軟骨組織工程中種子細(xì)胞的研究進展

張治金++++++全仁夫++++++岳振雙++++++朱芳兵

[摘要] 組織工程修復(fù)軟骨缺損是組織工程技術(shù)運用于臨床最具可行性的研究領(lǐng)域之一，而種子細(xì)胞是軟骨組織工程研究及臨床應(yīng)用的基本要素和首要環(huán)節(jié)。本文結(jié)合國內(nèi)外的研究成果，對組織工程修復(fù)軟骨缺損中種子細(xì)胞的研究現(xiàn)狀進行回顧，綜述種子細(xì)胞的特點、來源、種類以及培養(yǎng)和鑒定，以期為軟骨組織工程的進一步發(fā)展提供依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 軟骨缺損；組織工程；種子細(xì)胞

[中圖分類號] R687.3 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）08（b）-0036-04

[Abstract] Tissue engineering cartilage repair tissue engineering technology is applied to the clinical one of the most feasible research field， and the seed cell is cartilage tissue engineering research and clinical application of the basic elements and the primary link. In this paper， combining the domestic and foreign research results， the research status of seed cells in cartilage defects repairing tissue engineering was reviewed. The characteristics， sources， species and culture of seed cells are reviewed in order to provide the basis for the further development of cartilage tissue engineering.

[Key words] Cartilage defect； Tissue-engineeved cartilage； Seeding cells

關(guān)節(jié)軟骨缺損帶來的頑固性疼痛和關(guān)節(jié)障礙，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量。隨著軟骨組織工程的發(fā)展給關(guān)節(jié)軟骨缺損的患者帶來了福音，利用組織工程技術(shù)修復(fù)軟骨缺損的研究及臨床應(yīng)用取得較大的成功[1]。但軟骨組織修復(fù)工程在臨床上的直接應(yīng)用尚有一段差距，因此有必要分析現(xiàn)有的研究和面臨的挑戰(zhàn)，以更好的縮短差距。而種子細(xì)胞是軟骨組織工程中最基本的，也是首要環(huán)節(jié)。本文就種子細(xì)胞的特點、來源、種類以及培養(yǎng)進行綜述。

1 種子細(xì)胞的特點

軟骨組織工程修復(fù)軟骨缺損的研究30余年，理想的種子細(xì)胞一直是研究的熱點，也是研究者們亟待解決的問題。它應(yīng)該具備以下特點，①取材：便于獲取，來源豐富，且對供體的傷害降到最低；②增殖：增殖力強，在體外培養(yǎng)能迅速生長，增殖至構(gòu)建軟骨組織所需的基礎(chǔ)細(xì)胞數(shù)；③黏附：黏附率高，可以較穩(wěn)定的黏附支架生長；④生物學(xué)特性：遺傳背景穩(wěn)定，構(gòu)建的軟骨組織應(yīng)與植入患者的生理軟骨具有相同的生物學(xué)功能，且在修復(fù)的各階段均能保持軟骨表型的穩(wěn)定，維持自身穩(wěn)態(tài)，在體內(nèi)長期存活；⑤生物安全性：無明顯的免疫排斥或者免疫排斥反應(yīng)不對機體造成傷害，同時在體外培養(yǎng)以及體內(nèi)適應(yīng)、重塑等階段毒性作用和致瘤性較小。經(jīng)誘導(dǎo)后可向軟骨細(xì)胞分化是種子細(xì)胞的基本要求，而能分泌和合成軟骨細(xì)胞所需要的特異性基質(zhì)是重要的條件之一。

2 種子細(xì)胞的來源

種子細(xì)胞的來源遵循種子細(xì)胞特有的要求，主要以自體、同種異體和異種為主。自體細(xì)胞取自患者自身，不發(fā)生免疫排斥反應(yīng)是其最大的優(yōu)點，但其取材可造成患者的創(chuàng)傷和痛苦，對于自身干細(xì)胞或者基因缺陷以及患有傳染性疾病的患者均不適宜選用自體細(xì)胞，且自體細(xì)胞存在數(shù)量局限以及多代培養(yǎng)出現(xiàn)細(xì)胞老化的問題。同種異體細(xì)胞可在事先進行培養(yǎng)制備，但其可能存在免疫排斥反應(yīng)。異種細(xì)胞取材方便，來源廣泛，但其需要進行抗免疫排斥反應(yīng)，存在動物病毒傳染的風(fēng)險。但劉藝昌等[2]通過對同種異體和異種來源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞移植修復(fù)兔喉軟骨缺損，均取得良好的療效，且二者在修復(fù)效果上并無差距，這也無疑為種子細(xì)胞的來源提供了新的理論基礎(chǔ)。目前，在臨床上為了規(guī)避免疫排斥反應(yīng)，種子細(xì)胞的主要來源集中于自體細(xì)胞，且隨著誘導(dǎo)多能干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，自體多能干細(xì)胞為軟骨組織工程提供了更豐富、廣泛的種子細(xì)胞來源[3-4]。

3 種子細(xì)胞的種類

3.1 軟骨細(xì)胞

3.1.1 軟骨細(xì)胞的增殖

軟骨細(xì)胞作為關(guān)節(jié)軟骨組織工程的種子細(xì)胞源的關(guān)鍵在于軟骨細(xì)胞自身的維持以及其產(chǎn)生Ⅱ型膠原等細(xì)胞外基質(zhì)的維持。然而軟骨細(xì)胞僅占軟骨組織的5%～10%，其體外擴增顯得尤為重要。國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)，單層培養(yǎng)軟骨細(xì)胞，軟骨細(xì)胞的基因表達在第1代既已發(fā)生改變[5]。研究發(fā)現(xiàn)通過改變底物以及生長因子可以預(yù)防或減緩單層培養(yǎng)軟骨細(xì)胞所出現(xiàn)的去分化的問題[6]。同時，軟骨細(xì)胞擴增過程中影響細(xì)胞聚集物形態(tài)及行為的重要因素是種植的密度。Freed等[7]在藻（朊）酸鹽海綿上灌注進行軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)低密度的軟骨細(xì)胞種植密度的蓄積擴增率明顯高于中高密度的蓄積擴增率。

3.1.2 軟骨細(xì)胞的來源

自體軟骨細(xì)胞的提取簡易便行，通過胰蛋白酶及Ⅱ型膠原蛋白酶的作用，即可提取純度較高的軟骨細(xì)胞，不存在免疫反應(yīng)，是最早應(yīng)用的一類種子細(xì)胞。但因其是分化的終末自體細(xì)胞，增殖力低，一般在3代以后細(xì)胞表型發(fā)生改變，出現(xiàn)“去分化”現(xiàn)象，喪失成軟骨能力。同種異體軟骨細(xì)胞存在于細(xì)胞外基質(zhì)中具有一定的抗免疫排斥的作用，又因在酶消化等處理后抗原性減弱，其免疫排斥作用不明顯，來源廣泛，有效的解決細(xì)胞來源不足的問題。但存在可能傳染疾病的風(fēng)險，且也對供體造成傷害。異種軟骨細(xì)胞雖然可在短時間內(nèi)大量獲取，但植入體內(nèi)后免疫排斥嚴(yán)重，故臨床上較少應(yīng)用。endprint

3.1.3 軟骨細(xì)胞的研究及應(yīng)用

閆虎等[8]應(yīng)用用Ⅱ型膠原酶消化并機械吹打的方法獲取大量生長速度快且不易退變的新西蘭兔膝關(guān)節(jié)的軟骨細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在3代以前的兔軟骨細(xì)胞最適宜。耿書國等[9]通過改良胰蛋白酶聯(lián)合Ⅱ型膠原酶序貫消化法、劉小榮等[10]采用單純Ⅱ型膠原酶法、王林林等[11]則采用機械-雙酶法提取軟骨細(xì)胞均可建立良好的軟骨細(xì)胞分離及培養(yǎng)體系。唐新等[12]取全膝關(guān)節(jié)置換患者殘存的軟骨用雙酶法進行提取及體外培養(yǎng)，在4代以內(nèi)軟骨細(xì)胞生長良好，生物特性明顯，4代后出現(xiàn)“去分化”現(xiàn)象。王斌等[13]采用基質(zhì)誘導(dǎo)自體軟骨細(xì)胞移植治療股骨滑車軟骨損傷10例，患者移植手術(shù)成功，且近期療效較好，創(chuàng)傷較小，恢復(fù)較快。Zhang等[14]的研究同樣也證明了自體軟骨細(xì)胞移植術(shù)可有效修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損。

3.2 干細(xì)胞

干細(xì)胞相對于成熟的軟骨細(xì)胞具有多向分化和較長時間或無限自我更新的能力，在組織工程修復(fù)軟骨缺損的研究中為研究熱點。其中胚胎干細(xì)胞以及間充質(zhì)干細(xì)胞為重點的研究種子細(xì)胞。

3.2.1 胚胎干細(xì)胞

胚胎干細(xì)胞是一類高度未分化的細(xì)胞，其具備全能性、無限增殖性、易對基因進行修改、端粒酶活性高等生物特性，可在特定的條件下誘導(dǎo)分化成軟骨細(xì)胞。但是胚胎干細(xì)胞定向分化誘導(dǎo)成軟骨細(xì)胞是現(xiàn)階段的研究難點。在胚胎干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞的定向分化的過程中，細(xì)胞外基質(zhì)的組成、幾何構(gòu)型及表面粗糙度、電荷性質(zhì)都會對軟骨的形成產(chǎn)生巨大的影響。胚胎干細(xì)胞所處的環(huán)境可對軟骨細(xì)胞的增殖和純度產(chǎn)生影響，Jukes等[15]發(fā)現(xiàn)由4 mm厚度PEOT/PBT3D混合共聚物構(gòu)成的軟骨支架更適用于軟骨細(xì)胞的分化。不同的誘導(dǎo)物對胚胎干細(xì)胞的分化能力是不同的，現(xiàn)已研究發(fā)現(xiàn)的誘導(dǎo)物除了細(xì)胞生長因子，還有地塞米松、甲狀腺素、前列腺素E2和抗壞血酸、中藥有效成分等。

3.2.2 間充質(zhì)干細(xì)胞

間充質(zhì)干細(xì)胞來源豐富，具有多向分化的能力，且不會因為來源不同而受到影響[16]，但是不同來源的間充質(zhì)干細(xì)胞有特定的分化譜系，如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞、滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞[17]、臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞[18]等?，F(xiàn)階段骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞都是軟骨組織工程的研究熱點。

3.2.2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來自中胚層，來源廣泛，具有高度自我更新和多向分化的潛能[19]；明顯的趨化性，向損傷組織集中；較強的免疫抑制性，利于自體或異體移植等生物特性，且其誘導(dǎo)分化成軟骨細(xì)胞的方法已經(jīng)相對成熟。目前較常使用的分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法是密度梯度離心與貼壁篩選結(jié)合，操作簡便且純度較高。研究證明，轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）以及胰島素生長因子具有明顯誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化[20]。另外地塞米松、維生素C、中藥[21]等也可誘導(dǎo)分化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨分化。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化軟骨移植術(shù)治療軟骨缺損已應(yīng)用于臨床。Bernardo等[22]通過實驗證明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相對于其他來源的種子細(xì)胞成軟骨能力最強。但是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量較少，僅占骨髓細(xì)胞的1/104～1/105。另有研究發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞存在培養(yǎng)傳代至90代后癌變的風(fēng)險[23]，其安全性還需要長期的研究和觀察。安榮澤等[24]研究發(fā)現(xiàn)在特定的單層培養(yǎng)條件下，脂肪干細(xì)胞及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞均能向軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，但脂肪干細(xì)胞的生長增殖孫渡較快，而骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有更高的潛能。

3.2.2.2 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞同樣來自中胚層，具有與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相似的生物特性，具有以下特點：取材方便，來源豐富，脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞較骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞豐富；抗原性低；不易發(fā)生癌變，易體外進化；且具有多向分化的潛能。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在地塞米松、VD3以及細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下可分化成軟骨細(xì)胞。國外研究表明脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在多向分化潛能、生長動力學(xué)、細(xì)胞衰亡、表面標(biāo)志等方面與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞無明顯差異。郭寶鋒等[25]體外培養(yǎng)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，傳代穩(wěn)定，間質(zhì)細(xì)胞及干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志CD34和CD13表達陽性，定向誘導(dǎo)后表現(xiàn)出軟骨特性。但研究表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化軟骨細(xì)胞能力較脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞較強[26]。也有研究推測，雖然脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞雖然能分化成軟骨細(xì)胞，但骨髓重建能力有限[27]。

3.3 軟骨細(xì)胞和干細(xì)胞共培養(yǎng)

現(xiàn)有的單一來源的種子細(xì)胞無法滿足組織工程修復(fù)軟骨缺損的需要，體外單一因子培養(yǎng)擴增的軟骨因子往往無法與體內(nèi)成熟的軟骨細(xì)胞融合修復(fù)；而干細(xì)胞分化成軟骨細(xì)胞所需的數(shù)量較大且分化培養(yǎng)費用昂貴，因此，越來越多的研究傾向于將兩類的種子細(xì)胞進行聯(lián)合培養(yǎng)。王萬宗等[28]選用第3代大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞按1∶1的細(xì)胞比例進行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞分泌物促進骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞樣分化，而骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，促進組織細(xì)胞分化，使關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞功能加強。謝鵬等[29]采用自體兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與同種異體的軟骨細(xì)胞按照2∶1的細(xì)胞比例培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)相對于單一軟骨細(xì)胞培養(yǎng)的模式，一方面軟骨細(xì)胞可促進骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化，另一方面減少軟骨細(xì)胞培養(yǎng)時間和傳代次數(shù)。李興福等[30]發(fā)現(xiàn)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的比例為5∶1時，可明顯促進人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化，并抑制細(xì)胞纖維化，降低成本。

4 種子細(xì)胞的培養(yǎng)

種子細(xì)胞采用單層細(xì)胞培養(yǎng)體系易向纖維細(xì)胞分化的傾向，目前僅用于軟骨細(xì)胞的擴增。三維立體培養(yǎng)體系有利于細(xì)胞的氣體交換，營養(yǎng)攝取以及廢物的排出，同時也有利于細(xì)胞外基質(zhì)的分泌。三維立體培養(yǎng)可降解，可制成缺損軟骨所需要修復(fù)的形狀進行培養(yǎng)。生物反應(yīng)器培養(yǎng)體系模擬人體內(nèi)細(xì)胞和組織的生長環(huán)境，其要求種子細(xì)胞均勻的分布在三維結(jié)構(gòu)上，給予一定的力學(xué)刺激，促進營養(yǎng)的供給和代謝的排出，降低成本。韓長旭等[31]發(fā)現(xiàn)理化因素在種子細(xì)胞的培養(yǎng)中，同樣占據(jù)著重要的作用，其通過對文獻的整理發(fā)現(xiàn)剪切力通常被對軟骨細(xì)胞表型認(rèn)為是有害的，現(xiàn)有的培養(yǎng)模式中的理化刺激需要改進?，F(xiàn)有模擬微重力旋轉(zhuǎn)、固體轉(zhuǎn)動、攪動混合旋轉(zhuǎn)、環(huán)繞混合等生物反應(yīng)器。Freed等[32]較為系統(tǒng)的研究了這4種生物反應(yīng)器，發(fā)現(xiàn)模擬微重力旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器系統(tǒng)因提供了培養(yǎng)環(huán)境所需的力學(xué)平衡，促進了軟骨細(xì)胞的形成。endprint

5 小結(jié)與展望

隨著軟骨組織修復(fù)工程研究的發(fā)展，軟骨組織工程中種子細(xì)胞源越來越豐富，尤其是共培養(yǎng)軟骨細(xì)胞在提高軟骨細(xì)胞的質(zhì)量和培養(yǎng)效率都取得了進步。雖然所面臨的前期困難已得到基本解決，如數(shù)量少、免疫性問題以及細(xì)胞表型不穩(wěn)定等，但不可否認(rèn)依然還存在諸多問題，如何確定種子細(xì)胞的安全性，提高種子細(xì)胞誘導(dǎo)分化的效率，其遠期療效的確定以及成分的降低。相信隨著種子細(xì)胞源的進一步豐富、純化及培養(yǎng)條件的優(yōu)化，種子細(xì)胞的問題終將得以解決，縮短組織工程修復(fù)軟骨缺損深入臨床應(yīng)用的距離。

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