人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體減輕肝臟缺血再灌注損傷及機(jī)制的初步研究

馮嘯陳良張琪楊揚(yáng),3陳規(guī)劃,3張英才,3

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體減輕肝臟缺血再灌注損傷及機(jī)制的初步研究

馮嘯1,2陳良1張琪2,3楊揚(yáng)1,3陳規(guī)劃1,3張英才1,3

目的探討人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體（hucMSCs-exo）對(duì)肝臟缺血再灌注損傷（HIRI）是否具有保護(hù)作用及可能的作用機(jī)制。方法利用貼壁法提取原代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（hucMSCs），超速離心方法提取細(xì)胞培養(yǎng)上清中的外泌體，分別進(jìn)行鑒定；在體外實(shí)驗(yàn)中利用L02細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷模型探究hucMSCs-exo對(duì)細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)水平的影響；在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中建立C57BL/6小鼠70﹪HIRI模型，72只小鼠隨機(jī)分成四組，分別為Sham組（n= 18）、IRI組（n= 18）、PBS 組（n= 18）和 exo 組（n= 18）。術(shù)后第 6 h（n= 6）、12 h（n= 6）及 24 h（n= 6）通過(guò)檢測(cè)血清AST及ALT水平、進(jìn)行肝臟HE染色及CASPASE-3免疫組化實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步探究hucMSCs-exo對(duì)HIRI的作用，多組組間比較采用方差分析。結(jié)果首先成功分離提取原代hucMSCs及hucMSCs-exo并進(jìn)行鑒定；在體外，通過(guò)Western Blot實(shí)驗(yàn)證明hucMSCs-exo可降低L02細(xì)胞缺氧復(fù)氧（1﹪O2缺氧6 h，復(fù)氧2 h）損傷后細(xì)胞凋亡蛋白cleaved-CASPASE-3及cleaved-PARP表達(dá)水平；在體內(nèi)，hucMSCs-exo處理后血清轉(zhuǎn)氨酶水平較IRI組有所降低，這種差異在再灌注 12 h的 AST[（2895.0±998.6）U/Lvs（971.8±797.8）U/L，t= 4.010，P=0.004] 及再灌注24h的 AST[（1926.0±377.2）U/Lvs（597.2±524.8）U/L，t= 5.231，P= 0.000]、ALT[（2074.0±750.3）U/Lvs（555.3±493.8）U/L，t= 4.379，P= 0.002] 中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，肝臟HE染色及肝組織CASPASE-3免疫組化結(jié)果同樣提示hucMSCs-exo可減輕C57BL/6小鼠70﹪HIRI。結(jié)論HucMSCs-exo可通過(guò)抗凋亡機(jī)制減輕HIRI，這為臨床緩解HIRI提供新的治療方向，其具機(jī)制有待進(jìn)行更深入的研究。

間質(zhì)干細(xì)胞； 外泌體； 再灌注損傷

作者單位：510630 廣州，中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院，肝臟移植中心，中山大學(xué)器官移植研究所1；510630 廣州，中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院，細(xì)胞生物治療中心2；510630 廣州，廣東省肝臟疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室3

肝臟缺血再灌注損傷（Hepatic ischemia reperfusion injury，HIRI）是肝切除術(shù)及肝臟移植術(shù)中影響患者肝功能恢復(fù)絨的重要因素，可導(dǎo)致術(shù)后肝功能衰竭、移植物丟失，增加病人并發(fā)癥發(fā)生率及死亡率[1]，如何減輕肝臟手術(shù)的缺血再灌注損傷一直是肝臟外科醫(yī)生面對(duì)的重要問(wèn)題。

目前已經(jīng)有大量研究證實(shí)間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有組織修復(fù)、調(diào)節(jié)免疫及抗炎作用[2-4]，可減輕組織器官缺血再灌注損傷[5-6]。然而由于MSCs治療目前受?chē)?guó)家政策監(jiān)管控制嚴(yán)格，具有低免疫原性及栓塞的風(fēng)險(xiǎn)，且目前還缺乏適當(dāng)?shù)馁A存運(yùn)輸及商品化生產(chǎn)方式，暫時(shí)無(wú)法很好推廣應(yīng)用。因此，尋找一種可以替代MSCs治療的有效細(xì)胞成分是研究的一個(gè)重要思路。

外泌體（exosomes）是一種活細(xì)胞在靜息及應(yīng)激狀態(tài)下分泌的具有雙層脂質(zhì)分子層的囊泡樣結(jié)構(gòu)，直徑約30～150 nm[7]，研究發(fā)現(xiàn)外泌體具有與母體細(xì)胞相似的生物學(xué)特性。本研究旨在驗(yàn)證人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（hucMSCs）來(lái)源外泌體（hucMSCsexo）是否同樣具有保護(hù)肝缺血再灌注損傷的作用及其可能的作用機(jī)制，為臨床緩解HIRI提供新思路。

材料與方法

一、材料

1.細(xì)胞及動(dòng)物：實(shí)驗(yàn)細(xì)胞采用L02人肝細(xì)胞系，購(gòu)自ATCC細(xì)胞庫(kù)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用近交系雄性C57BL/6 小鼠，購(gòu)自南京模式動(dòng)物中心，周齡7～8周，體重22～25 g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，采用SPF級(jí)環(huán)境飼養(yǎng)及手術(shù)。按照中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)委員會(huì)頒布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》相關(guān)規(guī)定對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行處理。

2.人臍帶組織：來(lái)自中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院20～35歲足月剖宮產(chǎn)婦，病毒學(xué)檢測(cè)均為陰性。研究經(jīng)中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并取得產(chǎn)婦及家屬同意。

3.主要試劑與儀器：低糖DMEM培養(yǎng)基、無(wú)糖無(wú)血清培養(yǎng)基、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fi broblast growth factor，bFGF）、成骨成脂實(shí)驗(yàn)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購(gòu)自德國(guó)PAN公司。CD29、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105、CD166 流 式抗體購(gòu)自美國(guó)BD公司。CD9、CD63抗體購(gòu)自Abcam公司。CASPASE-3、PARP抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司。超速離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)Beckman公司，倒置顯微鏡購(gòu)自日本 Nikon 公司，流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。

二、方法

1. hucMSCs及hucMSCs-exo的分離提取及鑒定：采用組織塊貼壁法分離獲取原代hucMSCs，獲取P3代細(xì)胞分別從形態(tài)學(xué)進(jìn)行觀察、流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞表面標(biāo)志 CD29、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105、CD166鑒定、成骨成脂實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分化能力的鑒定。超速離心去除FBS中的外泌體待用。P3-5代huc-MSCs融合至70﹪左右時(shí)將培養(yǎng)基更換為含10﹪去外泌體FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基，48 h后收集上清。利用超速離心方法從hucMSCs培養(yǎng)上清中獲取hucMSCs-exo，分別進(jìn)行電鏡、粒徑分析及蛋白CD9、CD63的鑒定。利用BCA蛋白定量法對(duì)獲取的外泌體進(jìn)行定量。

2.體外實(shí)驗(yàn)：L02人肝細(xì)胞系，采用無(wú)糖無(wú)血清培養(yǎng)基缺氧（1﹪ O2，5﹪ CO2，94﹪N2）培養(yǎng) 6 h、復(fù)氧2 h條件建立體外缺氧復(fù)氧模型，設(shè)立對(duì)照組（control組），缺氧復(fù)氧組（H/R 組），10 μg/ml外泌體處理組、100 μg/ml外泌體處理組。Western Blot驗(yàn)證細(xì)胞不同條件下凋亡蛋白表達(dá)水平。

3.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：采用C57BL/6小鼠建立70﹪肝缺血再灌注損傷模型。72只小鼠隨機(jī)分成4組，分別為 Sham 組（n= 18）、IRI組（n= 18）、PBS 組（n= 18）和 exo 組（n= 18）。術(shù)后第 6 h（n= 6）、12 h（n= 6）及24 h（n= 6）采集血清和肝臟標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。術(shù)前禁食不禁水，氯胺酮混合麻醉劑麻醉后，腹正中切口進(jìn)腹，暴露肝左葉及中葉肝蒂并以動(dòng)脈夾夾閉。sham組僅進(jìn)行開(kāi)關(guān)腹處理，IRI組缺血90 min后不進(jìn)行門(mén)靜脈注射，PBS組及exo組分別于再灌注時(shí)經(jīng)門(mén)靜脈注射100 μl PBS溶液和含100 μghucMSCs-exo的 PBS 溶液 100 μl。90 min缺血過(guò)程將小鼠置于保溫板上，并注意保持肝臟及腸管濕潤(rùn)。

4.標(biāo)本收集及檢測(cè)：（1）再灌注時(shí)間結(jié)束時(shí)，麻醉小鼠后眼球取血。全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清AST及ALT；（2）取血后開(kāi)腹取肝臟組織，剪取合適大小肝左葉及中葉于多聚甲醛中固定。石蠟包埋切片并進(jìn)行HE染色及免疫組化檢測(cè)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件、GraphPad Prism及Image Pro Plus進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，肝功能指標(biāo)以表示，多組間比較采用方差分析。以P＜ 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、hucMSCs的鑒定

從形態(tài)學(xué)上觀察分離提取的細(xì)胞呈現(xiàn)典型的長(zhǎng)梭形或紡錘形；流式細(xì)胞技術(shù)鑒定其表型可見(jiàn)細(xì)胞高表達(dá) CD29、CD44、CD73、CD90、CD105，同時(shí)低表達(dá)造血系細(xì)胞標(biāo)記CD34、CD45及T細(xì)胞、單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志CD166（圖1）。分化實(shí)驗(yàn)顯示成脂誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞利用油紅O染色顯現(xiàn)出位于細(xì)胞內(nèi)部的脂滴，成骨誘導(dǎo)分化的細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)與茜素紅形成復(fù)合物而顯現(xiàn)出的鈣質(zhì)沉積（圖2）。

二、hucMSCs-exo的鑒定

對(duì)超速離心法分離的到的hucMSCs-exo進(jìn)行鑒定，可見(jiàn)nanosight粒徑分析顯示其直徑分布的峰值位于121 nm（圖3），Western Blot鑒定其中含有外泌體標(biāo)志性蛋白 CD9、CD63、HSP90（圖 4），電鏡下觀察hucMSCs-exo呈現(xiàn)類圓形具有脂質(zhì)雙分子層的囊泡結(jié)構(gòu)，大小30～150 nm（圖5）。

圖1 流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)記物的鑒定結(jié)果

圖2 光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞成骨成脂實(shí)驗(yàn)結(jié)果（×100）

圖3 hucMSCs-exo的nanosight粒徑分析結(jié)果

圖4 hucMSCs-exo的Western Blot鑒定結(jié)果

圖5 透射電鏡下hucMSCs-exo的形態(tài)

三、L02缺氧復(fù)氧損傷的凋亡水平檢測(cè)

H/R組細(xì)胞凋亡蛋白cleaved-CASPASE-3及cleaved-PARP表達(dá)水平較control組細(xì)胞明顯升高；100 μg/ml的 hucMSCs-exo作用下，L02細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷后凋亡蛋白的表達(dá)水平較H/R組下降；而經(jīng)10 μg/ml的hucMSCs-exo處理后，L02細(xì)胞的凋亡蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯變化（圖6）。

四、小鼠HIRI后肝功能的變化

IRI組小鼠血清AST及ALT水平明顯高于sham組，同時(shí)與PBS組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；exo組AST及ALT水平則低于同一再灌注時(shí)間的IRI組，這種差異在再灌注24 h的AST[IRI組（1926.0±377.2）U/Lvsexo 組（597.2±524.8）U/L]、ALT[IRI組（2074.0±750.3）U/Lvsexo 組（555.3±493.8）U/L和再灌注12 h的AST[IRI組（2895.0±998.6）U/Lvsexo組（971.8±797.8）U/L]中差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）（表1，2）。

表1 hucMSCs-exo對(duì)小鼠HIRI后血清AST水平的影響（U/L，±s）

表1 hucMSCs-exo對(duì)小鼠HIRI后血清AST水平的影響（U/L，±s）

注：每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各6只；與IRI組相比aP＜0.05

再灌注時(shí)間（h）6 h 12 h 24 h Sham 組 18 78.7±11.5 87.7±9.1 86.8±13.9 IRI組 18 5797.0±953.7 2895.0±998.6 1926.0±377.2 PBS組 18 5476.0±2106.0 2702.0±1062.0 1974.0±596.6 exo 組 18 4672.0±697.4 971.8±797.8a597.2±524.8aF值 29.140 16.100 28.090P值 ＜ 0.01 ＜ 0.01 ＜ 0.01分組 動(dòng)物數(shù)

表2 hucMSCs-exo對(duì)小鼠HIRI后血清ALT水平的影響（U/L，±s）

表2 hucMSCs-exo對(duì)小鼠HIRI后血清ALT水平的影響（U/L，±s）

注：每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各6只；與IRI組相比aP＜0.05

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五、小鼠肝臟HE染色

IRI組小鼠肝臟HE染色相較sham組可見(jiàn)到更明顯的細(xì)胞腫脹、空泡樣變性、紅細(xì)胞浸潤(rùn)、嗜伊紅細(xì)胞增多、肝細(xì)胞壞死表現(xiàn)，鈴木評(píng)分具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜ 0.05）；PBS 組肝臟 HE 染色與 IRI組變化相近，鈴木評(píng)分無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；在再灌注12 h及24 h，exo組病理改變與IRI組相比有所減輕，鈴木評(píng)分具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜ 0.05）（圖 7，表3）。

圖6 不同劑量hucMSCs-exo對(duì)L02細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷凋亡蛋白表達(dá)水平的影響

表3 hucMSCs-exo對(duì)小鼠HIRI后肝組織鈴木評(píng)分的影響（±s）

表3 hucMSCs-exo對(duì)小鼠HIRI后肝組織鈴木評(píng)分的影響（±s）

注：每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各6只；與IRI組相比aP＜0.05

鈴木評(píng)分6 h 12 h 24 h Sham 組 18 0.4±0.5 0.2±0.4 0.2±0.4 IRI組 18 2.0±1.0 4.6±1.5 6.6±1.1 PBS 組 18 1.8±0.8 3.8±1.3 6.4±1.1 exo 組 18 1.6±0.5 2.4±0.5a 3.2±1.3aF值 3.430 13.170 30.930P值 0.027 0.000 0.000分組 動(dòng)物數(shù)

六、小鼠肝臟組織CASPASE-3免疫組化檢測(cè)

IRI組CASPASE-3表達(dá)水平明顯高于sham組，而IRI組與PBS組表達(dá)水平無(wú)明顯差別，在再灌注12 h及24 h，exo組肝臟組織CASPASE-3表達(dá)水平較IRI組明顯減輕（圖8）。

討 論

HIRI在肝臟外科手術(shù)中十分常見(jiàn)，尤其是在肝切除術(shù)Pringle法阻斷開(kāi)放肝門(mén)及肝臟移植術(shù)血流阻斷再通過(guò)程中，是肝臟外科手術(shù)難以避免的問(wèn)題。HIRI可造成肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞水平的凋亡壞死[8]，在臨床上則可導(dǎo)致患者術(shù)后肝功能衰竭、移植肝無(wú)功能、移植物丟失。

HIRI一直是專家學(xué)者們關(guān)注的熱點(diǎn)，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期探索研究，總結(jié)出多種減輕HIRI的方法，包括基因水平的改造、抗氧化應(yīng)急藥物的應(yīng)用、缺血預(yù)處理等等。MSCs近年來(lái)同樣也被證實(shí)具有保護(hù)組織器官I(mǎi)RI的作用，但目前尚停留在基礎(chǔ)研究及前期臨床試驗(yàn)階段，由于受到國(guó)家政策監(jiān)管、本身的栓塞風(fēng)險(xiǎn)及不能商品化生產(chǎn)運(yùn)輸?shù)榷喾N因素的限制，還無(wú)法在臨床上推廣應(yīng)用。外泌體作為一種活細(xì)胞分泌的納米級(jí)囊泡，近年來(lái)稱為研究的熱點(diǎn)，被學(xué)者們廣泛關(guān)注。它不具有細(xì)胞結(jié)構(gòu)，不存在栓塞風(fēng)險(xiǎn)并且便于貯存運(yùn)輸，因而可有效規(guī)避細(xì)胞治療的限制因素，同時(shí)研究證實(shí)外泌體具有母體細(xì)胞相似的生物學(xué)作用。目前已有研究證實(shí)外泌體在心臟、腎臟缺血再灌注損傷中具有保護(hù)作用[9-10]。

本研究在體外實(shí)驗(yàn)中利用L02缺氧復(fù)氧模型進(jìn)行hucMSCs-exo的功能驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)hucMSCsexo具有保護(hù)L02肝細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的作用，在100 μg/ml的hucMSCs-exo處理后這種作用明顯顯現(xiàn)出來(lái)，證明這種保護(hù)作用具有劑量依賴性。此外，值得一提的是本研究對(duì)各再灌注時(shí)間肝功能檢測(cè)結(jié)果提示，再灌注6 h肝功能指標(biāo)最高，而后逐漸下降，這一趨勢(shì)與肝臟CASPASE-3的表達(dá)水平一致。但HE染色及鈴木評(píng)分結(jié)果提示肝臟組織病理變化趨勢(shì)與肝功能及免疫組化結(jié)果并不一致。進(jìn)一步分析這種現(xiàn)象的發(fā)生原因，是由于AST、ALT、CASPASE-3表達(dá)水平均體現(xiàn)早期肝細(xì)胞損傷程度，雖然肝細(xì)胞損傷已經(jīng)逐漸減輕，但由于病理改變滯后，隨著再灌注時(shí)間延長(zhǎng)，病理變化逐漸積累，因此再灌注24 h表現(xiàn)更明顯。

圖7 光學(xué)顯微鏡下觀察hucMSCs-exo對(duì)小鼠HIRI后肝組織的影響（HE染色，×200）

圖8 光學(xué)顯微鏡下觀察hucMSCs-exo對(duì)小鼠HIRI后肝組織凋亡水平的影響（DAB染色，×200）

從實(shí)驗(yàn)小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶水平來(lái)看，hucMSCsexo處理后的血清轉(zhuǎn)氨酶水平明顯降低，證明其對(duì)小鼠HIRI具有保護(hù)作用，HE染色及鈴木評(píng)分進(jìn)一步證實(shí)了這種作用。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)hucMSCs-exo處理后L02細(xì)胞及肝組織的凋亡水平均有所降低，證明hucMSCs-exo對(duì)HIRI的保護(hù)可通過(guò)抗凋亡作用發(fā)揮。

雖然實(shí)驗(yàn)初步證明抗凋亡為hucMSCs-exo發(fā)揮保護(hù)作用的可能途徑，但仍需更深入的機(jī)制研究。外泌體是由活細(xì)胞所分泌的納米級(jí)囊泡，可通過(guò)傳遞細(xì)胞內(nèi)的某些蛋白質(zhì)及核酸分子發(fā)揮生物學(xué)作用，因此今后可以對(duì)hucMSCs-exo所攜帶的蛋白質(zhì)及核酸分子進(jìn)行分析，找出其有效成分及發(fā)揮重要作用的細(xì)胞信號(hào)通路，甚至可以分離或人工合成某些有效分子成分進(jìn)而更直接地達(dá)到減輕HIRI的目的；同時(shí)對(duì)細(xì)胞細(xì)胞自噬水平的改變、離子通道活性的調(diào)節(jié)、活性氧物質(zhì)或糖類物質(zhì)代謝的影響等均可產(chǎn)生減輕細(xì)胞凋亡水平結(jié)果；此外，值得注意的是目前仍不能明確hucMSCs-exo對(duì)HIRI的保護(hù)是否僅僅通過(guò)抗凋亡作用實(shí)現(xiàn)，很可能存在其他機(jī)制同樣發(fā)揮著保護(hù)HIRI的重要作用，例如促進(jìn)肝臟細(xì)胞增生的作用。深入的機(jī)制研究對(duì)hucMSCsexo的臨床推廣應(yīng)用具有重要意義。

綜上所述，通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)hucMSCs-exo可有效緩解肝臟缺血再灌注損傷，這種保護(hù)作用可通過(guò)減輕肝細(xì)胞凋亡水平發(fā)揮。hucMSCs-exo有望成為臨床防治肝臟缺血再灌注損傷的新方式，但仍需進(jìn)行更深入機(jī)制研究及臨床實(shí)驗(yàn)。

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Exosomes secreted from human umbilical cord mecenchymal stem cells alleviate hepatic ischemia reperfusion injury

Feng Xiao1,2, Chen Liang1, Zhang Qi2,3, Yang Yang1,3, Chen Guihua1,3,Zhang Yingcai1,3. Liver Transplant Center of the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University,Organ Transplantation Research Center of Guangdong Province, Guangzhou 510630, China1;Biotherapy Centre of the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510630,China2;Guangdong Key Laboratory of Liver Disease Research, The Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510630, China3

ObjectiveTo identify the function of human umbilical cord derived exosomes（hucMSCs-exo）in hepatic ischemia reperfusion injury（HIRI）and the underlying mechanisms.Methods HucMSCs were isolated from human umbilical cord using tissue block adhering wall method and hucMSCs-exo were isolated from conditioned medium of hucMSCs through ultracentrifugation. Then, we evaluated the function of hucMSCs-exo bothin vivoandin vitrousing C57BL/6 mice 70﹪ HIRI model and L02 hypoxia/reoxygenation model. 72 mice were randomly divided into the sham, IRI, PBS and exo groups（n=18 at each group）.Blood and liver samples were collected at hour 6, 12 and 24（6 mice at each time point）post IRI respectively to test enzyme activities, biochemical and histological changes. Western Blot assay was used for apoptotic proteins detection. Levels of serum AST and ALT were observed. Liver tissues were collected for HE staining and CASPASE-3 immunohistochemistry assay. Data between each group were compared by ANOVA.ResultsAfter isolation and identification of hucMSCs and hucMSCs-exo, we found that hucMSCsexo decreased the level of apoptotic proteins cleaved-CASPASE-3 and cleaved-PARP of L02 after hypoxia/reoxygenation injury.In vivo, the levels of serum liver enzymes showed a remarkable decrease in AST in 12 h（2895.0±998.6 U/Lvs971.8±797.8 U/L,t= 4.010,P= 0.004）and in ALT（2074.0±750.3 U/Lvs555.3±493.8 U/L,t= 4.379,P= 0.002）and AST（1926.0±377.2 U/L vs 597.2±524.8 U/L,t= 5.231,P= 0.000）in 24 h for IRI group after the administration of hucMSCsexo. HE staining and immunohistochemistry assay of liver tissue also proved that hucMSCs-exo alleviate 70﹪ HIRI model of C57BL/6 mice.ConclusionHucMSCs-exo showed a protective effect on HIRI via down-regulating the level of apoptosis, which could provide a new promising way for treating HIRI for clinical practice, even though the mechanism needs to be further investigated.

Mesenchymal stem cells; Exosomes; Reperfusion injury

Zhang Yingcai , Email: zhangyc3@mail.sysu.edu.cn

2017-06-07）

（本文編輯：陳媛媛）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2017.04.007

國(guó)家自然科學(xué)基金（81370575、81570593、81370555）；廣東省自然科學(xué)基金（2015A030312013）；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014B020228003、2014B030301041、2015B020226004、2017A020215023）；廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目 -健康醫(yī)療協(xié)同創(chuàng)新重大專項(xiàng)（201508020262，201400000001-3）；中山大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)研究5010項(xiàng)目（2014006）；中山大學(xué)青年教師培育項(xiàng)目（17ykpy57）

張英才，Email：zhangyc3@mail.sysu.edu.cn

馮嘯，陳良，張琪，等.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體減輕肝臟缺血再灌注損傷及機(jī)制的初步研究[J/CD].中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志（電子版），2017，7（4）：224-230.