固相萃取HPLC法測(cè)定保健食品中的阿魏酸含量

馬桂娟+朱燕燕

摘要：建立固相萃取HPLC法測(cè)定保健食品中阿魏酸含量的檢測(cè)方法。樣品中阿魏酸經(jīng)甲醇-甲酸（95∶5）提取后，經(jīng)Dionex OnGuard II RP柱凈化。以1%乙酸溶液—甲醇（55∶45）為流動(dòng)相，采用ZORBAX Eclipse XDB-C18柱（250 mm×4. 6 mm×5μm）分離，用DAD檢測(cè)器在320 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明：阿魏酸的線性范圍在5～50μg/mL，樣品平均加標(biāo)回收率在96.6%（n=6），RSD小于5%，最低定量檢出限為0.3 mg/100g。該方法具有快速、靈敏、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，能滿(mǎn)足實(shí)際工作的需要。

關(guān)鍵詞：固相萃??；高效液相色譜；保健食品；阿魏酸

中圖分類(lèi)號(hào)： R97 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A DOI編號(hào)： 10.14025/j.cnki.jlny.2017.18.019

阿魏酸具有抗氧化和清除自由基、抗血栓、降血脂、防治冠心病、抗菌、抗病毒、抗病變和防癌等作用[1]，是用于改善免疫力、緩解體力疲勞類(lèi)保健食品的功效成分，其質(zhì)量狀況直接關(guān)系到人們的身體健康。目前，國(guó)家尚未制定保健食品中阿魏酸檢測(cè)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，有關(guān)阿魏酸的檢測(cè)方法大多是藥材和中成藥中阿魏酸含量的檢測(cè)[2-5]。但由于保健食品種類(lèi)繁多，成分復(fù)雜，干擾因素多，在前處理方面與藥物制劑和藥材有很大不同。本文對(duì)樣品預(yù)處理進(jìn)行了改進(jìn)，建立了采用固相萃取HPLC法測(cè)定保健食品中阿魏酸的快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，并用于實(shí)際樣品的監(jiān)測(cè)，獲得了滿(mǎn)意的結(jié)果。方法回收穩(wěn)定，精密度好，為保健食品的安全監(jiān)管提供便利。

1 材料與方法

1.1 儀器

高效液相色譜儀（1260）：美國(guó)Agilent公司；萃取柱（Dionex OnGuard II RP柱，2.5cc）：美國(guó)Thmero公司；離心機(jī)（3K15）：Sigma 公司；氮吹儀（EVA50A）：北京普利泰科儀器有限公司；分析天平（BT25S）：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試劑與材料

對(duì)照品阿魏酸：中國(guó)藥品生物制品檢定所；甲醇：色譜純，美國(guó) FISHER 公司；甲酸：色譜純，美國(guó)Sigma公司；乙酸：色譜純，美國(guó)Sigma公司；超純水：由Milli-Q 超純水系統(tǒng)制備，其他試劑均為分析純；樣品：市售某品牌鹿胎盤(pán)膠囊。

1.3 方法

1.3.1色譜條件 色譜柱為ZORBAX Eclipse XDB-C18柱（250 mm×4.6mm×5μm）；柱溫：25 ℃；洗脫方式：1%乙酸溶液-甲醇（55∶45）為流動(dòng)相等度洗脫；流量：1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：320 nm；進(jìn)樣體積：10μL。

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 準(zhǔn)確稱(chēng)取適量的阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品，用流動(dòng)相配制成1.0mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，以流動(dòng)相逐級(jí)稀釋配制5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、30.0μg/mL、40.0μg/mL、50.0μg/mL系列濃度的阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)使用液。

1.4樣品處理

1.4.1樣品提取 精密稱(chēng)量樣品2.00g于50mL具塞離心管中，加入30mL甲醇—甲酸（95∶5），渦旋震蕩2min，然后以8000r/min離心5min，待凈化。

1.4.2 樣品凈化 采用Dionex OnGuard II RP柱（2.5cc）凈化，RP柱用10mL甲醇活化放置10min后使用，取待凈化清液過(guò)RP柱（棄去前5mL濾液），準(zhǔn)確移取2.0mL凈化液氮吹至干，然后用流動(dòng)相定容至2.0mL，經(jīng)0.22μm有機(jī)相濾膜過(guò)濾后供液相色譜分析。

2 結(jié)果和討論

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

通過(guò)對(duì)100μg /mL的阿魏酸進(jìn)行200～400nm范圍的紫外掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)阿魏酸在320nm有最大吸收。本文選擇320nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。圖1阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)溶液200～400nm光譜圖。

2.2 流動(dòng)相的確定

在ZORBAX Eclipse XDB-C18柱上用甲醇——水作流動(dòng)相分離保健食品中阿魏酸，阿魏酸峰型差。根據(jù)阿魏酸的化學(xué)性質(zhì)，考慮采用酸性流動(dòng)相可以獲得較好效果。改用1%乙酸溶液替代水可以改變阿魏酸峰型，且能較好地與干擾雜質(zhì)分離，圖2中峰1（tR=5.34 min）為阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜峰，圖3是樣品中阿魏酸色譜圖（tR=5.32 min）。

2.3 提取方式的確定

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，用甲醇∶甲酸（95∶5）作溶劑，阿魏酸穩(wěn)定性良好[6]。本試驗(yàn)采用振蕩提取、超聲抽提、漩渦提取等不同提取方法進(jìn)行研究， 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，稱(chēng)取樣品約2.0g于50mL具塞離心管中（3份），準(zhǔn)確加入30mL甲醇∶甲酸（95∶5），分別振蕩提取12h， 超聲提取20min，漩渦提取2min，靜置，取上清液過(guò)Dionex OnGuard II RP柱（2.5cc）凈化后，色譜條件下進(jìn)樣10μL，結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知，振蕩提取12h，超聲提取20min，漩渦提取2min，含量基本無(wú)變化，因此為提高檢測(cè)效率選用漩渦提取2min。最優(yōu)提取阿魏酸條件是提取溶劑甲醇∶甲酸（95∶5）、提取方式漩渦提取2min。

2.4 固相萃取柱的選擇

保健食品多屬于中藥復(fù)方產(chǎn)品，含有多種提取藥材，功效因子相互干擾，功效成分不易分離、定量測(cè)定。本文使用Dionex OnGuard II RP柱固相萃取柱是利用固體吸附劑將樣品中的弱極性干擾物，如脂肪等保留，從而得到純凈的溶液，達(dá)到有效去除保健食品中雜質(zhì)的目的。實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)能獲得較好的回收率，故采用Dionex OnGuard II RP柱作為樣品預(yù)處理柱。

2.5回收率與精密度

精密量取2.0g同一濃度樣品6份，每份加入濃度為0.50mg/mL對(duì)照品溶液0.6mL，按文中1.4項(xiàng)的操作方法進(jìn)行處理與測(cè)定，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線同時(shí)進(jìn)行，以當(dāng)時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的測(cè)得濃度，求得本法的精密度與回收率，數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。結(jié)果表明，有較好的回收率與良好的精密度，平均回收率為96.6%，其RSD為3.2%。endprint

2.6 線性范圍和檢測(cè)限

本方法的線性范圍為5.0μg/mL～50μg/mL。配制5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、30.0μg/mL、40.0μg/mL、50.0μg/mL阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，在選定的儀器條件下進(jìn)行色譜分析，每個(gè)濃度點(diǎn)重復(fù)測(cè)定3 次，測(cè)得峰面積平均值對(duì)濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)顯示，阿魏酸在5.0μg/mL～50μg/mL表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，計(jì)算回歸方程為 Y=41.09X-5.29，相關(guān)系數(shù)為 r=0.9996。

以3 倍基線噪音所相當(dāng)?shù)拇郎y(cè)物質(zhì)的量計(jì)算，當(dāng)取樣量為2g，進(jìn)樣量為10.0μL時(shí)，保健食品中阿魏酸的檢出限為0.3mg/100g。

2.7 樣品測(cè)定結(jié)果

利用此方法對(duì)某品牌鹿胎盤(pán)膠囊進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果為32.67mg/100g。

3 結(jié)論

應(yīng)用固相萃取HPLC法測(cè)定保健食品中阿魏酸含量具有靈敏度高、精密度和準(zhǔn)確度好等優(yōu)點(diǎn)，可作為保健食品中阿魏酸含量分析的檢測(cè)方法。Dionex OnGuard II RP柱具有良好的吸附性能，能有效去除樣品中的弱極性干擾成分，獲得較好的回收率、重現(xiàn)性和較低的檢出限。本方法簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)，能夠滿(mǎn)足保健食品中阿魏酸的監(jiān)測(cè)需要，適用于實(shí)驗(yàn)室批量檢測(cè)分析。

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作者簡(jiǎn)介：馬桂娟，碩士，工程師，研究方向：食品檢測(cè)。endprint