輕DHCA后肺部炎癥反應，從而改善肺功能，這種保護作用可能與降低NF-κB活性有關。

體外循環(huán)；深低溫停循環(huán)；calpain；肺缺血再灌注損傷

深低溫停循環(huán)(deep hypothermic circulatory arrest，DHCA)是危重、復雜及低齡兒先天性心臟病手術常用的體外循環(huán)(cardiopulmonary bypass，CPB)方法。筆者前期研究證實CPB/DHCA結束初期肺部炎癥反應加重[1-2]。鈣激活中性蛋白酶( calcium-activated neutral protease，Calpain)抑制劑LLY-FMK(carbobenzoxy-leucinyl-leucinyl-tyrosine-fluoromethyl ketone，芐氧羧基-亮氨酸-亮氨酸-酪氨酸-熒光甲基酮)是一個穿透細胞膜能力強的不可逆抑制劑，競爭calpain I和II催化部位，有學者發(fā)現(xiàn)calpain抑制劑LLY-FMK有利于減輕與小兒心臟外科和體外循環(huán)相關的術后心肺功能障礙，這種功能改善是通過降低CPB/DHCA后血漿內(nèi)皮素-1和維持肺內(nèi)皮一氧化氮水平，從而降低肺血管阻力，改善肺氣體交換和提高全身氧運輸[3]而實現(xiàn)的。本次研究探討calpain抑制劑LLY-FMK是否減輕CPB/DHCA炎癥反應性肺損傷。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物和分組 上海種幼豬16只，雌雄不拘，3～4 周齡，體質(zhì)量7～10 kg， 由上海市松江區(qū)松聯(lián)實驗動物場提供。動物使用許可證號碼為SYXK(滬)2003-0031。動物隨機分為實驗組(CPB前1 h靜脈注射calpain抑制劑LLY-FMK 1 mg/kg)[3]和對照組(CPB前1 h靜脈注射同劑量的生理鹽水)，每組8 只，本實驗人員對實驗組別盲。

1.1.2主要儀器和試劑 Servo 900C 呼吸機((Siemens, Munich, Germany)；帶儲血過濾器的美敦力嬰兒型膜式氧合器(Medtronic, Minneapolis, MN, USA)；動脈微栓過濾器(寧波菲拉爾)；Sarns 8000 型體外循環(huán)機( Terumo CVS, Ann Arbor, USA)。ELISA試劑盒(MN and MD Biosciences，San Jose，CA, USA)。western-blot檢測試劑盒(Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, USA)；Calpain抑制劑LLY-FMK(Enzyme Systems，Livermore, CA,USA)；NF-κ B抗體(Sigma, USA)。

1.2動物手術模型建立 麻醉后氣管插管，接呼吸機，設通氣模式為控制性機械通氣，呼吸頻率20 次/min，潮氣量8～10 ml/kg，吸入氧濃度60%～80%。股靜脈建立靜脈通道，股動脈置管監(jiān)測動脈壓并備抽血樣行血氣分析。胸骨正中切開，右心室流出道和左心耳置測壓管監(jiān)測肺動脈壓和左心房壓。電磁血流儀探頭置肺動脈干測量心輸出量。

1.3各組CPB操作與相關設置 將預充液(包括上海種成年白豬全血400 ml、血定安200 ml、適量復方林格氏液、肝素和碳酸氫鈉等) 加入儲血過濾器中，出血口連接管道經(jīng)滾壓泵組成左心灌注系統(tǒng)，動脈端接微栓過濾器。肝素化后, 常規(guī)升主動脈、右心耳插管建立CPB。連續(xù)監(jiān)測直腸溫度、心電圖、心率、呼氣末二氧化碳分壓和血氧飽和度。圍術期維持平均體動脈壓30～ 60 mm Hg，動脈二氧化碳分壓35～45 mm Hg，pH 值7.35～7.45；DHCA 期間實行α穩(wěn)態(tài)管理。CPB開始，降溫約30 min，肛溫降至18～20 ℃時阻斷主動脈，注入冷晶體心肌保護液(15 ml/kg)，停止轉(zhuǎn)流開始DHCA。60 min 后復溫，開放主動脈恢復CPB，恢復機械通氣，轉(zhuǎn)流至肛溫35℃，繼續(xù)并行循環(huán)60 min 后停CPB。

1.4檢測和觀察

1.4.1檢測指標 兩組動物分別于CPB開始前和DHCA/CPB結束即刻兩時點(簡稱為CPB前和CPB后)，對相關指標進行測量和計算。①肺靜態(tài)順應性(Cstat)：根據(jù)吸氣停頓壓(Ppause)和潮氣量(TV)的測量數(shù)據(jù)，計算Cstat：Cstat=潮氣量(TV)/Ppause(單位：ml/cmH2O)。②肺血管阻力(pulmonary vascular resistance，PVR)：根據(jù)動物體質(zhì)量及平均肺動脈壓、左心房壓和心輸出量的測量數(shù)據(jù)，計算PVR； PVR=(平均肺動脈壓-左心房壓)×80/右心排量(單位：dyne·sec/cm5)。③肺組織炎性因子釋放量：50 ml無菌PBS液(pH 7.2)慢慢輸入肺里，按摩15 s，回收的支氣管肺泡灌洗液，約10 ml，立即冷卻到4℃，高速離心10 min后取上清液ELASA法檢測腫瘤壞死因子α( tumor necrosis factor-α，TNF-α)濃度[4]。④Western blot法檢測肺組織核轉(zhuǎn)錄因子kappa B(NF-κB)水平。⑤肺濕干重比值( wet/dry weight ratio , W/D)：CPB后取小塊肺組織稱取質(zhì)量并記錄，于60℃恒溫箱中置48 h，取出后稱取質(zhì)量并記錄；計算W/D質(zhì)量比以評價肺水腫程度。

1.4.2肺組織形態(tài)學觀察 CPB結束后，取左下肺小塊組織，4%甲醛溶液固定，HE 染色后光學顯微鏡下觀察肺組織水腫和白細胞浸潤情況。

2 結 果

兩組動物在體重、性別比、實驗前用藥、麻醉用藥及體外循環(huán)用藥方面無統(tǒng)計學差異。各觀察指標在CPB開始前組間差異無顯著性。

2.1呼吸功能指標和肺水腫程度測定結果 見表1。

2.2支氣管肺泡灌注液炎性因子含量和肺組織NF-κB活性測定 見表2，圖1。

2.3肺組織形態(tài)學改變 對照組(圖2)肺間質(zhì)水腫，肺組織滲出增加; 肺泡壁由于單核細胞和中性粒細胞大量滲出而明顯增厚，肺間質(zhì)充滿單核細胞和中性粒細胞。實驗組(圖3)肺泡間隔水腫和白細胞滲出均較對照組減輕，肺泡壁相對較薄，肺間質(zhì)中單核細胞和中性粒細胞浸潤較少。

表1 呼吸功能指標比較

注：▲與CPB前比較P<0.05；◆與對照組比較P<0.05。

表2 炎性因子含量和NF-κB條帶灰度值比較

注：▲與CPB前比較P<0.05；◆與對照組比較P<0.05。

注：C1：對照組CPB前；E1：實驗組CPB前；C2：對照組CPB后；E2：實驗組CPB后；▲與CPB前比較P<0.05；◆與對照組比較P<0.05。圖1 Western blot檢測肺組織NF-κB蛋白含量

圖2 對照組肺組織(×200)

圖3 實驗組肺組織(×200)

3 討 論

DHCA是危重、復雜及低齡兒先天性心臟病手術常用CPB方法，新生兒及未成熟兒DHCA術后易出現(xiàn)呼吸衰竭，這主要與新出生兒的肺尚未完全成熟有關，因而DHCA肺保護也如同腦保護一樣愈來愈成為研究熱點之一。在當前常規(guī)心臟手術死亡率和并發(fā)癥已得到滿意控制前提下，解決危重兒DHCA術后肺損傷成為提高手術療效，降低總死亡率的最有效途徑，同時也是心血管外科基礎研究和臨床工作難點。

CPB引起的炎癥反應對多種重要臟器和血液有形成分都有不同程度的損傷，國內(nèi)外將這種反應和損傷稱為“全身炎癥反應綜合征”(systemic responsive syndrom，SIRS)。除血液有形成分外，受到SIRS影響最大就是肺組織[5]。CPB炎癥反應所致肺損傷的確切機理尚不清楚，可能的機理有：①CPB時血液與非生物材料接觸引起白細胞和補體激活，黏附分子和細胞因子釋放；②體外循環(huán)大部分時間內(nèi)，肺組織無血流灌注，僅靠支氣管動脈血供，即使在全流量轉(zhuǎn)流灌注壓充分的情況下，支氣管血流也僅有基礎值的13%左右，這證明CPB期間肺缺血狀態(tài)。動物實驗支氣管肺泡灌洗液證實CPB期間肺區(qū)炎癥反應可能就是由肺缺血引起[6]。如果是DHCA肺則完全處于缺血狀態(tài)，再灌注后，大量白細胞由于變形能力受影響而被扣留在肺臟的微血管床，這些白細胞與肺內(nèi)誘發(fā)的炎性物質(zhì)相互影響游出血管外，釋放出氧自由基等毒性產(chǎn)物，導致缺血臟器的進一步損傷，并加劇全身和該臟器的炎癥反應。這就是肺的缺血再灌注損傷(lung ischemia reperfusion injury，LIRI)。缺血的肺組織細胞恢復灌注后不但不能迅速恢復正常的代謝機能，反而加重損傷，主要表現(xiàn)為再灌注肺組織充血、水腫。對引起肺組織缺血或缺氧損傷的疾病或器官移植等過程，都涉及缺血再灌注損傷。近年來研究顯示，炎性反應在CPB的LIRI中起到重要的作用[7]。

Calpain是一種Ca2+依賴性半胱氨酸蛋白水解酶，廣泛分布于絕大多數(shù)哺乳動物組織中，在細胞內(nèi)發(fā)揮多種生理作用，如細胞骨架重塑、信號轉(zhuǎn)導、細胞周期調(diào)控及凋亡。Calpain-1和calpain-2是最早發(fā)現(xiàn)也是研究最多的兩個calpain家族成員，前者需微摩爾水平的Ca2+被激活，后者需毫摩爾水平的Ca2+被激活，兩者的作用均受到內(nèi)源性特異性抑制劑calpastatin的調(diào)節(jié)[8]。某些病理情況下，如缺血缺氧、氧化應激、細胞膜損傷等均可引起細胞內(nèi)Ca2+升高，導致calpain被過度激活，接著裂解凋亡相關蛋白NF-kB 、Bcl-2、Bcl-xl、Bid、Bax及caspases等，或引起線粒體通透性增加，從而介導細胞凋亡。通過應用calpain抑制劑、基因敲除、calpastatin過表達等方法抑制calpain活性，起到良好的細胞保護作用[9]。

已有研究證實calpain在CPB心、腦、腎等臟器損傷中起重要作用，但是關于calpain與CPB肺損傷關系的研究報道很少。Duffy等建立幼豬CPB并DHCA的缺血再灌注模型，發(fā)現(xiàn)CPB和DHCA后calpain抑制劑能夠降低肺組織ET-1水平，并維持肺內(nèi)皮細胞一氧化氮合酶活性，從而使CPB后PVR下降，氣體交換改善和全身氧運輸量提高。證明calpain抑制劑能夠降低不成熟動物CPB缺血再灌注的心肺功能損傷[3]。

筆者前期研究已建立幼豬DHCA模型，通過衡量肺區(qū)炎性介質(zhì)、白細胞黏附分子證實了CPB再灌注及循環(huán)停止后初期肺組織是炎癥反應區(qū)，DHCA加劇了CPB肺組織炎癥反應，并通過呼吸功能測定、肺組織學檢查和肺W/D評估肺損傷程度，發(fā)現(xiàn)炎性介質(zhì)和黏附分子的表達和肺損傷程度有顯著相關性[1-2]。本研究建立原幼豬CPB模型，嘗試研究DHCA再灌注過程和CPB停止早期肺區(qū)炎癥反應的發(fā)生機理。肺Cstat和PVR是綜合反應肺功能的兩個指標。本實驗DHCA后，發(fā)現(xiàn)對照組和實驗組CPB前后肺靜態(tài)順應性均顯著降低(對照組P<0.001，實驗組P<0.001)，肺血管阻力都顯著增加(對照組P=0.002，實驗組P=0.004)，說明不管有無calpain抑制劑干擾，DHCA后幼豬肺功能都顯著受損。肺重量改變是評價肺損傷的重要指標之一，肺重量增加主要為肺含水量增加。LIRI的基本病理改變是肺毛細血管通透性增高，表現(xiàn)為血管內(nèi)滲出增多，肺W/D增加，這是肺缺血再灌注損傷的病理基礎，從而導致明顯的肺氣體交換功能障礙。本實驗觀察到，肺W/D CPB后兩組均明顯高于CPB前(對照組P<0.001，實驗組P=0.04)，進一步證明了DHCA后肺功能損傷。兩組CPB前Cstat、PVR和W/D比值均無顯著性差異(分別為P=0.07，P=0.68，P=0.94)，而CPB后三個指標均出現(xiàn)顯著性差異，calpain抑制劑干預后實驗組相對于對照組肺靜態(tài)順應性顯著提高(P=0.001)，PVR顯著降低(P=0.01)，肺W/D顯著降低(P=0.002)，說明calpain抑制劑干預能減輕肺損傷程度，這與Duffy等[3]研究結果一致。

關于calpain與CPB期間炎癥反應性肺損傷之間的關系還未有報道。有學者在大鼠在體胸膜炎和關節(jié)炎模型中使用calpain抑制劑，發(fā)現(xiàn)可以延緩急性和慢性炎癥進展，從而提出抑制calpain活性可能是治療炎癥的一個新的靶向[10]。在一個由內(nèi)毒素誘導肝炎的大鼠模型中，發(fā)現(xiàn)給calpain抑制劑組相對于對照組能明顯減輕肝中性粒細胞滲出并減少中間地帶肝壞死[11]。Stalker等在糖尿病大鼠模型中發(fā)現(xiàn)calpain活性增加在高血糖引起的血管炎癥反應中起重要作用，抑制calpain活性可以降低細胞黏附分子表達和維持內(nèi)皮細胞NO釋放，從而減輕白細胞和內(nèi)皮細胞相互作用[12]。所以筆者推測實驗組使用calpain抑制劑后抑制了肺區(qū)炎癥反應從而改善了肺功能。支氣管肺泡灌洗液TNF-α水平能較好的反應肺區(qū)炎癥反應。筆者實驗中發(fā)現(xiàn)對照組CPB前后支氣管肺泡灌洗液TNF-α顯著升高(P=0.009)，而實驗組沒有顯著性改變(P=0.746)，而且CPB后實驗組相對于對照組支氣管肺泡灌洗液TNF-α顯著降低(P=0.014)，說明實驗組calpain抑制劑干擾后肺區(qū)炎癥反應明顯減輕。

NF-kB是調(diào)控炎癥和免疫反應的主要核轉(zhuǎn)錄因子之一。在胞漿中NF-kB因與抑制蛋白(IkBs)結合而表現(xiàn)為無活性的形式。當機體受到外界刺激后，在蛋白激酶和蛋白磷酸化酶的參與下，IkB 即被磷酸化，從而被蛋白激酶降解, 并從NF-kB 二聚體上解離, 暴露出p50蛋白的核定位信號, NF-kB 即被激活, 轉(zhuǎn)位到細胞核內(nèi)與相應的靶基因kB 序列相結合, 誘導和增強相關基因的表達[13]。NF-kB 參與調(diào)控的基因有細胞因子、生長因子、趨化因子、炎性介質(zhì)、黏附分子等，而這些物質(zhì)在肺區(qū)炎癥反應中起重要作用。目前國外研究表明， calpain參與了NF-kB的激活，其激活的途徑可能是通過降解NF-kB 的抑制因子IkBα，從而使NF-kB轉(zhuǎn)位入核并調(diào)控相關基因的表達[14]。實驗性大鼠急性胰腺炎模型中，腹腔注射calpain抑制劑，可以減輕NF-kB的活性，降低肺組織內(nèi)皮細胞間黏附分子-1(ICAM-1)表達的上調(diào)和脂質(zhì)過氧化，從而減輕肺損傷[15]。筆者在實驗中發(fā)現(xiàn)CPB后肺組織NF-kB的表達實驗組相對于對照組顯著降低(P=0.002)，從而推測calpain抑制劑能抑制CPB所致的肺區(qū)炎癥反應，其作用可能通過NF-kB介導。

CPB心臟術后肺功能障礙在心臟術后非常常見。Calpain在臟器缺血再灌注中的損傷機制已被證實，但從未見針對calpain抑制劑對DHCA炎癥反應性肺損傷保護作用方面的報道。本研究具有創(chuàng)新性，且具備進一步深入研究機制和干預方法的潛力。如果研究得到預期結果，可進一步明確DHCA所致肺損傷的機制，并為其以后在臨床應用打下基礎。

[1]董莉亞, 鄭景浩, 王利民，等. 肺缺血預處理在深低溫停循環(huán)中肺保護的實驗 [J]. 中國體外循環(huán)雜志，2008，6(2)：108-112.

[2]Dong LY, Zheng JH, Qiu XX,etal. Ischemic preconditioning reduces deep hypothermic circulatory arrest cardiopulmonary bypass induced lung injury [J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2013, 17(13):1789-1799.

[3] Duffy JY, Schwartz SM, Lyons JM,etal. Calpain inhibition decreases endothelin-1 levels and pulmonary hypertension after cardiopulmonary bypass with deep hypothermic circulatory arrest[J]. Crit Care Med, 2005, 33(3):623-628.

[4]Li P, Li Y, Shao G,etal. Comparison of immune responses to intranasal and intrapulmonary vaccinations with the attenuated Mycoplasma hyopneumoniae 168 strain in pigs [J]. J Vet Med Sci, 2015, 77(5):519-525.

[5] Garlid KD, Dos SP, Xie ZJ,etal. Mitochondrial potassium transport: the role of the mitochondrial ATP-sensitive K(+) channel in cardiac function and cardioprotection [J]. Biochim Biophys Acta, 2003,1606(1-3):1-21.

[6] Schlensak C, Doenst T, Preusser S,etal. Cardiopulmonary bypass reduction of bronchial blood flow: A potential mechanism for lung injury in a neonatal pig model [J]. J Thorac Cardiovasc Surg, 2002, 123(6):1199-1205.

[7] Schlensak C, Doenst T, Preusser S,etal. Bronchial artery perfusion during cardiopulmonary bypass does not prevent ischemia of the lung in piglets: assessment of bronchial artery blood flow with fluorescent microspheres[J]. Eur J Cardiothorac Surg, 2001, 19(3):326-331.

[8] Bukowska A, Lendeckel U, Bode-Boger SM,etal. Physiologic and pathophysiologic role of calpain: implications for the occurrence of atrial fibrillation[J]. Cardiovasc Ther, 2012, 30(3):115-127.

[9] Mani SK, Balasubramanian S, Zavadzkas JA,etal. Calpain inhibition preserves myocardial structure and function following myocardial infarction [J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2009, 297(5): H1744-H1751.

[10] Cuzzocrea S1, McDonald MC, Mazzon E,etal. Calpain inhibitor I reduces the development of acute and chronic inflammation[J]. Am J Pathol, 2000, 157(6):2065-2079.

[11] Rose R, Banerjee A, Ramaiah SK. Calpain inhibition attenuates iNOS production and midzonal hepatic necrosis in a repeat dose model of endotoxemia in rats[J]. Toxicol Pathol, 2006, 34(6):785-794.

[12] Stalker TJ, Skvarka CB, Scalia R. A novel role for calpains in the endothelial dysfunction of Hyperglycemia [J]. FASEB J, 2003,17(11):1511-1513.

[13] Son G, Iimuro Y, Seki E,etal. Selective inactivation of NF-kappaB in the liver using NF-kappaB decoy suppresses CCl4-induced liver injury and fibrosis[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2007,293(3):G631-639.

[14] Letavernier E, Perez J, Bellocq A,etal. Targeting the calpain/calpastat in system as a new strategy to prevent cardiovascular remodeling in angiotensin II-induced hypertension [J].Circ Res, 2008, 102(6):720-728.

[15] Bukowska A, Lendeckel U, Bode-Boger SM,etal. Physiologic and Pathophysiologic Role of Calpain:Implications for the occurrence of Atrial Fibrillation[J].Cardiovasc Ther, 2012, 30(3):e115-127.

CalpaininhibitorLLY-FMKimprovespulmonaryfunctionindeephypothermiccirculatoryarrestcardiapulmonarybypass

Dong Li-ya, Zhang Yun-jiao, Huang Ya-jun, Xu Xi-le

DepartmenofThoracicandCardiovascularSurgery,ShanghaiXinhuaHospital,ShanghaiJiaotongUniversity,Schoolofmedicine,Shanghai200092,China

XuXi-le,Email:xuxile@xinhuamed.com.cn

ObjectiveTo evaluate the lung protective effects of calpain inhibitor in deep hypothermic circulatory arrest (DHCA), especially the inflammatory lung injury, and investigate whether its effect is mediated by NF-κB.MethodsUsing an animal model of DHCA, 16 piglets were divided randomly into two groups:control group and experimental group. Eight animals of experimental group were administered calpain inhibitor LLY-FMK (carbobenzoxy-leucinyl-leucinyl-tyrosine-fluoromethyl ketone) (1 mg/kg, intravenously) 60 mins before cardiopulmonary bypass, the other animals were administered saline as a control. At the beginning and end of CPB, lung static compliance(Cstat), pulmonary vascular resistance(PVR), TNF-α concentration of bronchoalveolar lavage fluid, NF-κB expressions of lung tissue and the lung wet/dry weight ratio (W/D) were measured. At the end of CPB, some lung tissues were fixed to observe pathological changes.ResultsAfter cardiopulmonary bypass, the Cstat decreased while, the PVR, the W/D, the NF-κB expressions of lung tissue increased in both groups, changes of experimental group were much less than those of control group. Content of TNF-α of bronchoalveolar lavage fluid in experimenatal group was lower than that in control group at the end of CPB, Infiltration of neutrophils, pulmonary edema and alveolar damage in experimental group decreased significantly compared with control group.ConclusionCalpain inhibitor can alleviate lung inflammatory response and improve lung function after DHCA, the improvement may be associated with the reduction of NF-κB activity.

Cardiapulmonary bypass; Deep hypothermic circulatory arrest; Calpain; Lung ischemic reperfusion injury

2016-11-07)

2016-12-22)

10.13498/j.cnki.chin.j.ecc.2017.03.15

200092 上海，上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院心胸外科

許喜樂，Email：xuxile@xinhuamed.com.cn