土壤中高效解磷菌的鑒定及其對(duì)皖南烤煙幼苗生長(zhǎng)的影響

汪志宇　岳耀穩(wěn)

摘要 從皖南地區(qū)200多個(gè)土壤樣品中分離、篩選出4株能降解無(wú)機(jī)磷的優(yōu)勢(shì)菌株GY22-3-2、GY7-3-7、GY13-2-5、GY2-4-2，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)測(cè)定其解磷能力，分別為11.92 %、8.25%、7.48%、3.49%。將其接種于烤煙幼苗，考察其對(duì)烤煙幼苗生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明，在充分供應(yīng)烤煙幼苗氮、鉀等其他營(yíng)養(yǎng)元素的情況下，解磷菌株能夠不同程度地發(fā)揮解磷效果，在其影響下，煙株各部位鮮重、干重及葉綠素含量較不接菌的對(duì)照顯著增加，根系活力較對(duì)照明顯增強(qiáng)，其中，GY22-3-2菌株較其他菌株表現(xiàn)出更強(qiáng)的解磷能力，解磷效果較好。

關(guān)鍵詞 烤煙；解磷菌；解磷能力；鑒定；幼苗生長(zhǎng)

中圖分類號(hào) S572 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2017）16-0029-02

磷是高等植物生長(zhǎng)所必需的大量礦質(zhì)元素之一，然而土壤中95%以上的磷呈有機(jī)（含量約占全磷含量的50%以上）或無(wú)機(jī)磷化物狀態(tài)存在，水溶性很低，很難被植物直接吸收利用，只有很少比例的速效態(tài)磷能被植物直接利用，從而造成了世界范圍內(nèi)磷素的缺乏。解決這一問(wèn)題有2條途徑：一是增加磷源投入，二是提高難溶性磷的利用率。從農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展來(lái)看，增加磷源投入存在一定的問(wèn)題，而提高難溶性磷的利用率的潛力則很大，它是對(duì)土壤中磷及所施入的磷肥進(jìn)行活化提高其有效性，走低投入高產(chǎn)出的可持續(xù)發(fā)展道路。本試驗(yàn)從安徽省皖南地區(qū)采集的土樣中分離篩選出了4株能降解無(wú)機(jī)磷的微生物，并進(jìn)一步純化鑒定，初步測(cè)定了它們的解磷能力，并將其接種于烤煙幼苗，觀察測(cè)定其對(duì)烤煙幼苗生長(zhǎng)的促進(jìn)作用，最終確定具有較高解磷能力的菌株，為進(jìn)一步研究土壤微生物解磷機(jī)制及開發(fā)解磷菌株制劑奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)[1-3]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)土概況

本試驗(yàn)分離解磷微生物用土采集自安徽省皖南地區(qū)的200多個(gè)土樣；盆栽試驗(yàn)用土來(lái)自黃山市徽州區(qū)東山村，主要理化性狀：pH值6.2～6.7、全氮0.15 g/kg、全磷0.32 g/kg、全鉀19.7 g/kg、細(xì)菌2.1×106個(gè)/g土、放線菌3.5×106個(gè)/g土、真菌1×106個(gè)/g土、堿解氮24.5 mg/kg、速效磷1.9 mg/kg、速效鉀98 mg/kg。

1.2 供試材料

供試烤煙品種為云煙97。供試培養(yǎng)基為分離培養(yǎng)基：解磷菌株分離培養(yǎng)基（液體）（以下簡(jiǎn)記為P1培養(yǎng)基）配方如下：葡萄糖10 g，硫酸銨0.5 g，磷酸鈣10 g，氯化鈉0.3 g，氯化鉀0.3 g，硫酸鎂0.3 g，硫酸亞鐵0.03 g，硫酸錳0.03 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0～7.5，121 ℃滅菌30 min，pH值為6.8～7.3。解磷菌株分離培養(yǎng)基（固體）：瓊脂18～20 g，其他同液體培養(yǎng)基。斜面培養(yǎng)基成分與固體培養(yǎng)基相同。

1.3 菌株分離方法

涂布法：取野外采集土樣適量，研缽研細(xì)，稱取10 g粉末加入盛有100 mL無(wú)菌水的三角瓶中，25 ℃搖床恒溫振蕩30 min，取上清液作10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8稀釋液，各取0.2 mL該稀釋液涂布于平板培養(yǎng)基上，每個(gè)濃度重復(fù)3皿，28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d。挑取單菌落轉(zhuǎn)至斜面培養(yǎng)至菌苔長(zhǎng)起，置4 ℃冰箱保存，進(jìn)一步篩選，共得224個(gè)菌株。

1.4 解磷能力的測(cè)定方法

1.4.1 菌株在固體培養(yǎng)基中解磷能力的測(cè)定。觀察溶鈣圈法：將初篩得到的224個(gè)菌株接種于無(wú)機(jī)磷固體培養(yǎng)基中，倒置于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)7 d，觀察有無(wú)溶鈣圈，并根據(jù)溶鈣圈的大小初步確定解磷效果。

1.4.2 菌株在液體培養(yǎng)基中解磷能力的測(cè)定。鉬酸銨定磷試劑比色法：將初篩得到的4個(gè)菌株GY22-3-2、GY7-3-7、GY13-2-5、GY2-4-2分別接種在滅過(guò)菌的P1液體培養(yǎng)基中，用不接菌的液體培養(yǎng)基作對(duì)照，28 ℃往復(fù)搖床144 r/min培養(yǎng)7 d。取過(guò)濾后的培養(yǎng)液測(cè)定培養(yǎng)液中可溶性磷的含量。

1.5 解磷菌株對(duì)煙草幼苗生長(zhǎng)的促進(jìn)作用試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用盆栽法進(jìn)行研究。試驗(yàn)地點(diǎn)：皖南煙葉公司黃山煙葉經(jīng)理部試驗(yàn)基地；花盆規(guī)格12 cm×12 cm；栽培環(huán)境：溫室中；煙苗苗齡30 d。每株煙基施K2SO4 4 g、NH4NO3 2.5 g、緩苗后追施K2SO4 2 g、NH4NO3 1.5 g。

本試驗(yàn)共設(shè)5個(gè)處理，分別是GY22-3-2、GY7-3-7、GY13-2-5、GY2-4-2、不接菌作對(duì)照（CK），3次重復(fù)。在煙苗移栽后第4天（基本緩苗）接種28 ℃ 144 r/min搖床培養(yǎng)7 d的菌株培養(yǎng)液和不接菌的培養(yǎng)液CK，每株20 mL。

接種后每10 d測(cè)1次株高，30 d后測(cè)煙株根、莖、葉鮮重、干重。根系活力采用TTC染色法[4-6]。葉綠素含量用研磨法。

1.6 數(shù)據(jù)處理方法

用DPS數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株在固體培養(yǎng)基中分解Ca3（PO4）2的能力

從表1可以看出，CK各項(xiàng)指標(biāo)均為0，說(shuō)明在無(wú)微生物存在的情況下，Ca3（PO4）2在試驗(yàn)條件下無(wú)釋放。而菌株GY22-3-2、GY7-3-7、GY13-2-5、GY2-4-2在以Ca3（PO4）2為唯一磷源的平板中都能產(chǎn)生透明圈，說(shuō)明這4個(gè)菌株都能一定程度地分解Ca3（PO4）2。而在菌株GY22-3-2的周圍出現(xiàn)了較明顯的透明圈，說(shuō)明在以Ca3（PO4）2為唯一磷源的固體培養(yǎng)基中，菌株GY22-3-2的解磷能力最強(qiáng)，GY7-3-7、GY13-2-5菌株次之，GY2-4-2較差。

2.2 菌株在液體培養(yǎng)基中分解Ca3（PO4）2的能力endprint

從圖1可以看出，經(jīng)過(guò)7 d的搖床培養(yǎng)，解磷菌株表現(xiàn)出不同的解磷能力。其中，菌株GY22-3-2的解磷能力最強(qiáng)，其效率高達(dá)11.92%；GY7-3-7次之，GY2-4-2較弱。其解磷能力較CK高86.25%～95.97%。

2.3 不同解磷菌株對(duì)烤煙幼苗生長(zhǎng)的促進(jìn)作用

2.3.1 對(duì)烤煙幼苗株高的影響。由于土壤中含有一定的速效磷，這部分磷在一定時(shí)間內(nèi)足以供給烤煙幼苗生長(zhǎng)對(duì)磷素的需求。因此，接種后10 d，各個(gè)處理間煙苗生長(zhǎng)的差異不顯著。隨著煙苗的生長(zhǎng)，土壤中的速效磷被耗盡，這時(shí)解磷菌株便不同程度地發(fā)揮解磷作用，將土壤中難溶性磷分解為可溶性的磷，供煙苗生長(zhǎng)利用。從圖2可以看出，在固體和液體培養(yǎng)基中均表現(xiàn)良好解磷效果的GY22-3-2菌株始終處于最好水平，且隨時(shí)間的推移，解磷效果不斷快速增加，而表現(xiàn)較差的GY2-4-2菌株，雖然隨時(shí)間推移也在增加，但增加的幅度明顯沒(méi)有GY22-3-2高。說(shuō)明在試驗(yàn)條件下解磷效果越好的菌株，對(duì)煙苗生長(zhǎng)的促進(jìn)作用越明顯。

2.3.2 對(duì)烤煙幼苗根、莖、葉鮮、干重的影響。從圖3可以看出，對(duì)根、莖、葉鮮重的影響總的表現(xiàn)為GY22-3-2>GY7-3-7>GY13-2-5> GY2-4-2>CK。從圖4可以看出，不同解磷菌株對(duì)煙苗干重的影響與對(duì)鮮重的影響大致相同，對(duì)根、莖、葉干物質(zhì)增加量的影響都是GY22-3-2>GY7-3-7>GY13-2-5> GY2-4-2>CK，施入解磷菌的處理與CK相比達(dá)顯著水平。煙株對(duì)氮、磷、鉀等各種營(yíng)養(yǎng)元素的吸收存在一定的平衡關(guān)系，因此，在煙株生長(zhǎng)過(guò)程中，其中任意一種元素的缺乏必然影響煙株對(duì)其他物質(zhì)的吸收。在氮、鉀等供應(yīng)充足的情況下，解磷效果較強(qiáng)的處理，由于解磷菌分解了大量的難溶性磷酸鹽，土壤中植物可利用的有效磷的含量大大增加，促進(jìn)了煙株對(duì)其他物質(zhì)的吸收，進(jìn)而促進(jìn)煙株的生長(zhǎng)。

2.3.3 對(duì)煙草幼苗葉綠素含量的影響。從表2可看出，不同解磷菌株對(duì)煙苗葉綠素及類胡蘿卜素含量的影響比較明顯，處理GY22-3-2的各項(xiàng)指標(biāo)均顯著高于其他處理，CK最差。一方面說(shuō)明，與CK相比，各菌株均能在一定程度上改善土壤有效磷的供應(yīng)狀況，促進(jìn)煙株幼苗葉片葉綠素的形成；另一方面可以很清楚地看出，在供試菌株中，GY22-3-2菌株對(duì)葉綠素的影響明顯好于其他菌株，從對(duì)葉綠素含量的影響上再次證明該菌株的高解磷能力。

2.3.4 不同解磷菌株對(duì)煙草幼苗根系活力的影響。從圖5可以看出，在相同的氮、鉀水平條件下，不同的菌群接種到土壤中對(duì)煙株根系活力有不同的影響，解磷效果較好的菌株GY22-3-2其煙苗的根系活力也較強(qiáng)，其原因可能是解磷能力較強(qiáng)的菌株分泌出較多的磷酸酶，使土壤中難溶性磷酸鹽釋放出來(lái)，顯著增強(qiáng)根系周圍的酶活性，進(jìn)一步促進(jìn)了根系的發(fā)育，從而大大增強(qiáng)了煙苗的根系活力。

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，在以Ca3（PO4）2為唯一磷源的培養(yǎng)基中，供試4個(gè)菌株都能不同程度地分解Ca3（PO4）2，從而產(chǎn)生透明圈。在充分供應(yīng)氮、鉀等其他元素的情況下，解磷菌劑能夠促進(jìn)煙草幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育，對(duì)葉綠素含量、干物質(zhì)累積量有很大影響，尤其能夠促進(jìn)烤煙幼苗側(cè)根的發(fā)生，使煙苗根系活力增強(qiáng)，提高煙苗素質(zhì)。GY22-3-2菌株無(wú)論是在實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng)基中的解磷效果，還是在土壤條件下對(duì)烤煙幼苗生長(zhǎng)的促進(jìn)效果上，均明顯好于其他菌株。在測(cè)定菌株分解Ca3（PO4）2的能力的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)在平板中產(chǎn)生透明圈較大的菌株GY22-3-2，在液體培養(yǎng)基中的解磷能力也最強(qiáng)，但是，這僅僅說(shuō)明該菌株對(duì)該狀態(tài)的Ca3（PO4）2分解能力強(qiáng)，對(duì)土壤中存在的Ca8-p、Ca10-p、Fe-p和Al-p的分解能力是否強(qiáng)還需要進(jìn)一步研究。雖然本試驗(yàn)中解磷菌對(duì)煙苗生長(zhǎng)的促進(jìn)作用比較明顯，在一定程度上能夠說(shuō)明解磷菌在土壤中的解磷效果較好，但是，因?yàn)楸驹囼?yàn)是在可調(diào)控溫濕度的大棚中進(jìn)行，且栽培時(shí)間較短，存在很多偶然性。若將其應(yīng)用于大田生產(chǎn)，因其環(huán)境條件可人為控制因素不大，尤其在煙草生長(zhǎng)季節(jié)，一般情況下降雨量較多，且土壤中固有的大量微生物與解磷菌存在激烈的競(jìng)爭(zhēng)作用，這些原因都會(huì)導(dǎo)致解磷菌的解磷能力降低甚至消失，或者使解磷菌死亡。另外，本試驗(yàn)只分離出具有解磷能力的微生物，而沒(méi)有分析鑒定其分類，這有待進(jìn)一步研究，確定其類別和生長(zhǎng)習(xí)性，以便為解磷菌在土壤中最大程度地發(fā)揮解磷效果的環(huán)境條件的確定提供理論依據(jù)。

4 致謝

感謝云南省煙草科學(xué)研究所提供這次實(shí)習(xí)機(jī)會(huì)！在試驗(yàn)操作過(guò)程中，得到了云南省煙草科學(xué)研究所高家合、廖德智、張紅艷3位老師的大力支持；同時(shí)，張英、馬方磊等幾位同學(xué)也提供了許多幫助。在此次論文撰寫過(guò)程中，年夫照博士對(duì)本人進(jìn)行了悉心指導(dǎo)，在此一并致以最誠(chéng)摯的謝意！

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