菊花幾丁質(zhì)酶基因ChCHI的克隆及表達(dá)分析

崔 波， 宋彩霞， 王瑩博， 王若斕， 蔣素華， 梁 芳， 葉永忠

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州450002； 2.鄭州師范學(xué)院生物工程研究所，河南 鄭州 450044； 3.鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450001)

菊花幾丁質(zhì)酶基因ChCHI的克隆及表達(dá)分析

崔 波1,2， 宋彩霞1， 王瑩博1， 王若斕2,3， 蔣素華2， 梁 芳2， 葉永忠1

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州450002； 2.鄭州師范學(xué)院生物工程研究所，河南 鄭州 450044； 3.鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450001)

根據(jù)GenBank發(fā)布的幾丁質(zhì)酶基因的保守序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，采用RT-PCR和RACE技術(shù)，克隆到菊花1個(gè)幾丁質(zhì)酶基因ChCHI(GenBank登錄號(hào)為KX881373)。ChCHI基因cDNA全長(zhǎng)為1 385 bp，包含960 bp開放閱讀框，編碼319個(gè)氨基酸。ChCHI屬于親水性蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量約為35.5 kD，等電點(diǎn)為6.38，為穩(wěn)定蛋白，二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明該蛋白以α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為主。蛋白序列比對(duì)和進(jìn)化樹分析表明，ChCHI基因編碼的蛋白屬于糖苷水解酶19家族幾丁質(zhì)酶，與薇甘菊(ACO25187.1)幾丁質(zhì)酶蛋白的親緣關(guān)系最近，序列一致性為87%。qRT-PCR分析結(jié)果顯示，SA處理可以明顯提高貢菊葉片中ChCHI的表達(dá)量。菊花ChCHI在對(duì)抗環(huán)境脅迫的分子調(diào)控中起重要作用。

菊花；幾丁質(zhì)酶基因；克??；表達(dá)分析

菊花(Chrysanthemummorifolium)為菊科(Compositae)多年生草本植物。菊花種類繁多、形態(tài)多樣，是中國(guó)十大名花之一，也是世界四大切花之一，被廣泛用于切花、盆栽以及園林綠化，栽培歷史悠久。菊花富含黃酮類等多種生物活性物質(zhì)，又具有藥用和食用價(jià)值，在世界各地廣為栽培。隨著菊花的消費(fèi)需求越來(lái)越大，為了滿足市場(chǎng)的需求，溫室栽培條件實(shí)現(xiàn)了菊花市場(chǎng)的全年供應(yīng)。由于連作或溫室培養(yǎng)等多種因素的影響，菊花在栽培過(guò)程中會(huì)感染多種病害，導(dǎo)致其藥用性、觀賞性和商品性普遍退化，溫室栽培雖然打破了季節(jié)的局限性，但存在嚴(yán)重病害及耗費(fèi)能源等問(wèn)題，嚴(yán)重阻礙了菊花的生產(chǎn)和發(fā)展。因此，提高菊花的抗逆性至關(guān)重要。幾丁質(zhì)酶(Chitinase)是一種降解幾丁質(zhì)的糖苷酶[1]，通過(guò)水解病原微生物細(xì)胞壁幾丁質(zhì)中的β-1,4糖苷鍵產(chǎn)生N-乙酰氨基葡萄糖寡聚體或單體而起到抑菌作用。許多細(xì)菌[2]、植物[3]和動(dòng)物[4]都可以產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶。正常植物中的幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)量很低或者不表達(dá)，當(dāng)植物受到病蟲害[5]、真菌[6]、病毒[7]、水楊酸、乙烯利[8]、重金屬[9]、高鹽、紫外線、低溫[10]、干旱[11]、機(jī)械損傷[12]等脅迫時(shí)，幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)量會(huì)迅速提高。BROGLIE等[13]最早以菜豆為材料克隆了幾丁質(zhì)酶基因。隨著研究的不斷深入，研究者至今已從擬南芥[14]、無(wú)花果[15]、番茄、馬鈴薯[16]、鳳梨[17]、煙草、大豆等植物中提取和純化了幾丁質(zhì)酶。轉(zhuǎn)化了幾丁質(zhì)酶基因的多種植物對(duì)特定病害的抗性得到增強(qiáng)，如水稻對(duì)紋枯病的抗性[18]、番茄對(duì)枯萎病和早疫病的抗性[19]、香蕉對(duì)黑葉條紋病的抗性[20]、棉花對(duì)黃萎病的抗性[21]、檸檬對(duì)真菌病害的抗性[22]等。近年來(lái)，隨著研究者對(duì)其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、生化性質(zhì)、表達(dá)調(diào)控、作用機(jī)理等方面的進(jìn)一步研究，使幾丁質(zhì)酶在抗病基因工程和分子生物學(xué)領(lǐng)域成為研究熱點(diǎn)。

水楊酸(SA)作為誘導(dǎo)植物抗性的信號(hào)分子[23]，也是最早發(fā)現(xiàn)的一種化學(xué)誘導(dǎo)劑，在植物對(duì)逆境的脅迫過(guò)程中起重要作用。大量研究結(jié)果表明，外源水楊酸可誘導(dǎo)月季[24]、馬鈴薯[25]、水稻、擬南芥等多種植物病程相關(guān)蛋白基因的表達(dá)，增強(qiáng)植株的抗病能力。盡管目前在很多植物中都克隆到不同的幾丁質(zhì)酶基因，而在菊花中幾丁質(zhì)酶基因及其研究還未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)RT-PCR和RACE技術(shù)，首次從菊花葉片克隆到一個(gè)幾丁質(zhì)酶基因ChCHI，并對(duì)其進(jìn)行了SA誘導(dǎo)的實(shí)時(shí)熒光定量表達(dá)分析，為利用幾丁質(zhì)酶基因進(jìn)行菊花抗性分子育種奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料與處理

試驗(yàn)材料為貢菊，由鄭州師范學(xué)院生物工程研究所提供。選取高約20 cm的貢菊幼苗，取經(jīng)過(guò)0.5 mmol·L-1和0.1 mmol·L-1水楊酸處理0、4、8、16、24、48 h的中部葉片組織材料，液氮速凍后保存于-80 ℃超低溫冰箱中備用。

1.2方法

1.2.1 菊花葉片總RNA提取和cDNA合成 葉片組織總RNA用TIANGEN公司的多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取，經(jīng)過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，用Q5000核酸蛋白分析儀(美國(guó)Quawell)測(cè)定提取的RNA的濃度和純度。用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa)以4 ℃處理不同時(shí)間段的葉片混合提取的總RNA為模板，合成單鏈cDNA，具體操作根據(jù)說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.2 菊花幾丁質(zhì)酶基因全長(zhǎng)的克隆 利用軟件DNAMAN和Primer premier 5.0，根據(jù)NCBI登錄的植物幾丁質(zhì)酶基因序列的保守區(qū)，設(shè)計(jì)一對(duì)簡(jiǎn)并引物，上游引物Ch-CHI-F1(5’-TGTGATCARGGWTGGGAATGT-3’)和下游引物Ch-CHI-R1(5’-AGATTGCRGCTTGGAARGCTA-3’)，以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA第一鏈為模板，擴(kuò)增獲得菊花幾丁質(zhì)酶基因的保守片段。PCR擴(kuò)增總體系(20 μL)為:10×PCR buffer 2 μL，模板cDNA 1 μL，dNTP Mix 1.6 μL，上游引物和下游引物各 1 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL，無(wú)菌ddH2O 13.2 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，利用凝膠試劑盒(TIANGEN公司)將PCR產(chǎn)物回收純化后連接到pGEM-T Easy載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞挑選陽(yáng)性克隆測(cè)序，并在NCBI中比對(duì)分析測(cè)序結(jié)果。

根據(jù)上步獲得的幾丁質(zhì)酶基因中間片段序列，設(shè)計(jì)一對(duì)3’端特異性引物，GSP1(5’-CGTTGGGAGTCAAACTTCGT-3’)和GSP2(5’-ACTATGGCTACCTTGGCGACT-3’)，一對(duì)5’端特異性引物GSP3(5’-GGTAAATGGCAGCAGCAGTAAT-3’)和GSP4(5’-AGTTCCAGAAGACGGGCAAAG-3’)，按照試劑盒說(shuō)明操作，完成反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后進(jìn)行PCR反應(yīng)，回收擴(kuò)增產(chǎn)物，連接到pGEM-T Easy載體上，然后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α菌株，挑選陽(yáng)性克隆測(cè)序，并與中間片段進(jìn)行拼接。

根據(jù)拼接序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物ChCHI-ORFF(5’- CAAAGAAGAATGGGGACAAAAC -3’)和ChCHI-ORFR(5’- AGGTTAACTCGAAGCCGATTC -3’)用于ORF(開放閱讀框)的擴(kuò)增。采用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(TIANGEN公司)回收目的片段，對(duì)目的片段進(jìn)行轉(zhuǎn)化和克隆，挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。引物合成和測(cè)序由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司完成 。

1.2.3 菊花幾丁質(zhì)酶基因的生物信息學(xué)分析 用Blast軟件進(jìn)行幾丁質(zhì)酶基因的同源序列搜索；用ORF Finder軟件預(yù)測(cè)開放閱讀框；在NCBI的蛋白保守區(qū)數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索幾丁質(zhì)酶基因編碼蛋白保守結(jié)構(gòu)域及功能域；用ProtParam軟件預(yù)測(cè)編碼蛋白基本的理化性質(zhì)；用SignalP預(yù)測(cè)蛋白的信號(hào)肽；用ProtScale軟件預(yù)測(cè)親疏水性；用SOPMA軟件預(yù)測(cè)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；用Phyre 2預(yù)測(cè)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)；用PSORT在線軟件對(duì)目的蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位；用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4 菊花幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)分析 利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)菊花幾丁質(zhì)酶基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR引物 qChCHI-F(5’-GGTTGGGAATGTAAAGGATGGTC-3’)和qChCHI-R(5’-GTTGGTAAATGGCAGCAGCAGTA-3’)。以18S rRNA作為內(nèi)參基因，引物為18S-F(5’-GTCGGGGGCATTCGTATTTC-3’)和18S-R(5’-CGGCATCGTTTATGGTTGAG-3’)。提取菊花經(jīng)過(guò)SA處理的葉片總RNA，使用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成單鏈cDNA。參照購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司的SYBR Premix Ex TaqTMⅡ Kit試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。使用儀器為Eppendorf Mastercycler ep realplex 2熒光定量PCR儀，反應(yīng)體系為20 uL，反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性15 s，58 ℃變性15 s，72 ℃退火15 s，共40個(gè)循環(huán)?；蛳鄬?duì)表達(dá)量采用公式2-△△Ct法計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1菊花幾丁質(zhì)酶基因全長(zhǎng)cDNA克隆

利用簡(jiǎn)并引物和0.1 mmol·L-1SA處理葉片8 h的cDNA 進(jìn)行菊花幾丁質(zhì)酶基因保守片段的PCR擴(kuò)增，預(yù)期得到1條長(zhǎng)度約為500 bp的片段，該片段大小與預(yù)期目的條帶一致，測(cè)序結(jié)果得到529 bp的特異保守片段。根據(jù)該片段序列采用RACE技術(shù)，設(shè)計(jì)RACE引物，利用3’端引物GSP1和GSP2擴(kuò)增出3’端目的片段，用5’端引物GSP3和GSP4擴(kuò)增出5’端目的片段。將中間片段、3’端目的片段和5’端目的片段序列拼接,在開放閱讀框(ORF)區(qū)域設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增，得到了預(yù)期的片段，最終獲得大小為1 385 bp的菊花幾丁質(zhì)酶基因的全長(zhǎng)cDNA序列(圖1)。其核苷酸序列在NCBI上Blast分析，發(fā)現(xiàn)其與薇甘菊的幾丁質(zhì)酶基因有較高一致性，為83%，將該基因命名為ChCHI，提交GenBank，登錄號(hào)為KX881373。包含1個(gè)19家族幾丁質(zhì)酶結(jié)構(gòu)域，表明該片段為幾丁質(zhì)酶片段。經(jīng)NCBI在線工具ORF Finder軟件查找，該基因具有 960 bp的完整開放閱讀框，5’端非編碼區(qū)為 72 bp，3’端非編碼區(qū)為353 bp，編碼319個(gè)氨基酸(圖2)。

1.保守片段；2.5’-RACE；3.3’-RACE；4.開放閱讀框片段；M.DL2000。1.Conserved region； 2.5’-RACE； 3.3’-RACE； 4.ORF； M. DL2000.

ATG．起始密碼子；TAA．終止密碼子；陰影．保守序列 ATG．Start codon； TAA．Stop codon； Shadow． Conserved Sequence

2.2菊花幾丁質(zhì)酶基因及編碼蛋白序列的生物信息學(xué)分析

利用NCBI的蛋白保守區(qū)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)菊花幾丁質(zhì)酶基因編碼蛋白的保守區(qū)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明(圖3)，該蛋白在第64-301氨基酸殘基之間有一個(gè)幾丁質(zhì)酶糖苷酶19家族結(jié)構(gòu)域，在此結(jié)構(gòu)域內(nèi)有3個(gè)催化殘基位點(diǎn)和7個(gè)糖結(jié)合位點(diǎn)，說(shuō)明該結(jié)構(gòu)域包含催化區(qū)；該結(jié)構(gòu)域還是一個(gè)溶菌酶相似超家族基因的保守結(jié)構(gòu)域，推測(cè)該蛋白兼具溶菌酶活性。

將菊花的幾丁質(zhì)酶基因與其他植物的幾丁質(zhì)酶基因的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)(圖4)，發(fā)現(xiàn)它們有較高的同源性。一致性分析表明，ChCHI的氨基酸序列與薇甘菊(MikaniamicranthaACO25187.1)、梅(PrunusmumeXP-008222679.1)和芝麻(SesamumindicumXP-011073914.1)的一致性分別為87%、72%和70%，4個(gè)物種具有共同的幾丁質(zhì)酶基序。利用PSORT在線軟件對(duì)目的蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位，軟件分析顯示,ChCHI基因編碼蛋白分泌到胞外的概率為82%，存在微體或過(guò)氧化物體中的概率為16.2%，存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中的概率都為10%，發(fā)現(xiàn)該蛋白存在于細(xì)胞外的可能性較大。

圖3 菊花幾丁質(zhì)酶基因預(yù)測(cè)蛋白的結(jié)構(gòu)域分析Fig.3 Conserved domain analysis of predicted protein of chitinase gene in Chrysanthemum morifolium

圖4 ChCHI所編碼的氨基酸與其他植物來(lái)源的幾丁質(zhì)酶氨基酸序列比對(duì)Fig.4 Homology analysis of ChCHI encodes amino acid sequences and those from other plant species

ProtParam軟件預(yù)測(cè)結(jié)果表明，菊花幾丁質(zhì)酶基因編碼的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約為35.5 kD，理論等電點(diǎn)pI為6.38，不穩(wěn)定指數(shù)為31.25，屬穩(wěn)定蛋白。SignalP的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，該蛋白在N-端的第1～23氨基酸殘基之間有一信號(hào)肽區(qū)域，第23位丙氨酸和第24位天冬氨酸之間為信號(hào)肽切割位點(diǎn)，從24位氨基酸以后為成熟蛋白。利用ProtScale對(duì)ChCHI氨基酸序列的疏水性和親水性進(jìn)行預(yù)測(cè),結(jié)果表明，第148位的Ser具有最低的分值-3.033，親水性最強(qiáng)；而第12位的Thr具有最高的分值3.400，疏水性最強(qiáng)。整體來(lái)看，親水性氨基酸分布比較均勻，且數(shù)量多于疏水氨基酸，可以進(jìn)一步推測(cè)菊花ChCHI蛋白質(zhì)為親水性蛋白。

利用SOPMA對(duì)菊花ChCHI氨基酸序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(圖5)。從圖5中可以發(fā)現(xiàn)，菊花ChCHI由40.75%的無(wú)規(guī)則卷曲(Random coil)，29.47%的α-螺旋(Alpha helix)，19.75%的延伸連(Extended strand)和10.03的β-轉(zhuǎn)角(Beta turn)組成。在整個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中，無(wú)規(guī)則卷曲和α-螺旋是菊花ChCHI最主要的結(jié)構(gòu)元件，而延伸連和β-轉(zhuǎn)角則次之。

圖5 ChCHI蛋白2級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.5 Secondary structure prediction of ChCHI protein

利用Phyre 2 預(yù)測(cè)ChCHI蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖6)。預(yù)測(cè)結(jié)果表明，該蛋白質(zhì)為一個(gè)結(jié)構(gòu)較為松散的球狀蛋白，與粳稻的ClassⅠ(模板：c2dkvA)序列一致性為82%，可以看出,該蛋白空間結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲這種元件構(gòu)成。

為進(jìn)一步分析菊花幾丁質(zhì)酶基因與其他物種幾丁質(zhì)酶基因的關(guān)系，將NCBI上已登錄的16個(gè)物種的幾丁質(zhì)酶基因的氨基酸序列進(jìn)行Blast，利用MEGA4.0軟件對(duì)其進(jìn)行進(jìn)化樹分析(圖7)，結(jié)果顯示，幾丁質(zhì)酶蛋白分為第19和第18兩個(gè)家族，菊花的ChCHI蛋白為第19家族， 與19家族中薇甘菊、刺菜薊(Cynaracardunculusvar.scolymus)的幾丁質(zhì)酶蛋白親緣關(guān)系最近，與陸地棉(Gossypiumhirsutum)、金合歡(Acaciakoa)、美花煙草(Nicotianasylvestris)、葡萄(Vitisvinifera)、芝麻、可可(Theobromacacao)、蘋果(Malusdomestica)、梅、草莓(Fragariaxananassa)、川椒(Capsicumannuum)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)等的幾丁質(zhì)酶蛋白具有相對(duì)較近的親緣關(guān)系。與18家族的擬南芥(Arabidopsisthaliana)、煙草(Nicotianatabacum)的幾丁質(zhì)酶蛋白親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。

2.3菊花幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)分析

為了分析菊花幾丁質(zhì)酶基因和SA脅迫的關(guān)系，采用實(shí)時(shí)熒光定量方法檢測(cè)菊花幾丁質(zhì)酶基因在SA誘導(dǎo)后的表達(dá)量。以誘導(dǎo)后的0 h的表達(dá)量為對(duì)照，用2-△△Ct方法進(jìn)行分析并作圖，以18S rRNA作為內(nèi)參基因(圖8)。結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)0.5 mmol·L-1和0.1mmol ·L-1水楊酸誘導(dǎo)后，在一定時(shí)間內(nèi)(8 h)較低濃度的水楊酸處理(0.1mmol ·L-1)能使菊花幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)量明顯升高，總體趨勢(shì)是在4 h時(shí)表達(dá)量有所下降，在8 h時(shí)幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)量最高，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，其表達(dá)量呈逐漸下降趨勢(shì)，比誘導(dǎo)前的表達(dá)量低。

圖6 ChCHI蛋白3級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.6 The tertiary structure prediction of ChCHI protein

圖7 ChCHI與其他植物來(lái)源的幾丁質(zhì)酶蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化Fig.7 Phylogenetic tree of the ChCHI and chitinases protein from other plant species

3 結(jié)論與討論

幾丁質(zhì)酶是一種重要的病程相關(guān)蛋白，在植物抵御逆境和抵抗真菌病原物方面具有重要的作用，植物體受到傷害時(shí)自身幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)量會(huì)迅速提高。本研究通過(guò)同源克隆的方法，首次從菊花葉片中克隆到1個(gè)幾丁質(zhì)酶基因的全長(zhǎng)cDNA序列ChCHI(GenBank登錄號(hào)為KX881373)，并利用生物信息學(xué)方法對(duì)ChCHI蛋白的分子特征進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。結(jié)果表明，ChCHI基因cDNA全長(zhǎng)為1 385 bp,包含960 bp開放閱讀框，編碼319個(gè)氨基酸，該基因?qū)儆?9家族幾丁質(zhì)酶基因，包含1個(gè)催化區(qū)，在N端有1個(gè)信號(hào)肽，相對(duì)分子質(zhì)量約為35.5 kD，為穩(wěn)定蛋白，親水性強(qiáng)，2級(jí)結(jié)構(gòu)表明該蛋白以α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為主，屬酸性蛋白。 ChCHI蛋白的3級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，該蛋白質(zhì)為1個(gè)結(jié)構(gòu)較為松散的球狀蛋白，與栽培稻粳稻的ClassⅠ序列一致性為82%，可以看出該蛋白空間結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲這兩種元件構(gòu)成。

圖8 ChCHI的表達(dá)特性分析Fig.8 Expression pattern analysis of ChCHI

植物幾丁質(zhì)酶被劃分為第18和第19 兩個(gè)家族。序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化結(jié)果表明，這16個(gè)物種的幾丁質(zhì)酶分別隸屬于18家族和19家族幾丁質(zhì)酶。幾丁質(zhì)酶基因的進(jìn)化有明顯的種屬特征，菊花ChCHI蛋白與同為菊科的薇甘菊和刺菜薊的親緣關(guān)系最近，其一致性達(dá)到87%和77.5%，與錦葵科的陸地棉及其他不同科之間的幾丁質(zhì)酶蛋白親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

有研究表明，多數(shù)病原菌是從細(xì)胞間隙開始侵染植物的，侵入的病原菌會(huì)阻礙或破壞植物組織攝取營(yíng)養(yǎng)，植物的正常生長(zhǎng)將會(huì)受到抑制[26]。因此，為了更好地抵御病原菌的侵染，抗真菌蛋白最好在胞間表達(dá)。本研究所克隆的ChCHI基因通過(guò)亞細(xì)胞定位分析，預(yù)測(cè)其分泌到胞外的概率很大(82%)，推斷該基因如果在菊花中表達(dá)，其所表達(dá)的蛋白可能有助于直接參與對(duì)菊花真菌病害的防御。本研究為進(jìn)一步研究菊花ChCHI基因的抗真菌特性提供理論依據(jù)。

當(dāng)植物幾丁質(zhì)酶被發(fā)現(xiàn)后，研究者大多關(guān)注的是其對(duì)幾丁質(zhì)的降解和對(duì)多種真菌的抑制作用，本研究通過(guò)qRT-PCR分析了經(jīng)過(guò)SA處理后的葉片中ChCHI基因表達(dá)量，結(jié)果表明，幾丁質(zhì)酶基因在SA處理后的表達(dá)量在短時(shí)間內(nèi)快速升高，這與之前報(bào)道的水楊酸誘導(dǎo)花生幾丁質(zhì)酶活性顯著提高的結(jié)果一致[27]。推測(cè)幾丁質(zhì)酶不僅可以抵御病原真菌的侵害，在植物其他抗逆過(guò)程中可能也發(fā)揮了重要作用。因此,ChCHI在SA脅迫條件下表達(dá)量短時(shí)間內(nèi)快速升高，表明它參與了植物抵抗逆境的過(guò)程，具體的作用機(jī)制及基因功能有待下一步試驗(yàn)研究。

[1] HONG J K, HWANG B K. Promoter activation of pepper class: Ⅱ basic chitinase gene,CAChi2, and enhanced bacterial disease resistance and osmotic stress tolerance in theCAChi2-overex-pressingArabidopsis[J]. Planta , 2006, 223(3): 433-448.

[2] 鐘萬(wàn)芳,丁少軍. 細(xì)菌幾丁質(zhì)酶的結(jié)構(gòu)與功能研究進(jìn)展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 40(4): 1-3.

[3] ZHU X, ZHANG H, FUKAMIZO T, et al. Properties ofManducasextachitinase and its C-terminal deletions[J]. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2001, 31(12): 1221-1230.

[4] DEBADITYA B，ANAND N, RAJINDER K G. Bacterial chitinases: properties and potential [J]. Critical Reviews in Biotechnology, 2007, 27(1) : 21-28.

[5] PARK Y S, JEON M H, LEE S H, et al. Activation of defense responses in Chinese cabbage by a nonhost pathogen,Pseudomonassyringaepv. tomato[J]. Journal of Biochemistry and Molecular Biology, 2005, 38: 748-754.

[6] DANA M D L M, CUBERO B. Transgenic tobacco plants overexpressing chitinases of fungal origin show enhanced resistance to biotic and abiotic stress agents[J]. Plant Physiology, 2006, 142(2):722-730.

[7] HIRAMATSU S, FUJIE M, USAMI S, et al. Two catalytic domains of chlorella virus CVR2 chitinase[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2000, 89 (3): 252-257.

[8] 梁元?jiǎng)P, 陳鵬, 李玉紅. 乙烯利誘導(dǎo)黃瓜葉片胞間隙幾丁質(zhì)酶累積的變化[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2012, 21(1): 141-145.

[9] WANG L Y, WANG Y S, CHENG H, et al. Cloning of theAegicerascorniculatumclass:Ⅰchitinase gene (AcCHII) and the response of AcCHIⅠ mRNA expression to cadmium stress[J]. Ecotoxicology, 2015. 24(7):1-9.

[10] STRESSMANN M, KITAO S, G RIFFITH M, et al. Calcium interacts with antifreeze proteins and chitinase from cold-acclimated winter rye[J]. Plant Physiol, 2004, 135: 364-376.

[11] HONG J K, HWANG B K. Induction by pathogen, salt and drought of a basic class： Ⅱchitinase mRNA and its in situ localization in pepper (Capsicumannuum)[J]. Physiol Plant, 2002, 114(4): 549-558.

[12] BRAVO J M, CAMPO S, MURILLO I, et al. Fungus-and wound-induced accumulation of mRNA containing a class： Ⅱchitinase of the pathogenesis-related protein 4 (PR-4) family of maize[J]. Plant Molecular Biology, 2003, 52 (4):745-759.

[13] BROGLIE K E, BIDDLE P, GRESSMAN R, et al. Functional analysis of DNA sequences responsible for ethylene regulation of a bean chitinase gene in transgenic tobacco[J]. The Plant Cell, 1989, 1: 599-607.

[14] HERMANS C, PORCO S, VERBRUGGEN N, et al. Chitinase-like protein CTL1 plays a role in altering root system architecture in response to multiple environmental conditions[J]. Plant Physiol. 2010, 152 (2):904-917.

[15] LI Y C, YANG Y C, HSU J S, et al. Cloning and immunolocalization of an antifungal chitinase in jelly fig (ficus awkeot-sang) achenes[J]. Phytochemistry, 2005, 66 (8): 879-886.

[16] SHAH M R, MUKHERIEE P K, EAPEN S. Expression of a fungal endochitinase gene in transgenic tomato and tobacco results in enhanced tolerance to fungal pathogens[J]. Physiol Mol Biol Plants, 2010 , 16 (1): 39-51.

[17] TAIRA T, TOMA N, ISHIHARA M. Purification, characterization, and antifungal activity of chitinase from pineapple (Ananascomosus) leaf [J]. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 2005, 69 (1):189-196.

[18] SHAH J M, RAGHUPATHY V, VELUTHAMBI K. Enhanced sheath blight resistance in transgenic rice expressing an endochitinase gene fromTrichodermavirens[J]. Biotechnology Letters, 2009, 31(2): 239-244.

[19] JABEEN N, CHAUDHARY Z, GULFRAZ M, et al. Expression of rice chitinase gene in genetically engineered tomato confers enhanced resistance to fusarium wilt and early blight [J]. Plant Pathol Journal, 2015, 31(3):252-258.

[20] KOVACS G, SAGI L, JACON G, et al. Expression of a rice chitinase gene in transgenic banana (‘Gros Michel’, AAA genome group) confers resistance to black leaf streak disease [J]. Transgenic Res, 2013, 22(1): 117-130.

[21] 朱荷琴, 馮自力, 李志芳, 等. 轉(zhuǎn)幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶雙價(jià)基因棉花株系對(duì)黃萎病的抗性[J]. 棉花學(xué)報(bào), 2011, 23(1): 58-63.

[22] GENTILE A, DENG Z, LA M S, et al. Enhanced resistance to phoma tracheiphila and botrytis cinerea in transgenic lemon plants expressing aTrichodermaharzianumchitinase gene[J]. Plant Breeding, 2007, 126(2): 146-151.

[23] 朱偉, 房衛(wèi)平, 謝德意,等. 水楊酸對(duì)NaCl脅迫下抗蟲棉幼苗生長(zhǎng)和生理特性的影響[J] 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 46(5):515-519.

[24] 金一鋒.外源性水楊酸誘導(dǎo)月季對(duì)黑斑病抗性的研究[D]. 哈爾濱: 東北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2013.

[25] 湯曉莉, 薛紅芬, 鄧國(guó)賓,等. 水楊酸誘導(dǎo)馬鈴薯瘡痂病抗性的生理機(jī)制研究[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2010, 23(6): 1851-1854.

[26] 張志忠, 吳菁華, 呂柳新,等. 植物幾丁質(zhì)酶及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2005, 34 (4) : 494-499.

[27] 喬利仙, 劉曉琳, 隋烔明, 等. 黃曲霉病和水楊酸對(duì)花生幾丁質(zhì)酶誘導(dǎo)的研究[J]. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2011, 28(2): 130-132.

(責(zé)任編輯：朱秀英)

MolecularcloningandexpressionanalysisofachitinasegeneChCHIfromChrysanthemummorifolium

CUI Bo1,2， SONG Caixia1， WANG Yingbo1， WANG Ruolan2,3， JIANG Suhua2， LIANG Fang2， YE Yongzhong1

(1.College of Life Sciences，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002，China； 2.Institute of Bioengineering，Zhengzhou Normal College，Zhengzhou 450044，China; 3.School of Life Sciences，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001，China)

According to the conserved sequences of chitinase gene, the chitinase geneChCHIwas isolated from leaf ofChrysanthemummorifoliumusing RT-PCR and RACE method (The accession number in GenBank: KX881373). The full-length cDNA ofCHCHIwas 1385 bp, containing a 960 bp open reading frame which encodes 319 amino acids. Encoding product ofChCHIgene was a kind of hydrophilic and stable protein with a molecular weight of 33.5 kD and isoelectric point of 6.38. Prediction of secondary structure indicated that the protein was mainly composed of alpha helix and random coil. Sequence alignment and phylogenetic analysis showed that the amino acid sequence ofChCHIbelongs to family 19 of glycoside hydrolase. CHCHI was highly identified with the chitinase protein from Mikania micrantha (ACO25187.1) with the similarity of 87%. The results of qRT-PCR analysis showed that the expression level of theChCHIgene in leaves ofChrysanthemummorifoliumwas significantly increased under the SA treatments. The results implied thatChCHIgene may play an important role in the molecular regulation of resistance to environmental stress inchrysanthemummorifolium.

Chrysanthemummorifolium; chitinase gene; gene clone; expression analysis

Q949.718

：A

2016-10-31

鄭州市重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(141PZDGG189)

崔 波(1962-)，男，河南泌陽(yáng)人，教授，博士，主要從事花卉栽培與分子育種方面的研究。

葉永忠(1957-)，男，湖北黃梅人，教授，博士生導(dǎo)師。

1000-2340(2017)02-0218-008