骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對大鼠血管性癡呆模型GAT1的調(diào)節(jié)作用研究

龍乾發(fā)羅強田曄劉衛(wèi)平黑悅

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對大鼠血管性癡呆模型GAT1的調(diào)節(jié)作用研究

龍乾發(fā)1羅強1田曄1劉衛(wèi)平2黑悅2

目的探索骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）移植對大鼠血管性癡呆模型中γ氨基丁酸轉(zhuǎn)運體（GAT）1的調(diào)節(jié)作用。方法體外分離純化SD大鼠BMSCs，雙側(cè)頸內(nèi)動脈持續(xù)結(jié)扎建立大鼠血管性癡呆模型后經(jīng)尾靜脈注射5×106BMSCs，4周后通過免疫組織化學(xué)和免疫印跡實驗檢測大鼠腦內(nèi)GAT1的表達(dá)變化，單因素方差分析檢驗各組表達(dá)差異，組間數(shù)據(jù)多重比較采用Student'st檢驗。結(jié)果對照組（大鼠血管性癡呆模型接受PBS注射）海馬和皮層的GAT1表達(dá)較假手術(shù)組（暴露雙側(cè)頸內(nèi)動脈未結(jié)扎）明顯降低（P＜ 0.01）。BMSCs移植4周后，蛋白灰度值分析結(jié)果顯示大鼠血管性癡呆模型海馬部位的GAT1表達(dá)（0.32±0.06）較對照組（0.18±0.03）明顯增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t= 10.68，P= 0.002），免疫組化結(jié)果顯示GAT1陽性細(xì)胞在海馬 CA1 區(qū)（43.10±2.87）個較對照組（24.30±3.97）個明顯增多（t= 18.99，P= 0.001，）。細(xì)胞移植后皮層部位GAT1的表達(dá)[蛋白灰度值：0.55±0.04，陽性細(xì)胞量：（49.15±2.78）個]較對照組[蛋白灰度值：0.51±0.03，陽性細(xì)胞量：（47.82±3.27）個]無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t= 6.49，3.50；P= 0.12，0.39）。結(jié)論BMSCs移植有助于大鼠血管性癡呆模型海馬（尤其是CA1區(qū)）GAT1的表達(dá)水平增高。

癡呆，血管性； 骨髓； 間質(zhì)干細(xì)胞； γ氨基丁酸

血管性癡呆（vascular dementia，VaD）是指由出（缺）血性卒中引起腦灌注不足繼而引發(fā)的認(rèn)知功能障礙綜合征，其病理機(jī)制可能涉及谷氨酸毒性、氧化性應(yīng)激和神經(jīng)炎癥等[1-3]。研究表明血管性癡呆模型中γ氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）系統(tǒng)明顯受損[4]，而GABA能系統(tǒng)則負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)谷氨酸GABA的興奮性平衡，因此提示針對GABA能系統(tǒng)損傷的治療對VaD模型轉(zhuǎn)歸具有積極意義。前期研究發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）移植可以通過抑制GABA能神經(jīng)元受損和上調(diào)GABA受體促進(jìn)VaD模型的認(rèn)知功能改善[5]，同時GABA轉(zhuǎn)運體（GABA transporter，GAT）1～4 作為 GABA 能系統(tǒng)的重要組成部分，對細(xì)胞外GABA濃度及相應(yīng)突觸功能具有重要作用，且大部分GABA的重吸收都有賴于GAT1的功能[6]。不僅如此，GAT1表達(dá)抑制將直接影響到海馬相關(guān)學(xué)習(xí)記憶功能[6]，因此推測BMSCs移植改善VaD模型的認(rèn)知功能涉及GAT1在海馬中的表達(dá)變化?？紤]持續(xù)雙側(cè)大腦中動脈結(jié)扎（permanent bilateral occlusion of the common carotid arteries，2VO）能有效模擬腦灌注不足和認(rèn)知功能障礙，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于VaD的實驗研究[4,7]。因此，本實驗繼續(xù)應(yīng)用2VO建模方法探索BMSCs移植對海馬GAT1的生物學(xué)影響，嘗試發(fā)掘更多BMSCs移植改善VaD模型認(rèn)知功能障礙的機(jī)制。

材料與方法

一、實驗動物及試劑

45只4～6周雄性SD大鼠購于第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，動物飼養(yǎng)及操作均遵循實驗動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。Histopaques-1077分離液購于美國 Sigma-Aldrich公司，兔抗 CD105、CD90、CD73、CD34和CD11b均購于北京博奧森公司，驢抗兔A488購于美國Invitrogen公司，BMSCs多向分化檢測試劑盒購于美國Gibco公司，兔抗GAT 1購于美國Abcam公司。

二、方法

1. BMSCs分離培養(yǎng)及鑒定：BMSCs分離培養(yǎng)及鑒定詳細(xì)步驟同筆者前面所報道[4]。簡述如下，5只SD大鼠麻醉充分后，解剖雙下肢，收集骨髓后加入等體積的Histopaques-1077（Sigma-Aldrich）分離液，400×g離心25 min收集骨髓單核細(xì)胞，標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基（αMEM+10﹪FBS）貼壁培養(yǎng)（37℃，5﹪CO2），細(xì)胞融合達(dá) 70﹪～ 80﹪ 后傳代。BMSCs鑒定使用流式細(xì)胞術(shù)和多能性誘導(dǎo)，流式細(xì)胞術(shù)所用一抗為兔抗CD105、CD90、CD73、CD34和CD11b（均購置北京博奧森公司，使用濃度1:100），二抗為驢抗兔 A488（1:500）（美國 Invitrogen，A-21206）。BMSCs多向分化檢測應(yīng)用成骨（美國Gibco公司，A1007201）、成軟骨（美國 Gibco公司，A1007101）或成脂肪（美國Gibco公司，A1007001）分化試劑盒。細(xì)胞移植取第3代BMSCs。

2.血管癡呆模型建立和細(xì)胞移植：實驗步驟同前所報道[5]，40只SD大鼠經(jīng)10﹪水合氯醛麻醉充分后，仰臥固定，頸部正中切口解剖暴露雙側(cè)頸總動脈和迷走神經(jīng)，6號絲線近心端持續(xù)結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈（假手術(shù)組解剖暴露但不結(jié)扎血管），注意不要牽拉迷走神經(jīng)。術(shù)后6 h應(yīng)用Longa五級四分法評估，1～3分模型納入后續(xù)試驗。模型建立3 h后實驗組（n= 14）接受 5×106BMSCs（500 μl PBS 稀釋）尾靜脈注射，對照組（n= 14）和假手術(shù)組（n= 12）分別接受500 μl PBS尾靜脈注射。

3.免疫組織化學(xué)：SD大鼠注射細(xì)胞或PBS 4周后，實驗組（n= 7）、對照組（n= 7）和假手術(shù)組（n= 6）分別斷頭取腦組織，4﹪多聚甲醛固定并石蠟包埋，冠狀位石蠟切片（厚度2 μm），組織切片（選擇前囟后2.64～5.40 mm部位[4]）經(jīng)二甲苯脫蠟和酒精水化后，檸檬酸高溫高壓修復(fù)抗原，3﹪過氧化氫處理，10﹪驢血清封閉后加兔抗GAT 1（1:200）（ab177483）4 ℃冰箱孵育過夜，PBS漂洗后應(yīng)用熒光二抗驢抗兔A 488（1:500）（A-21206）室溫孵育2 h，DAPI封片，熒光顯微鏡（BX53，日本奧林巴斯）觀察照相，每只大鼠隨機(jī)選取切片5片，計數(shù)應(yīng)用Image-Pro plus 6.0（20×）。陰性對照用PBS替代一抗。

4.免疫印跡實驗：剩余各組大鼠（實驗組，n=7；對照組，n= 7；假手術(shù)組，n= 6）斷頭取腦組織，分離皮層與海馬，分別利用RIPA裂解液抽提蛋白，BCA試劑盒（Pierce公司）定量，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）（110 V，40 min）電泳，轉(zhuǎn)膜并脫脂奶粉封閉，兔抗GAT 1（1:1 000）或兔抗β-actin（1:3 000）4 ℃冰箱孵育過夜，而后HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG作用1 h探測特異性抗原，ECL免疫印跡檢測系統(tǒng)分析照相。PBS替代一抗作為陰性對照，β-actin為參考值，灰度值分析膠片取相近部位，每組6片，分析軟件使用Quantity One 4.6.2。

三、統(tǒng)計學(xué)分析方法

使用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，各組海馬區(qū)的平均GAT1陽性細(xì)胞量和蛋白灰度比值的表達(dá)采用，統(tǒng)計分析使用One way ANOVA并Bonferroni和SNK檢驗，組間GAT1表達(dá)差異的多重比較采用Student'st檢驗。以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、BMSCs培養(yǎng)鑒定

原代BMSCs經(jīng)貼壁培養(yǎng)1周后即可傳代，第2代基本純化，第3～5代形態(tài)較為均一，生長穩(wěn)定。流式細(xì)胞術(shù)檢測第3代BMSCs強表達(dá)CD105（99.2﹪），CD73（98.9﹪）和 CD90（98.2﹪），基本不表達(dá)CD34（0.33﹪）和 CD11b（0.74﹪）。BMSCs經(jīng)多能誘導(dǎo)試劑盒誘導(dǎo)結(jié)果顯示具有成骨、成軟骨和成脂肪分化特性。綜合提示移植細(xì)胞符合BMSCs的鑒定標(biāo)準(zhǔn)和一般生物學(xué)特性。

二、GAT1免疫組化表達(dá)結(jié)果

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示SD大鼠經(jīng)雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎（對照組）4周后，GAT1陽性細(xì)胞在海馬CA1（圖 1a）、CA3和齒狀 回（dentate gyrus，DG）（圖 1d）及皮層（圖2a）相比假手術(shù)組均呈現(xiàn)減少。BMSCs經(jīng)尾靜脈注射（實驗組）4周后，GAT1陽性細(xì)胞在海馬CA1區(qū)（圖1c）較對照組（圖1a）增多，但在海馬CA3、DG（圖1f）及皮層（圖2c）這種增多趨勢則不明顯。對照組海馬CA1、CA3、DG和皮層的平均GAT1陽性細(xì)胞數(shù)明顯低于假手術(shù)組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（表1，P＜ 0.05）。BMSCs移植后，盡管GAT1陽性細(xì)胞數(shù)在海馬CA1、CA3、DG和皮層較對照組均有增多，但是僅海馬CA1區(qū)的GAT1變化差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（表1，P＜ 0.01）。因此結(jié)果提示BMSCs移植可提升VaD模型海馬CA1區(qū)GAT1的表達(dá)水平。

圖1 熒光顯微鏡下觀察海馬GAT1的表達(dá)（免疫熒光染色，×400）

三、GAT1免疫印跡表達(dá)結(jié)果

免疫印跡結(jié)果顯示對照組蛋白條帶灰度在海馬和皮層均較假手術(shù)組減弱，BMSCs移植4周后，實驗組海馬部分的蛋白條帶灰度較對照組增強，但是在皮層部分區(qū)別不明顯（圖3）。GAT1與β-actin的灰度分析值比較結(jié)果顯示，對照組比值較假手術(shù)組明顯降低（海馬及皮層：P均 ＜ 0.01），實驗組比值在海馬部位較對照增加（P= 0.002），但是在皮層部位與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（表2）。因此結(jié)果支持BMSCs移植有助于抑制VaD模型海馬GAT1的表達(dá)降低。

圖2 熒光顯微鏡下觀察皮層GAT1的表達(dá)（免疫熒光染色×400）

表1 各組平均GAT1陽性細(xì)胞量在海馬區(qū)和皮層的分布（個，±s）

表1 各組平均GAT1陽性細(xì)胞量在海馬區(qū)和皮層的分布（個，±s）

注：與對照組相比，aP＜ 0.05

分組 動物數(shù) CA1 CA2+CA3 DG 皮層對照組 7 24.30 ± 3.97 38.00 ± 4.27 35.00 ± 15.74 47.82 ± 3.27假手術(shù)組 6 47.40 ± 5.36a 54.20 ± 4.78 57.30 ± 6.88 54.61 ± 3.15a實驗組 7 43.10 ± 2.87a 40.10 ± 1.79 39.60 ± 2.45 49.15 ± 2.78aF值 73.41 37.48 17.24 11.42P值 ＜ 0.01 ＜ 0.01 ＜ 0.01 ＜ 0.01

圖3 Western blot結(jié)果

討 論

間充質(zhì)干細(xì)胞因其具有低免疫原性、易分離培養(yǎng)、低致瘤性、旁分泌作用、免疫調(diào)節(jié)功能、多向分化趨向等生物學(xué)特性，現(xiàn)已得到越來越多基礎(chǔ)應(yīng)用和臨床研究所關(guān)注[8-10]。研究表明BMSCs對癲癇、慢性腦灌注不足等誘發(fā)的海馬GABA能系統(tǒng)損傷具有重要保護(hù)作用，相關(guān)細(xì)胞治療機(jī)制通過抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化和代謝調(diào)節(jié)等[5,11]。最近研究發(fā)現(xiàn)BMSCs移植可通過抑制慢性腦灌注不足（即血管性癡呆）模型GABA能細(xì)胞損傷或上調(diào)GABA受體改善其學(xué)習(xí)記憶功能[5,12]，在此基礎(chǔ)上，本實驗進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)雙側(cè)頸內(nèi)動脈持續(xù)結(jié)扎將導(dǎo)致海馬和皮層GABA轉(zhuǎn)運體（GAT1）的表達(dá)降低。2VO操作所涉及的GABA能系統(tǒng)損傷包括谷氨酸脫羧酶（glutamic acid decarboxylase，GAD）67的降低，而GAD67為中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)GABA的合成按鈕[13]，顯然GAD67的降低將導(dǎo)致GABA合成障礙進(jìn)而引起GABA分泌減少。GAT1則主要負(fù)責(zé)GABA的重吸收[6]，GAD67神經(jīng)元損傷早期可能由于代償補充細(xì)胞內(nèi)的GABA水平反應(yīng)性增加，但隨著時間的延長，由于GABA在VaD模型中分泌減少，可能最終導(dǎo)致GAT1失代償而表達(dá)水平下降。因此提示GAD67與GAT1在中樞神經(jīng)GABA能系統(tǒng)中具有協(xié)同作用，但具體機(jī)制尚待深入研究。

表2 3組GAT1與β-actin的灰度分析值比較

研究表明海馬GAT1的失活將導(dǎo)致海馬依賴性的學(xué)習(xí)記憶功能障礙[14]，提升GAT1在海馬中的表達(dá)活性將有助于其功能恢復(fù)[14-15]。本實驗結(jié)果顯示VaD模型經(jīng)BMSCs移植4周后，海馬部分GAT1的表達(dá)水平較對照組明顯升高，尤其是在海馬的CA1區(qū)。同時考慮海馬CA1區(qū)的椎體神經(jīng)元對于時空學(xué)習(xí)記憶起著關(guān)鍵作用[16]。綜合以上結(jié)果表明BMSCs移植改善VaD模型認(rèn)知功能另一個可能機(jī)制為上調(diào)海馬CA1區(qū)GAT1的表達(dá)水平。但同時需要注意到，盡管GAT1的表達(dá)水平在海馬和皮層均有減低，但是BMSCs移植后，僅見海馬CA1區(qū)較對照組升高。BMSCs移植后向腦內(nèi)遷移并未局限于海馬或某一個亞區(qū)，而是向整個皮層和海馬遷移[5]。因此推測BMSCs對GAT1的調(diào)節(jié)并非直接作用，而是通過海馬GABA能神經(jīng)元保護(hù)，發(fā)揮與GAT1的協(xié)同作用使其表達(dá)增高。因為大量研究顯示間充質(zhì)干細(xì)胞對海馬神經(jīng)元損傷的保護(hù)多以CA1區(qū)為著[17-18]，且筆者最近研究也發(fā)現(xiàn)BMSCs對VaD模型海馬CA1區(qū)GABA能神經(jīng)元保護(hù)作用明顯[5]。因此證實VaD模型經(jīng)BMSCs移植后，GAT1表達(dá)水平的增高可能源于BMSCs對海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的保護(hù)，并最終改善協(xié)同改善VaD模型的學(xué)習(xí)記憶功能。

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Regulatory role of bone marrow mesenchymal stem cell on γ-aminobutyric acid transporter1 in a rat model of vascular dementia

Long Qianfa1, Luo Qiang1, Tian Ye1, Liu Weiping2, Hei Yue2.1Department of Neurosurgery, Xi'an Central Hospital, Xi'an 710004, China;2Department of Neurosurgery; Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710032, China

ObjectiveTo explore the regulatory role of bone marrow mesenchymal stem cells（BMSCs）on γ-aminobutyric acid transporter（GAT）1 in a rat model of vascular dementia.Methods BMSCs were isolated from 4～6weeks SD rats, and vascular dementia model was induced by bilateral internal carotid artery ligation followed by intravenous injection of 5×106BMSCs. 4 weeks later, immunohistochemistry and Western blot assay were employed to detect the expression of GAT1 in the brain of rats. One-way ANOVA was used when three groups were compared, and Student'sttest was used in comparison between the two groups.ResultsThe expression of GAT1 in the hippocampus and cortex of the control group（rat model

PBS injection）was decreased significantly（P＜ 0.01）compared with the sham group（exposed bilateral carotid artery without ligation）. 4 weeks after BMSCs transplantation, Western blot results showed that the ratio of gray value（GAT1）in the hippocampus（0.32±0.06）was increased significantly（t= 10.68，P= 0.002）in comparison to the control group（0.18±0.03）, and immunohistochemical results manifested that the number of GAT1 positive cells（43.10±2.87）was increased specifically（t= 18.99，P= 0.001）in the hippocampal CA1 area compared with the control group（24.30±3.97）.

After cell transplantation, the expression of GAT1 in the cortical area（ratio of gray value: 0.55±0.04,number of GAT1 positive cells: 49.15±2.78）did not present significant change（t= 6.49, 3.50;P=0.12, 0.39）in comparison to the control group（ratio of gray value: 0.51±0.03, number of GAT1 positive cells: 47.82±3.27）. Conclusion BMSCs transplantation is capable of improving the GAT1 expression in the hippocampus（especially in the CA1 region）in a rat model of vascular dementia.

Dementia, vascular; Bone marrow; Mesenchymal stem cells; Gammaaminobutyric acid

s: Long Qianfa, Email: lonva@live.cn

作者單位：710004 西安市中心醫(yī)院神經(jīng)外科1；710032 西安，第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院神經(jīng)外科2

2016-08-05）

（本文編輯：陳媛媛）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2017.04.004

陜西省科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計劃項目（2014KJXX-29）；西安市科技計劃項目（SF1423-2）

龍乾發(fā)，Email：lonva@live.cn

龍乾發(fā)，羅強，田燁，等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對大鼠血管性癡呆模型GAT1的調(diào)節(jié)作用研究[J/CD].中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志（電子版），2017，7（4）：208-213.