UPLCMS/MS同時(shí)測定桂枝茯苓膠囊中6 種三萜酸類成分的含量

馬瑩 李家春　黃文哲　王振中　蕭偉　宋亞玲　張永文

[摘要] 建立超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（UPLCMS/MS）同時(shí)測定桂枝茯苓膠囊中 6 種三萜酸類成分含量的分析方法。采用 Agilent Porosheell 120 SBC18柱（4.6 mm×150 mm， 2.7 μm）；流動(dòng)相為 0.1%甲酸水溶液甲醇，梯度洗脫，流速0.4 mL·min-1，柱溫 30 ℃；進(jìn)樣量 5 μL。質(zhì)譜條件采用電噴霧離子（ESI）源，多重反應(yīng)監(jiān)測（MRM）掃描，定量離子對為m/z 527.8→465.5（茯苓酸），m/z 525.6→465.6（去氫茯苓酸），m/z 483.4→337.3（去氫土莫酸），m/z 481.5→419.5（豬苓酸C），m/z 467.4→337.1（去氫齒孔酸），m/z 453.4→337.0（松苓新酸）。結(jié)果顯示，6 種三萜酸類成分在進(jìn)樣質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（r>0.996 8），精密度 RSD<6.2%；重復(fù)性 RSD<5.9%，平均回收率分別為 97.90%，100.2%，99.60%，101.7%，102.6%，103.0%。該方法準(zhǔn)確、快速、重復(fù)性好，實(shí)現(xiàn)了中藥成方制劑中茯苓三萜酸類成分的定量測定，可為桂枝茯苓膠囊的質(zhì)量控制提供參考方法；并為含茯苓的中藥成方制劑中建立含量測定方法提供參考。

[關(guān)鍵詞] UPLCMS/MS； 桂枝茯苓膠囊； 三萜酸； 含量測定

Simultaneous determination of six triterpenoid acids from Guizhi Fuling

capsules by UPLCMS/MS

MA Ying1， LI Jiachun2， HUANG Wenzhe2， WANG Zhenzhong2， XIAO Wei2，

SONG Yaling2， ZHANG Yongwen3*

（1. School of Chinese Pharmacy， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China；

2. Kanion Pharmaceutical Co.， Ltd.， Lianyungang 222001， China；

3. Center for Drug Evaluation， China Food and Drug Administration， Beijing 100038， China）

[Abstract] To establish a UPLCMS/MS method for simultaneous determination of six triterpenoid constituents （pachymic acid， dehydropachymic acid， dehydrotumulosic acid， polyporenic acid C， dehydroeburicoic acid and dehydrotra metenolic acid） in Guizhi Fuling capsules （GFC）. Chromatographic analysis was conducted on Agilent Porosheell 120 SBC18 column （4.6 mm×150 mm， 2.7 μm）， with 0.1% formic acid aqueous solutionmethanol as the mobile phase for gradient elution at a flow rate of 0.4 mL·min-1. The column temperature was 30 ℃ and the sample size was 5 μL. The samples were analyzed by tandem mass spectrometer with negative electrospray ionization （ESI） source， and monitored under a multiple reaction monitoring （MRM） mode， with the quantitative ion pairs m/z 527.8→465.5 （pachymic acid）， m/z 525.6→465.6 （dehydropachymic acid）， m/z 483.4→337.3 （dehydrotumulosic acid）， m/z 481.5→419.5 （polyporenic acid C）， m/z 467.4→337.1 （dehydroeburicoic acid）， m/z 453.4→337.0 （dehydrotra metenolic acid）. Six triterpenoid acids showed good linear relationships within the investigated concentration ranges （r>0.996 8）， with RSDs of precision less than 6.2%， and all RSDs of repeatability less than 5.9%. The average recovery rate was 97.90%， 100.2%， 99.60%， 101.7%， 102.6% and 103.0% respectively. The method was rapid， accurate， repeatable and could be used as a method for quantitative determination of triterpenoid acids in Chinese medicine prescriptions， providing a reference method for the quality control of Guizhi Fuling capsules and providing a reference for the content determination for Chinese medicine prescriptions containing Poria cocos.endprint

[Key words] UPLCMS/MS； Guizhi Fuling capsules； triterpenoid acids； quantitative determination

桂枝茯苓膠囊（Guizhi Fuling capsules，GFC）是我國傳統(tǒng)的純中藥制劑，處方源自漢代名醫(yī)張仲景的《金匱要略》，由桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁和白芍五味中藥組成，具有活血化瘀、消癥的功效，用于治療婦科血瘀癥，子宮肌瘤，慢性盆腔炎，卵巢囊腫，原發(fā)性痛經(jīng)等疾病[12]。

目前，GFC質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《中國藥典》2015年版一部[3]中，其含量測定項(xiàng)下制定了牡丹皮中丹皮酚，白芍中芍藥苷，桃仁中苦杏仁苷的含量測定方法及含量限度，對茯苓中的三萜酸類成分未建立含量測定方法。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[45]，茯苓三萜酸類成分具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用，與GFC臨床療效相關(guān)，也被認(rèn)為是其重要的有效成分[67]。由于三萜酸類成分的含量測定難度較高，迄今為止對該類成分的質(zhì)量控制方面報(bào)道較少[89]。為進(jìn)一步完善GFC的質(zhì)量控制方法，本研究首次建立UPLCMS/MS同時(shí)測定6種三萜酸類成分含量的方法，并運(yùn)用于GFC制劑的質(zhì)量控制中。該方法分析速度快，專屬性強(qiáng)，靈敏度高，實(shí)現(xiàn)了在GFC中茯苓三萜酸類成分的定量測定，為完善GFC的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供了依據(jù)。

1 材料

LC30AD超高效液相色譜儀（日本島津公司），Analyst Software工作站，APL4000+三重四極桿質(zhì)譜儀（美國AB公司）；Sartorius BSA224SCW電子分析天平（德國賽多利斯公司）；Mettler Toledo XP6電子分析天平（瑞士梅特勒公司）；KQ250DB數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；MilliQ超純水儀（美國密理博公司）。

茯苓酸、去氫茯苓酸、去氫土莫酸、去氫齒孔酸、豬苓酸C、松苓新酸對照品，均由本實(shí)驗(yàn)室自制，經(jīng)面積歸一化法測定純度均>98%；銀杏內(nèi)酯B對照品購自中國食品藥品檢定研究院（批號(hào)110863201209，純度>99.9%）；桂枝茯苓膠囊（GFC）由江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司提供，規(guī)格：0.31 g×100粒/盒，批號(hào)160202，160301，160302，160401，160701，160802，170230；甲醇（德國Merck公司）、甲酸（美國ACS恩科化學(xué)公司）為色譜純，水為實(shí)驗(yàn)室自制超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的配制

分別精密稱取茯苓酸、去氫茯苓酸、去氫土莫酸、去氫齒孔酸、豬苓酸C、松苓新酸對照品5.059，5.161，4.528，5.470，5.219，5.083 mg于10 mL量瓶中，用甲醇定容，制得質(zhì)量濃度分別為0.495 8，0.505 8，0.443 7，0.536 1，0.511 7，0.498 1 g·L-1的對照品儲(chǔ)備液，吸取各對照品儲(chǔ)備液適量，制得各成分質(zhì)量濃度均為 10 mg·L-1的混合對照品溶液，于 4 ℃保存，備用。

2.2 內(nèi)標(biāo)溶液的配制

精密稱取 6.432 mg 銀杏內(nèi)酯 B 于 10 mL 量瓶中，用甲醇定容，制得質(zhì)量濃度為 0.642 6 g·L-1的內(nèi)標(biāo)溶液，精密吸取適量，制得質(zhì)量濃度為 1 mg·L-1的內(nèi)標(biāo)溶液，4 ℃ 保存，備用。

2.3 供試品溶液的配制

取 GFC 10 粒，將內(nèi)容物置研缽中研磨均勻。取細(xì)粉約 0.6 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入乙酸乙酯溶液 50 mL，超聲處理（功率 250 W，頻率50 kHz）1 h，濾過，減壓濃縮（40 ℃）至干，用甲醇溶解定容至 25 mL量瓶中，搖勻，靜置，過 0.22 μm 微孔濾膜后備用。

2.4 色譜與質(zhì)譜條件

2.4.1 色譜條件 色譜柱為 Agilent Porosheell 120 SBC18柱（4.6 mm×150 mm，2.7 μm），流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）甲醇（B），梯度洗脫（0.01～15 min，92% B；15～15.2 min， 92%～100% B； 15.2～20 min， 100%B； 20～20.2 min，100%～92% B； 20.2～25 min，92% B），流速 0.4 mL·min-1，柱溫 30 ℃，進(jìn)樣量5 μL。

2.4.2 質(zhì)譜條件 APL4000+三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，離子化方式為電噴霧離子化（ESI），負(fù)離子檢測模式，采用多反應(yīng)監(jiān)測離子掃描（MRM）；主要質(zhì)譜參數(shù)：氣簾氣（CUR）體積流量 45 L·min-1；噴霧電壓（IS）4 500 V；脫溶劑溫度（TEM）450 ℃；霧化氣（GS1）體積流量 50 L·min-1；加熱輔助氣（GS2）體積流量 50 L·min-1。各成分的部分質(zhì)譜分析參數(shù)，見表 1，混合對照品及樣品 MRM色譜圖，見圖 1。

2.5 線性關(guān)系

分別精密吸取混合對照品溶液適量，加甲醇溶液稀釋至不同質(zhì)量濃度，搖勻，制得系列混合對照品溶液，分別吸取以上混合對照品溶液 500 μL，加 15 μL內(nèi)標(biāo)溶液，混勻，按2.4項(xiàng)下條件，測定峰面積，以峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值（Y）對分析物質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程見表2。結(jié)果表明，各成分在各自的線性范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度

精密稱取同一批樣品（批號(hào)170230），按2.3項(xiàng)下制備 6 份供試品溶液，精密吸取 500 μL，加入甲醇 500 μL，內(nèi)標(biāo) 30 μL，混勻，按2.4項(xiàng)下色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)行測定，測定各成分的峰面積，并按內(nèi)標(biāo)法計(jì)算各成分含量，計(jì)算日內(nèi)精密度，RSD<10%，見表3；另取該樣品 6 份，連續(xù)6 d內(nèi)分別同法制備成供試品溶液，并按2.4項(xiàng)下色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)行測定，測定各成分的峰面積，按內(nèi)標(biāo)法計(jì)算各成分的含量，計(jì)算日間精密度， RSD<10%，見表 3，結(jié)果表明方法精密度良好。endprint

2.7 穩(wěn)定性

按2.3項(xiàng)下制備供試品溶液，精密吸取 500 μL，加入甲醇 500 μL，內(nèi)標(biāo) 30 μL，分別于 0，2，4，6，8，12，24 h按2.4項(xiàng)下色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)行測定，測定各成分的峰面積，并計(jì)算各成分含量的 RSD，結(jié)果見表3，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性

精密吸取同1批（批號(hào)170230）GFC樣品6份，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取 500 μL，加入甲醇 500 μL，內(nèi)標(biāo) 30 μL，按2.4項(xiàng)下色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)行測定，測定各成分的峰面積，并計(jì)算各成分含量的 RSD，結(jié)果見表3，表明該方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率

精密稱取茯苓酸、去氫茯苓酸、去氫土莫酸，豬苓酸 C，去氫齒孔酸、松苓新酸對照品適量，用甲醇配制成 1 mL含有133.5，55.50，43.05，17.30，13.50，16.50 μg的混合對照品溶液。取已知含量的 GFC 9 份，每份約0.15 g，分成3組，分別精密加入混合對照品溶液各 333 μL（低）、667 μL（中）、1 000 μL（高），分別按2.3項(xiàng)下制備供試品溶液后按2.4項(xiàng)下色譜及質(zhì)譜條件測定含量，計(jì)算6種三萜酸類成分的平均回收率，結(jié)果茯苓酸、去氫茯苓酸、去氫土莫酸、豬苓酸C、去氫齒孔酸、松苓新酸的平均回收率依次分別為 97.90%，100.2%，99.60%，101.7%，102.6%，103.0%，RSD依次分別為 2.1%，1.9%，2.1%，2.7%，3.6%，1.7%。

2.10 樣品測定

取不同批號(hào)的樣品0.6 g，精密稱定，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.4項(xiàng)下色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)行測定，（每批號(hào) 2 份，每份進(jìn)樣 2 次），計(jì)算每粒 GFC中 6 種茯苓三萜酸類成分的含量，結(jié)果見表4。

2.11 箱線圖分析

箱線圖[10]是一種描述數(shù)據(jù)分布的統(tǒng)計(jì)圖，利用它可以直觀的來觀察變量值的分布情況，箱線圖主要表示變量值的中位數(shù)，1/4位數(shù)，3/4 位數(shù)等統(tǒng)計(jì)量。在現(xiàn)有的研究基礎(chǔ)上，引入了P來評價(jià)批次間的差異，P=CA/CB×100%，其中CA為每個(gè)批次各個(gè)化合物的含量，CB為 7 個(gè)批次各個(gè)化合物的平均含量。P越接近于100%表明批次間的差異越小，規(guī)定批次間的波動(dòng)在 75%～125%是可以接受的[11]。采用 SPSS 20.0數(shù)據(jù)處理軟件對測定結(jié)果進(jìn)行處理，對7個(gè)批次的GFC中6個(gè)三萜酸類成分進(jìn)行分析，見圖2。結(jié)果表明，茯苓酸、去氫茯苓酸、去氫土莫酸、豬苓酸C、去氫齒孔酸和松苓新酸的P接近 100%，表明批次間差異性小，去氫茯苓酸與去氫齒孔酸分別有一個(gè)異常值，但波動(dòng)在75%～125%，故不影響整體的質(zhì)量。由此可以得出不同批次 GFC 的質(zhì)量并無明顯差異。

3 討論

3.1 GFC中含有茯苓，茯苓的主要指標(biāo)性成分

三萜酸類成分在制劑中的含量相對較低，由于三萜酸類成分的紫外吸收度也較差，用 HPLCUV 檢測靈敏度低，且耗時(shí)較長，難以建立有效的含量測定方法。經(jīng)本實(shí)驗(yàn)研究，采用UPLCMS/MS測定GFC中的三萜酸類成分，具有選擇性好的特點(diǎn)，且具有更高的靈敏度和專屬性，同時(shí)該方法亦具有較好的適用性，可以實(shí)現(xiàn)在中藥成方制劑中茯苓三萜酸類成分的含量測定。

3.2 內(nèi)標(biāo)化合物

銀杏內(nèi)酯B為二萜類化合物，結(jié)構(gòu)中有 5 個(gè)五元環(huán)，而所測成分為三萜類成分，結(jié)構(gòu)中有4個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，比較二者所含有的基團(tuán)及結(jié)構(gòu)特征，發(fā)現(xiàn)二者極性相似，且在甲醇中的溶解度也相似，符合內(nèi)標(biāo)物的選擇原則（物理化學(xué)性質(zhì)相似等原則），故選擇銀杏內(nèi)酯B作為內(nèi)標(biāo)物。

3.3 色譜條件

UPLC比一般 HPLC具有更高的選擇性和分離度，通過不同溶劑系統(tǒng)（乙腈、甲醇）對 6 種三萜酸類成分分離效果影響的實(shí)驗(yàn)比較。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)甲醇的分離效果及色譜峰峰形較好，同時(shí)向流動(dòng)相中加入甲酸能抑制三萜酸類成分色譜峰的拖尾。因三萜酸類成分含有COOH，顯弱酸性，加入適量甲酸可以改善峰形，調(diào)節(jié)分離度，結(jié)果表明甲醇0.1%甲酸溶劑系統(tǒng)為 GFC中茯苓三萜酸類成分分析的適用溶劑系統(tǒng)。

3.4 質(zhì)譜條件

本實(shí)驗(yàn)用 UPLCMS/MS對三萜酸類成分定量，均采用MRM模式。將6種三萜酸及銀杏內(nèi)酯B分別由針泵進(jìn)樣，直接進(jìn)入ESI 源進(jìn)行質(zhì)譜分析，分別在正負(fù)離子模式下檢測，待測物在負(fù)離子模式下更穩(wěn)定、靈敏度更高；在負(fù)離子模式下檢測，同時(shí)獲取母離子、子離子信息，并選擇適宜的子離子探索最佳的CE，DP，EP，CXP。與紫外檢測器相比，MRM 技術(shù)不需要待測物在色譜柱中完全分離，也不需要物質(zhì)具有紫外吸收也可以得到相關(guān)質(zhì)譜信息與數(shù)據(jù)，并有效的進(jìn)行定性定量分析，增加了定量的準(zhǔn)確度。

3.5 三萜酸質(zhì)譜裂解分析

根據(jù)質(zhì)譜裂解規(guī)律，茯苓酸[12]的最佳離子對為m/z 527.8→465.5，裂解的子離子m/z 465.5 為分子離子峰失去1分子 H2O 和1分子 CO2產(chǎn)生的[M-H-H2O-CO2]峰。去氫茯苓酸[13]的最佳離子對為m/z 525.6→465.6，裂解的子離子m/z 465.6 為分子離子峰失去1分子 CH3COOH 產(chǎn)生的[M-H-CH3COOH]峰。去氫土莫酸[13]的最佳離子對為m/z 483.4→337.3，裂解的子離子m/z 337.3 為分子離子峰失去1分子 H2O 和1分子 CO2，以及 C24雙鍵麥?zhǔn)现嘏藕蟮漠a(chǎn)物。去氫齒孔酸[13]最佳離子對為m/z 467.4→337.1，裂解的子離子m/z 337.4 為分子離子峰失去1分子 H2O 和1分子 CO2，以及 C24雙鍵斷裂后的產(chǎn)物。松苓新酸[13]最佳離子對為m/z 453.4→337.0，裂解的子離子m/z 337.0 為分子離子峰失去2分子 CH4以及 C24雙鍵麥?zhǔn)现嘏藕蟮漠a(chǎn)物。豬苓酸C[13]最佳離子對為m/z 481.5→419.5，裂解的子離子m/z 419.5 為分子離子峰失去1分子 H2O 和1分子 CO2產(chǎn)生的 [M-H-H2O-CO2] 峰。以上的質(zhì)譜裂解特征，是 UPLCMS/MS定量分析識(shí)別檢測成分的信號(hào)特征，構(gòu)成采用 UPLCMS/MS檢測三萜酸類成分的理論基礎(chǔ)。endprint

3.6 供試品制備方法

對制劑樣品前處理過程中，以甲醇、95%乙醇、乙酸乙酯為提取溶劑，采用超聲提取與回流提取法，同時(shí)考察提取次數(shù)以及時(shí)間對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。結(jié)果表明乙酸乙酯作為提取溶劑時(shí)各成分含量最高，95%乙醇次之，甲醇最小，原因可能是三萜酸類成分極性較小，用乙酸乙酯提取，由于相似相溶作用，成分提取的更完全，而甲醇、95%乙醇極性較大，未能完全提取出三萜酸類成分，最終確定供試液最佳提取條件為：乙酸乙酯為提取溶劑，超聲提取1次，提取1 h。

3.7 建立含量測定方法

本實(shí)驗(yàn)通過對質(zhì)譜條件和色譜條件的優(yōu)化，建立了適合的三萜酸類成分含量測定方法。通過對7個(gè)批次的 GFC 進(jìn)行分析測定，結(jié)果表明GFC批間質(zhì)量一致性較好。UPLCMS/MS同時(shí)測定GFC中6種三萜酸類成分的測定方法快速、準(zhǔn)確，與傳統(tǒng)采用HPLCUV測定的方法相比，能同時(shí)測定不同類型的三萜酸類成分，而且樣品分析時(shí)間大大縮短，能從1 h縮短至15 min；該方法具有分離度高，峰形好的特點(diǎn)，對GFC中茯苓三萜酸類成分的含量測定，可為 GFC的質(zhì)量控制提供參考方法，由于該方法具有一定的適用性，也可為含茯苓的中藥成方制劑中建立含量測定方法提供參考。

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[責(zé)任編輯 孔晶晶]endprint