野茼蒿對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠血清中促炎和抗炎細(xì)胞因子的干預(yù)作用

馮陳慧　彭凡珂　寇力丹

[摘要]目的 探討野茼蒿凍干粉對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎（UC）大鼠血清細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-8和IL-10表達(dá)的影響。方法 選取健康雄性SD大鼠76只，先隨機(jī)選出12只大鼠作為空白對(duì)照組，其余大鼠用TNBS/乙醇混合液誘導(dǎo)建立UC大鼠模型。造模成功后，所有大鼠每天用不同藥物灌胃處理，觀察大鼠的疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）。第21天后下腔靜脈取血，用ELISA法檢測(cè)其血清中的細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-8和IL-10含量。結(jié)果 與模型組和陽(yáng)性對(duì)照組比較，野茼蒿各劑量組促炎因子IL-6、IL-8、TNF-α含量不同程度降低（P<0.01或P<0.05），抗炎因子IL-10含量不同程度升高（P<0.01或P<0.05）。結(jié)論 野茼蒿凍干粉對(duì)UC大鼠的癥狀有一定的緩解作用，其機(jī)制或許與影響TNF-α、IL-6、IL-8、IL-10的表達(dá)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]潰瘍性結(jié)腸炎；野茼蒿；促炎細(xì)胞因子；抗炎細(xì)胞因子

[中圖分類號(hào)] R332 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2017）08（a）-0004-03

[Abstract]Objective To investigate the influence of freeze dried powder of Crassocephalum crepidioides on the expression of serum cytokines TNF-α，IL-6，IL-8 and IL-10 in rats with ulcerative colitis （UC）.Methods 76 healthy male SD rats were randomly selected.Twelve rats were randomly selected as blank control group.The other rats were induced with TNBS/ethanol mixture to establish UC rat model.After successful model，all rats were treated with different drugs every day to observe the disease activity index （DAI）.The level of TNF-α，IL-6，IL-8 and IL-10 in the serum were measured by ELISA.Results Compared with model group and positive control group，the level of proinflammatory cytokines IL-6，IL-8 and TNF-α were decreased in varying degrees （P<0.01 or P<0.05），and the level of anti-inflammatory factor IL-10 were increased in varying degrees in different dose group of Crassocephalum crepidioides （P<0.01 or P<0.05）.Conclusion The freeze-dried powder of Crassocephalum crepidioides has a certain effect on the symptoms of UC rats.The mechanism may be related to influencing the expression of TNF-α，IL-6，IL-8 and IL-10.

[Key words]Ulcerative colitis；Crassocephalum crepidioides；Proinflammatory cytokines；Antiinflammatory cytokines

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）的發(fā)病機(jī)制與免疫因素有關(guān)。近年來(lái)，中醫(yī)藥治療UC的分子生物學(xué)和免疫學(xué)研究也取得了一定進(jìn)展，白頭翁湯、黃芩湯、四逆湯、烏梅丸和參苓白術(shù)散等中成藥能改變UC大鼠血清或結(jié)腸組織中細(xì)胞因子含量[1]。研究表明，野茼蒿具有抑制肝癌和肺癌及皮膚癌癥等功效， 調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的作用[2]?，F(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)試驗(yàn)證明，野茼蒿可治療慢性腸胃病和習(xí)慣性便秘[3]，但是目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于野茼蒿的相關(guān)研究較少，亦無(wú)野茼蒿對(duì)UC大鼠血清中相關(guān)細(xì)胞因子的研究。本實(shí)驗(yàn)主要探討野茼蒿對(duì)UC大鼠細(xì)胞因子的影響，為野茼蒿對(duì)UC的藥用價(jià)值提供臨床依據(jù)。

1材料與方法

1.1主要試劑和儀器

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 76只雄性健康SD大鼠，體重（220±20）g，購(gòu)于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（黑）2013001。

1.1.2藥物與試劑 野茼蒿凍干粉：由小組成員于四川盆地采集，挑選光照充裕、長(zhǎng)勢(shì)良好的植株，采集后用清水洗凈，自然風(fēng)干。選取充分干燥的野茼蒿1 kg，用適量蒸餾水浸泡后，再加10倍體積的蒸餾水，煮沸2.5 h，重復(fù)3次，合并水煎液，用濾紙將溶液過(guò)濾，減壓真空濃縮，冷凍干燥形成凍干粉，于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆肹4]，野茼蒿凍干粉內(nèi)服成人用量為25～50 g/d，以50 g計(jì)算，按成人體重60 kg計(jì)算，成人用量大約為0.85 g/kg。大鼠低中高劑量按成人的2、4、8倍換算，則低中高三個(gè)劑量組的用量分別為1.7、3.4、6.8 g。所得樣品分別溶于2 ml雙蒸水中備用；2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：109K5008）的50%（體積分?jǐn)?shù)）的乙醇溶液；水合氯醛（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20130314）；96孔大鼠IL-6 ELISA試劑盒（產(chǎn)品編號(hào)：YY41731）、IL-8 ELISA試劑盒（產(chǎn)品編號(hào)：YY41716）、IL-10 ELISA試劑盒（產(chǎn)品編號(hào)：YY41736）、TNF-α ELISA（產(chǎn)品編號(hào)：YY41721）試劑盒：購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；柳氮磺胺吡啶（SASP）腸溶片（上海中西三維藥業(yè)有限公司，批號(hào)：31020450），成人用量2～3 g/d，（按3 g計(jì)算，以成人體重60 kg估算）成人用量約為0.05 g/kg。則大鼠用量為0.2 g/kg（按成人的4倍換算）將藥物用蒸餾水配成200 ml的溶液[5]，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩ndprint

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 UC大鼠造模 先隨機(jī)選取12只SD大鼠，正常飼養(yǎng)，不做處理，設(shè)定為空白對(duì)照組，余下的64只SD大鼠全部進(jìn)行造模處理。先對(duì)這64只大鼠禁食不禁水處理24 h，然后用腹腔注射法將10%水合氯醛（0.25 ml/100 g）注入大鼠腹腔內(nèi)對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，腹腔注射時(shí)注意將大鼠頭朝下，尾部?jī)A斜向上，使體內(nèi)臟器上移，避免注射器扎到內(nèi)臟。麻醉成功后，將TNBS/乙醇溶液（100 mg/kg TNBS+50%的乙醇0.25 ml）溶液緩慢推入大鼠肛門靠里一段距離，讓動(dòng)物保持下腹部上傾狀態(tài)，捏緊肛門4 min，放回籠中，自然清醒[6]。

1.2.2 分組 造模后觀察3 d，大鼠死亡2只，再隨機(jī)挑選2只大鼠處死，將這4只大鼠進(jìn)行解剖，取其結(jié)腸組織，確認(rèn)模型構(gòu)造成功。將剩下的UC大鼠隨機(jī)分為5組：模型組，野茼蒿低劑量組，野茼蒿中劑量組，野茼蒿高劑量組，陽(yáng)性對(duì)照組（SASP組），用苦味酸給各組大鼠進(jìn)行編號(hào)。

1.2.3 給藥方法 造模后第3天開(kāi)始，陽(yáng)性對(duì)照組給予SASP混懸液灌胃0.20 g/㎏；野茼蒿各劑量組分別給予0.85、1.70、3.40 g野茼蒿凍干粉溶液2 ml灌胃，空白對(duì)照組和模型組給予2 ml生理鹽水灌胃，1次/d，連續(xù)21 d。

1.2.4 評(píng)分 持續(xù)觀察大鼠體質(zhì)量變化、大便性狀、便血等情況。參照 Marines等[7]所列的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分，疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）=（體重+大便形態(tài)+大便出血）/3。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)體質(zhì)量下降、大便性狀正常、無(wú)便血記為 0分； 體質(zhì)量下降1%～5%記為1分；體質(zhì)量下降5%～10%、半稀便、大便隱血（+）記2分；體質(zhì)量下降10%～15%記為3分；體質(zhì)量下降>15%、稀便、便血記為4分。

1.2.5 取材及測(cè)定 各組大鼠最后一次灌胃后禁食不禁水24 h，用10%水合氯醛溶液（0.3 ml/kg體重）麻醉大鼠，下腔靜脈取血5 ml，離心后分離血清，用ELISA試劑檢測(cè)血清TNF-α、IL-6、IL-8、IL-10水平，檢測(cè)方法參照說(shuō)明書，記錄結(jié)果。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0處理，計(jì)量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組DAI評(píng)分的比較

空白對(duì)照組DAI值一直保持較低，且波動(dòng)不大，與空白對(duì)照組比較，模型組評(píng)分顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與模型組比較，各治療組評(píng)分均明顯降低（P<0.05或P<0.01）（表1）。

2.2各組細(xì)胞因子的比較

與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中IL-6，IL-8和TNF-α水平上升或顯著上升（P<0.05或P<0.01），IL-10水平顯著下降（P<0.01）；與模型組大鼠比較，野茼蒿中、高劑量組和SASP組大鼠血清IL-6，IL-8和TNF-α水平下降或顯著下降（P<0.05或P<0.01），IL-10值上升或顯著上升（P<0.05或P<0.01）（表2）。

3討論

UC是一種結(jié)腸和直腸的慢性炎癥性疾病，發(fā)病機(jī)制還不確切，結(jié)腸潰瘍、黏液膿血便、腹瀉等為其主要表現(xiàn)，該病病程長(zhǎng)，且容易復(fù)發(fā)，難以治愈。大部分學(xué)者認(rèn)為，UC的發(fā)病與環(huán)境、腸道微生物和遺傳易感性共同作用相關(guān)，這些因素引起腸道免疫功能失常，形成結(jié)腸和直腸炎癥性病變。慢性UC容易發(fā)展成結(jié)腸癌，因此受到國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注[8]。

免疫系統(tǒng)（包括免疫細(xì)胞、免疫因子及免疫球蛋白）對(duì)腸道反應(yīng)的調(diào)節(jié)有重要作用，UC的發(fā)病涉及T細(xì)胞亞群和炎癥介質(zhì)的變化[9]。近年來(lái)，研究表明，UC發(fā)生與發(fā)展的關(guān)鍵性因素就是免疫因素[10]，UC疾病進(jìn)程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)包括不同細(xì)胞因子之間的網(wǎng)絡(luò)作用[11]。其中，與UC病理過(guò)程密切相關(guān)的有TNF-α、IL-6、IL-8等促炎因子[12]和IL-4、IL-10等抗炎因子[13]，在UC的整個(gè)疾病進(jìn)程中，促炎因子和抗炎因子的持續(xù)失衡起非常重要的作用[14-15]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，造模各組不同程度出現(xiàn)精神萎靡、體重減輕、稀便、黏液血便等癥狀，且促炎因子TNF-α、IL-6、IL-8水平較高，而IL-10這一抗炎因子水平較低，表明在UC大鼠血清中，促炎因子升高，且升高程度與炎癥嚴(yán)重程度成正相關(guān)，抗炎因子降低，且降低程度與炎癥嚴(yán)重程度成負(fù)相關(guān)。與模型組比較，各給藥組大鼠這些癥狀持續(xù)時(shí)間較短，在給藥過(guò)程中，疾病活動(dòng)指數(shù)不同程度降低，且野茼蒿高劑量組的DAI評(píng)分比中低劑量組下降較明顯，炎癥程度也較輕；TNF-α、IL-6、IL-8水平下降，且劑量越高，下降越明顯， IL-10水平上升，劑量越高，上升越多，與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。隨著野茼蒿劑量的增加，UC大鼠的炎癥狀況逐漸得到改善，表明野茼蒿對(duì)UC的治療是有作用的，其機(jī)制可能是通過(guò)降低血清中促炎細(xì)胞因子IL-6、IL-8、TNF-α水平，升高血清中抗炎細(xì)胞因子IL-10水平，來(lái)減輕UC大鼠的炎癥反應(yīng)，起保護(hù)腸黏膜的作用。

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（收稿日期：2017-05-05 本文編輯：許俊琴）endprint