工業(yè)酒精發(fā)酵污染菌的分離及新型抑菌劑的應(yīng)用

劉穎，陳雄，廖蓓，李志軍，王志*

1(湖北工業(yè)大學(xué)，發(fā)酵工程教育部重點實驗室，湖北省工業(yè)發(fā)酵協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北省工業(yè)微生物重點實驗室，武漢，430068) 2(安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌，443000)

工業(yè)酒精發(fā)酵污染菌的分離及新型抑菌劑的應(yīng)用

劉穎1，陳雄1，廖蓓2，李志軍2，王志1*

1(湖北工業(yè)大學(xué)，發(fā)酵工程教育部重點實驗室，湖北省工業(yè)發(fā)酵協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北省工業(yè)微生物重點實驗室，武漢，430068) 2(安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌，443000)

為了研究新型抑菌劑在酒精發(fā)酵染菌控制中的應(yīng)用，從工業(yè)酒精發(fā)酵污染液分離出主要污染菌HG-201，其16S rDNA與Pantoeaananatis(JX215331)的核苷酸序列同源性為99%。在菌株HG-201生長對數(shù)中期添加新型抑菌劑葡萄糖氧化酶和溶菌酶，以確定對菌株HG-201的抑菌效果。將釀酒酵母與菌株HG-201以1∶30的接種比例進(jìn)行混合培養(yǎng)，并在發(fā)酵開始添加低濃度的抑菌劑。結(jié)果表明：10 U/mL的葡萄糖氧化酶和0.25 g/L的溶菌酶即可完全抑制菌株HG-201的生長和代謝，并且在實驗條件下對釀酒酵母生長以及乙醇的產(chǎn)量沒有影響，為新型抑菌劑在工業(yè)酒精發(fā)酵雜菌控制中的應(yīng)用提供了參考。

酒精發(fā)酵；污染菌；葡萄糖氧化酶；溶菌酶

釀酒酵母工業(yè)酒精發(fā)酵使用淀粉類原料做碳源，為了維持糖化酶活性，糖化過程溫度只有50 ℃左右。同時工業(yè)酒精發(fā)酵設(shè)備管道繁多，厭氧或兼性厭氧污染菌可由原料、水、空氣、管道以及設(shè)備死角等帶入發(fā)酵過程，因此，酒精發(fā)酵不是嚴(yán)格無菌的過程[1-2]。這些污染菌繁殖會消耗大量的碳源、氮源和氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)，從而降低酵母生長速率，減少生物量，甚至導(dǎo)致酵母的死亡[3-4]。常見的污染菌一般有醋酸菌[5]和乳酸菌[6]，它們可以在低pH、高酒精度以及低溶氧下生存，并且生成乙酸和乳酸。此外，污染菌的酸代謝會降低發(fā)酵液的pH，抑制酵母菌、淀粉酶和糖化酶的活力，降低酒精的產(chǎn)率[7-9]。

為了抑制工業(yè)酒精發(fā)酵過程中的雜菌污染，工業(yè)上一般應(yīng)用酸處理或者添加抗生物素的方法。酸處理是添加硫酸到酵母發(fā)酵醪中，利用酵母對氫離子的耐受性強(qiáng)于細(xì)菌的特性，維持pH值為3.5左右以抑制雜菌的生長[10]。酸處理不當(dāng)可能會降低酵母的活性，廢液中硫離子濃度過高也會增加廢水處理的難度，對環(huán)境有較大污染，不能作為工業(yè)上控制酒精發(fā)酵過程染菌的長久方法[11-12]；而添加抗生素如青霉素、氯霉素、土霉素等，除了很容易產(chǎn)生細(xì)菌耐藥性以外，抗生素也會殘留在酒槽中，從而對食品安全和公共安全造成嚴(yán)重威脅[13]，已經(jīng)被我國嚴(yán)禁添加。

具有抑菌生物活性的天然化合物如植物提取物[14]和功能酶[15]等新型抑菌劑可以有效抑制污染的雜菌，同時不會對環(huán)境造成危害[16]。隨著環(huán)境保護(hù)逐漸受到政府和社會的高度重視，新型抑菌劑的應(yīng)用成為解決工業(yè)酒精發(fā)酵雜菌污染的環(huán)境友好型途徑之一，如：葡萄糖氧化酶可以專一地將葡萄糖氧化成葡萄糖酸和過氧化氫，葡萄糖酸能夠降低發(fā)酵液中pH值，同時過氧化氫是廣譜殺菌劑，均可以達(dá)到抑菌效果[17]。溶菌酶可以水解細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖起到抑菌作用，對沒有肽聚糖組分的酵母細(xì)胞壁沒有影響。

本文對酒精發(fā)酵污染液中的雜菌進(jìn)行分離、純化和鑒定，確定雜菌主要為泛菌。由于文獻(xiàn)中報道酒精發(fā)酵污染菌主要是醋酸菌和乳酸菌，而泛菌很少報道。因此，通過酵母-泛菌混合發(fā)酵模擬染菌狀態(tài)，并側(cè)重研究了不同抑菌劑(葡萄糖氧化酶、溶菌酶)對泛菌和酵母生長代謝的影響，旨在為工業(yè)酒精發(fā)酵過程中對雜菌的控制提供理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1主要材料、試劑與儀器

酒精發(fā)酵污染液(來源于安特食品股份有限公司)、葡萄糖氧化酶和溶菌酶(由安琪酵母股份有限公司提供)。

DELTA 320 pH計，梅特勒托利多儀器(上海)有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；Nikon ECLIPSE E100生物顯微鏡，上海光學(xué)儀器五廠；TG18M臺式高速離心機(jī)，長沙平凡儀器儀表有限公司；HNY-211B全溫振蕩培養(yǎng)箱，天津歐諾儀器儀表有限公司；UVmini-1240紫外可見分光光度計，島津；生物傳感儀SBA-40，山東省科學(xué)院生物研究所；THOMA細(xì)菌計數(shù)板，深度0.02 mm，每個小方格面積1/400 mm2。

1.2培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖20，蛋白胨10，酵母浸粉5，NaCl 10，瓊脂粉20。培養(yǎng)基中加入抗真菌劑(如放線菌酮和制霉素)，質(zhì)量濃度為50 μg/mL，以抑制真菌的生長。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基 (g/L): 葡萄糖10，酵母浸粉2，蛋白胨10，NaCl 10。

YEPD培養(yǎng)基 (g/L): 葡萄糖20，蛋白胨10，酵母浸粉10。

釀酒酵母混菌發(fā)酵培養(yǎng)基 (g/L): 葡萄糖60，酵母浸粉10，蛋白胨10，K2HPO41.5，MgSO41.0，(NH4)2SO41.5，NaCl 1.0，CaCl21.0。

培養(yǎng)基配好后分裝至250 mL搖瓶，115 ℃滅菌15 min。

1.3培養(yǎng)方法

1.3.1 污染菌株的分離純化

吸取1 mL充分搖勻的污染液于9 mL無菌水中，采用10倍梯度稀釋法制成10-4、10-5、10-6、10-7稀釋液度稀釋，涂布于富集培養(yǎng)基平板上，放置30℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h后根據(jù)菌落形態(tài)特征，挑取不同的單菌落，番紅染色鏡檢。挑取菌體形態(tài)不同的單菌落再次劃線培養(yǎng)，重復(fù)多次獲得純種。

1.3.2 16S rDNA基因序列分析

用DNA提取盒提取分離到菌株的DNA，對獲得的總基因組DNA進(jìn)行16S rDNA的PCR擴(kuò)增。采用的引物分別為：27f: AGAGTTTGATCMTGGCTCAG ；1492R: TACGGYTACCTTGTTACGACTT

擴(kuò)增條件:預(yù)變性95 ℃ 5 min；變性95 ℃ 30 s；退火62 ℃ 30 s；延伸72℃ 1 min；35cycle；72 ℃ 10 min，20 ℃ forever。將PCR片段回收、測序。將測序結(jié)果到NCBI數(shù)據(jù)庫里進(jìn)行序列比對。

1.3.3 污染菌株生長曲線測定

將污染菌接至基礎(chǔ)培養(yǎng)基試管斜面上，30 ℃活化24 h，加入10 mL無菌水制備種子菌懸液。以10%(v/v)的接種量接入種子搖瓶(裝液量50 mL，基礎(chǔ)培養(yǎng)基)，在30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)24 h，獲得二級種子液。再以10%(v/v)的接種量轉(zhuǎn)接入發(fā)酵搖瓶(裝液量25 mL，基礎(chǔ)培養(yǎng)基)，在30 ℃、100 r/min條件下培養(yǎng)。周期取樣，用分光光度法測菌懸液OD600 nm，繪制生長曲線。

1.3.4 抑菌劑濃度的確定

選用葡萄糖氧化酶的濃度為0、5、10、20、30 U/mL；溶菌酶的質(zhì)量濃度為0、0.25、0.5、1、2 g/L，分別經(jīng)0.22 μm的濾膜過濾后備用。

在污染菌的發(fā)酵對數(shù)中期添加不同濃度的抑菌劑，周期取樣，分光光度法測菌懸液OD600 nm。根據(jù)污染菌生長速率的變化確定抑菌濃度。

1.3.5 抑菌劑對釀酒酵母的作用

將釀酒酵母接至YEPD斜面(2%瓊脂)活化12 h，加入10 mL無菌水制備種子菌懸液，以10%(v/v)的接種量轉(zhuǎn)接至種子搖瓶(裝液量50 mL，YEPD培養(yǎng)基)，在30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)培養(yǎng)12 h，獲得二級種子液，再以10%接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵搖瓶(裝液量50 mL，YEPD培養(yǎng)基)。接種時分別加入兩種抑菌劑(10 U/mL的葡萄糖氧化酶和0.25 g/L的溶菌酶)，周期取樣，分光光度法測菌體懸浮液OD600 nm。

1.3.6 釀酒酵母與HG-201菌株混合發(fā)酵與抑菌劑評價

1.3.6.1 釀酒酵母與HG-201菌株混合發(fā)酵最適接種比例的確定

制備釀酒酵母和污染菌二級種子液，無菌取樣稀釋，用細(xì)菌計數(shù)板對二級種子液中酵母(40倍鏡)和污染菌(100倍油鏡)分別計數(shù)。計算接種體積，使發(fā)酵培養(yǎng)基中釀酒酵母接種總細(xì)胞數(shù)為3.2×108個，發(fā)酵起始的細(xì)胞濃度為6.4×106/mL。將3.2×108個釀酒酵母細(xì)胞與不同體積的污染菌種子液接入新鮮混合發(fā)酵培養(yǎng)基中(裝液量50 mL，混菌發(fā)酵培養(yǎng)基)，使釀酒酵母與污染菌的細(xì)胞數(shù)比例為1∶10、1∶30、1∶50和1∶100。以只接3.2×108個釀酒酵母細(xì)胞的搖瓶作為對照。在30 ℃，200 r/min條件下培養(yǎng)12 h后取樣計數(shù)。酵母細(xì)胞生長被明顯抑制的實驗組確定為最適接種比例。

1.3.6.2 釀酒酵母與污染菌株混合發(fā)酵與添加抑菌劑效果評價

按照1.3.6.1所述培養(yǎng)方法將釀酒酵母細(xì)胞和污染菌二級種子液按最適接種比例接入新鮮混合發(fā)酵培養(yǎng)基中(裝液量50 mL，混菌發(fā)酵培養(yǎng)基)，發(fā)酵起始酵母細(xì)胞濃度為6.4×106/mL。后采用如下設(shè)計進(jìn)行抑菌劑抑菌效果評價實驗。(1) 只接酵母；(2) 接酵母和污染菌；(3) 接酵母和污染菌同時添加葡萄糖氧化酶；(4) 接酵母和污染菌并添加溶菌酶。周期取樣，用細(xì)菌計數(shù)板計數(shù)。根據(jù)不同條件下酵母菌和污染菌的生長情況評價抑菌劑抑菌效果。

1.4測定方法

1.4.1 菌體濃度測定

使用分光光度法測定：將樣品稀釋一定濃度，吸取5 mL至10 mL離心管中，6 500 r/min離心5 min，取上清做對照，測稀釋后的菌懸液OD600 nm值。

1.4.2 菌體數(shù)測定

使用細(xì)菌計數(shù)板計數(shù)。

1.4.3 揮發(fā)性脂肪酸(VFA)的測定

采用比色法[18]。

1.4.4 乙醇測定

使用生物傳感儀測定。

1.5數(shù)據(jù)處理

所有實驗數(shù)據(jù)為3個重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，采用origin 8.0對實驗數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1污染菌分離純化與鏡檢

稀釋度為10-6的富集培養(yǎng)基平板上菌落形態(tài)分為3種，其中75%為乳白色、大而圓潤的菌落，鏡檢發(fā)現(xiàn)細(xì)胞存在明顯的出芽生殖特點，判斷為酒精發(fā)酵的生產(chǎn)菌株——釀酒酵母。另外，還存在約20%的黃色、小且光滑的菌落和約5%的白色褶皺菌落，分別鏡檢，初步判斷為桿狀細(xì)菌。前者保存命名為HG-201，后者保存命名為HG-202。顯然，實驗條件下主要污染的雜菌為菌株HG-201，因此，后續(xù)實驗均以HG-201為研究對象。

2.216SrDNA基因序列分析

2.2.1 菌株HG-201的16S rDNA基因片段PCR產(chǎn)物擴(kuò)增電泳圖(圖1)

圖1 菌株HG-201的16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 16S rDNA PCR electropherogram of strain HG-201

2.2.2 菌株HG-201 的16S rDNA基因序列

測序結(jié)果如下：

ATCATACGGAGCTACCATGCAGTCGGACGGTA￣GCAC￣AGAGGAGC￣TTG￣CTCC￣TTG￣GGTGACGAG￣TG￣G￣C￣G￣GA￣CG￣GGTGAGTAATGTCTG￣GGGATCTGCCCGATA￣GAGGGGGAT￣AACCACT￣GGAAACGGTGGCTAATA￣C￣C￣G￣CA￣TA￣ACGTCGC￣AAG￣ACCAAA￣GAGGG￣GGACCT￣TC￣G￣G￣GC￣CTCTCA￣CTATCG￣GATGAAC￣CCAGATGGGATT￣A￣G￣C￣T￣A￣G￣TA￣G￣G￣C￣G￣G￣G￣G￣T￣A￣A￣TG￣G￣C￣C￣C￣AC￣C￣T￣AG￣GCG￣A￣C￣G￣ATC￣CCTA￣GCT￣GGT￣TGAGA￣GG￣AT￣GA￣CCA￣G￣C￣C￣A￣C￣A￣C￣T￣G￣G￣A￣ACTGAGA￣C￣AC￣GGT￣C￣￣C￣AGAC￣T￣C￣C￣T￣A￣C￣GGGAG￣G￣C￣￣A￣G￣C￣￣A￣GT￣GG￣GG￣A￣A￣T￣A￣￣T￣T￣GC￣A￣C￣A￣A￣￣T￣GGGC￣￣GC￣A￣A￣GC￣￣C￣￣T￣￣G￣A￣￣T￣G￣C￣A￣GC￣C￣A￣￣T￣GC￣C￣￣G￣C￣G￣T￣G￣T￣￣A￣T￣G￣A￣A￣￣G￣A￣A￣G￣G￣C￣C￣T￣T￣C￣￣G￣G￣G￣T￣T￣￣G￣T￣A￣A￣A￣G￣T￣A￣C￣T￣T￣T￣C￣￣A￣G￣￣C￣G￣G￣G￣G￣￣A￣G￣G￣A￣￣A￣G￣G￣C￣G￣A￣￣T￣G￣C￣G￣G￣T￣T￣￣A￣A￣T￣A￣A￣C￣￣C￣G￣C￣G￣T￣￣C￣G￣A￣T￣￣T￣G￣A￣C￣G￣T￣￣T￣A￣C￣C￣C￣G￣C￣A￣￣G￣A￣￣A￣G￣A￣A￣G￣C￣A￣C￣C￣G￣G￣C￣T￣A￣A￣C￣￣T￣C￣C￣G￣T￣G￣C￣C￣A￣G￣C￣A￣G￣C￣C￣G￣C￣G￣G￣T￣A￣A￣T￣A￣C￣G￣G￣A￣G￣G￣G￣T￣G￣C￣A￣A￣G￣C￣G￣T￣T￣A￣A￣T￣C￣G￣G￣A￣A￣T￣T￣A￣C￣T￣G￣G￣G￣C￣G￣T￣A￣A￣A￣G￣C￣G￣C￣A￣C￣G￣C￣A￣G￣G￣C￣G￣G￣T￣C￣T￣G￣T￣T￣A￣A￣G￣￣T￣C￣A￣G￣A￣T￣G￣T￣￣G￣A￣A￣A￣T￣C￣C￣C￣C￣G￣G￣G￣C￣T￣T￣A￣A￣C￣C￣T￣G￣G￣G￣A￣￣A￣C￣T￣G￣C￣A￣T￣T￣T￣G￣A￣A￣A￣C￣T￣G￣G￣C￣A￣G￣G￣C￣T￣T￣G￣￣A￣G￣T￣C￣T￣T￣G￣T￣A￣G￣A￣G￣G￣G￣G￣G￣G￣T￣A￣G￣A￣￣A￣T￣T￣C￣C￣A￣G￣G￣T￣G￣T￣A￣G￣C￣G￣G￣T￣G￣A￣A￣A￣￣T￣G￣C￣G￣T￣A￣G￣A￣G￣A￣T￣C￣T￣G￣G￣A￣G￣G￣A￣A￣T￣A￣C￣C￣G￣G￣T￣G￣G￣C￣G￣A￣A￣G￣G￣C￣G￣G￣C￣C￣C￣C￣C￣T￣G￣￣G￣A￣C￣A￣A￣A￣G￣A￣C￣T￣G￣A￣C￣￣G￣C￣T￣C￣G￣G￣T￣G￣C￣G￣A￣￣A￣A￣G￣C￣G￣T￣G￣G￣G￣G￣A￣G￣C￣A￣A￣A￣C￣A￣G￣G￣A￣T￣T￣￣A￣G￣A￣T￣A￣C￣C￣C￣T￣G￣G￣T￣A￣G￣T￣￣C￣C￣A￣C￣G￣C￣C￣G￣T￣A￣A￣A￣C￣G￣A￣T￣G￣T￣C￣G￣A￣C￣T￣T￣G￣G￣A￣G￣G￣T￣T￣G￣T￣T￣C￣C￣￣C￣T￣T￣G￣A￣G￣G￣A￣G￣￣T￣G￣G￣C￣T￣T￣C￣C￣G￣G￣A￣G￣C￣T￣A￣A￣C￣G￣C￣￣G￣T￣T￣A￣A￣G￣T￣C￣G￣A￣C￣C￣G￣C￣C￣T￣G￣G￣G￣G￣A￣G￣T￣A￣C￣G￣￣G￣C￣C￣G￣C￣A￣A￣G￣G￣￣T￣T￣A￣A￣A￣C￣T￣C￣A￣A￣A￣T￣G￣A￣A￣T￣T￣G￣A￣C￣G￣G￣G￣G￣G￣C￣C￣C￣G￣C￣A￣C￣A￣￣A￣G￣C￣G￣G￣T￣G￣G￣A￣G￣C￣A￣T￣G￣￣T￣G￣G￣T￣T￣T￣A￣A￣T￣T￣C￣G￣A￣T￣G￣￣C￣A￣A￣C￣G￣C￣G￣A￣A￣G￣A￣T￣C￣T￣T￣T￣A￣￣￣C￣C￣T￣A￣C￣T￣C￣T￣T￣G￣A￣C￣A￣￣T￣C￣C￣A￣G￣C￣G￣A￣A￣C￣T￣￣T￣G￣G￣C￣A￣G￣A￣G￣A￣T￣G￣￣C￣A￣T￣T￣A￣G￣T￣G￣C￣T￣T￣C￣￣G￣G￣A￣A￣C￣CT￣G￣A￣G￣A￣

2.2.3 菌株HG￣-201的16S rDNA基因發(fā)育樹

菌株HG-201的16S rDNA核苷酸序列在NCBI中BLAST后，結(jié)果顯示它與Pantoeaananatis菌的16S rDNA的核苷酸序列同源性為99%。用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)，表明菌株HG-201在Pantoea屬進(jìn)化樹一個分支上，與Pantoeaananatis種的菌株在一個類群內(nèi)而與其他種處于不同的分枝。

圖2 菌株HG-201基于16S rDNA基因發(fā)育樹圖Fig.2 16S rDNA gene-based phylogenetic tree of strain HG-201

玉米基質(zhì)燃料乙醇發(fā)酵工藝通常為40～50 ℃糖化2～3 h后30～33 ℃發(fā)酵60～70 h，針對發(fā)酵過程染菌問題也有很多學(xué)者在研究，通常認(rèn)為醋酸菌[5]和乳酸菌[6]是主要污染雜菌，它們通過生長、代謝產(chǎn)酸會對釀酒酵母產(chǎn)生競爭性抑制作用[8-9]。本文酒精發(fā)酵污染樣取自玉米基質(zhì)酒精發(fā)酵頭罐，確定了泛菌也是發(fā)酵主要污染菌之一。不僅如此，安徽茂源(木薯基質(zhì))發(fā)酵尾罐樣品和安徽皖神(木薯基質(zhì))發(fā)酵混合樣品也都不同程度地檢出了泛菌(未發(fā)表資料)，說明隨著酒精發(fā)酵工藝的不斷革新，酒精發(fā)酵中染菌的原因也出現(xiàn)了新的可能。

2.3菌株HG-201生長曲線

由圖3可以看出，菌株HG-201在0～6 h為指數(shù)生長期，6 h以后為穩(wěn)定期。因此選定在3 h菌株種子活力最強(qiáng)時添加抑菌劑，若抑菌劑對HG-201有抑菌作用，則菌株生長曲線從3 h開始呈平緩(或下降)的趨勢。

圖3 菌株HG-201生長曲線Fig.3 Growth curve of strain HG-201

2.4抑菌劑抑菌濃度的確定

如圖4A所示: 相比對照組，0.25 g/L溶菌酶對菌株HG-201幾乎可以起到殺菌作用，而隨著溶菌酶濃度的升高，HG-201存活率逐漸降低，但菌懸液OD值水平偏高，可能是由于溶菌酶使細(xì)菌破壁后，細(xì)菌碎片影響OD值。因此，0.25～2 g/L濃度的溶菌酶都可以抑制HG-201的生長。如圖4B所示: 5 U/mL葡萄糖氧化酶在3～5 h對菌株HG-201有抑菌作用，5 h以后生物量持續(xù)增加。10～30 U/mL葡萄糖氧化酶對HG-201的抑菌作用基本一致，HG-201菌懸液的OD值在3～8 h內(nèi)僅從3.3增加到4.3左右。因此，10 U/mL的葡萄糖氧化酶可以作為實驗濃度進(jìn)行下一步的實驗。

圖4 不同濃度溶菌酶(A)和葡萄糖氧化酶(B)對菌株HG-201的抑菌作用Fig.4 The antibacterial effect of different concentrations of glucose oxidase(A)and lysozyme (B) on strain HG-201

2.5不同抑菌劑對釀酒酵母生長的影響

根據(jù)圖4的結(jié)果，選用10 U/mL葡萄糖氧化酶和0.25 g/L溶菌酶考察其對酵母生長的影響。如圖5所示：添加抑菌劑組中釀酒酵母的生長與對照組中一致。因此，2種抑菌劑在該濃度下對酵母的生長都沒有抑制作用，均可進(jìn)行下一步混菌發(fā)酵實驗。

圖5 10 U/mL葡萄糖氧化酶和0.25 g/L溶菌酶對釀酒酵母的作用Fig.5 Effects of 10 U/mL glucose oxidase and 0.25 g/L lysozyme on the growth of S. cerevisiae

2.6釀酒酵母與HG-201菌株混合發(fā)酵與抑菌劑評價

2.6.1 釀酒酵母與HG-201菌株初始接種比例的確定

為了模擬工業(yè)水平釀酒酵母酒精發(fā)酵的染菌狀態(tài)，使體系在發(fā)酵開始便處于嚴(yán)苛的染菌狀態(tài)，在混合發(fā)酵前確定釀酒酵母與污染菌接種比例尤為重要。如圖6所示：純酵母發(fā)酵12 h的細(xì)胞數(shù)達(dá)到7.8×108/mL。酵母與菌株HG-201的接種比例1∶10時，HG-201對酵母的生長幾乎沒有影響，12 h的酵母細(xì)胞數(shù)達(dá)到7.9×108/mL。然而接種比例為1∶30時，酵母細(xì)胞數(shù)僅為2.77×108/mL，較純酵母細(xì)胞數(shù)減少了64%。隨著接種比例的提高(1∶50和1∶100時)，酵母的細(xì)胞數(shù)相比1∶30的接種比例減少幅度不大。因此，選擇1∶30作為酵母與HG-201混合發(fā)酵的初始接種比例。

圖6 不同混合比培養(yǎng)條件下12 h時釀酒酵母與HG-201的細(xì)胞數(shù)Fig.6 Cell numbers of S. cerevisiae and HG-201 at 12 h in different initial mixture ratios

2.6.2 酵母與HG-201混菌發(fā)酵以及添加抑菌劑效果評價

如圖7所示：釀酒酵母與HG-201進(jìn)行混菌發(fā)酵，0 h釀酒酵母細(xì)胞濃度為6.4×106/mL，HG-201細(xì)胞濃度為1.92×108/mL。不添加抑菌劑時(對照)菌株HG-201在0～6 h指數(shù)生長，6 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，而添加抑菌劑可以有效抑制污染菌的生長。

圖7 添加抑菌劑對混菌發(fā)酵中菌株HG-201(A)和釀酒酵母(B)生長的影響Fig.7 The effect of antibacterial agents on the growth of HG-201(A) and S.cerevisiae (B) in mixed fermentation

其中，溶菌酶抑制效果最明顯，可以起到殺菌作用，HG-201的細(xì)胞數(shù)(2～10 h)維持在0.98×108/mL左右，僅為對照的5%～28%。其次是葡萄糖氧化酶，HG-201的細(xì)胞數(shù)(4～10 h)維持在4.5×108/mL左右，僅為對照的28%～40%。如圖7B可知：釀酒酵母與HG-201混菌發(fā)酵，不添加抑菌劑時(對照)，酵母的細(xì)胞數(shù)明顯降低，比酵母純發(fā)酵(2～10 h)的細(xì)胞數(shù)減少25%～62%。添加抑菌劑時，酵母的生長和細(xì)胞數(shù)與純酵母幾乎一致。添加葡萄糖氧化酶 4 h以后生長速率比純酵母還高。以上結(jié)果表明：添加抑菌劑對混菌發(fā)酵中酵母的生長無抑制作用。

工業(yè)酒精發(fā)酵時，發(fā)酵是否異常一般依據(jù)發(fā)酵階段每個時期的總酸和揮發(fā)酸來判斷。因此，通過檢測釀酒酵母與菌株HG-201混菌發(fā)酵過程中的揮發(fā)性有機(jī)酸生成量，來驗證抑菌劑對HG-201的抑菌效果。同時檢測乙醇產(chǎn)量來判斷添加抑菌劑對酵母乙醇產(chǎn)量是否有影響。

由于雜菌HG-201可以發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸[19]，因此，如圖8A所示：酵母和HG-201混菌發(fā)酵不添加抑菌劑時(對照組) VFA在2 h的濃度達(dá)到3.78 g/L，相比純酵母發(fā)酵(2.97 g/L)高出27%。而添加抑菌劑組2 h的VFA濃度都接近3 g/L，與純酵母發(fā)酵所產(chǎn)的VFA濃度接近。2～10 h所有實驗組VFA積累量總體都呈下降趨勢，說明這些揮發(fā)性小分子酸可以作為碳源在葡萄糖不足時被釀酒酵母重新利用，與文獻(xiàn)[20]報道一致。

圖8 抑菌劑對混菌發(fā)酵中VFA(A)和乙醇(B)濃度的影響Fig.8 The effect of antibacterial agents on VFA and ethanol production in mixed fermentation

圖8B顯示了抑菌劑對混菌發(fā)酵產(chǎn)乙醇的影響，0～6 h乙醇緩慢積累，6 h以后隨著葡萄糖的消耗，生成大量乙醇。純酵母組和添加不同抑菌劑組在10 h乙醇量都積累到14 g/L左右。而混菌發(fā)酵不添加抑菌劑的對照組在10 h僅積累了8.82 g/L的乙醇，產(chǎn)量減少了37%。因此，添加抑菌劑可以抑制污染菌的生長以及產(chǎn)酸，并且在實驗條件下對酵母的乙醇產(chǎn)量幾乎沒有影響。

3 結(jié)論

針對工業(yè)酒精發(fā)酵染菌問題，本文研究了新型抑菌劑對污染菌的抑菌作用。具體結(jié)論如下：

(1) 本實驗條件下，從酒精發(fā)酵污染液中分離得到菌株HG-201，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定為泛菌。

(2)確定了10 U/mL的葡萄糖氧化酶和0.25 g/L的溶菌酶即可分別對菌株HG-201的生長產(chǎn)生顯著的抑制作用，而對酵母純培養(yǎng)的生長沒有影響。

(3) 通過將釀酒酵母與HG-201混合發(fā)酵模擬酒精發(fā)酵染菌狀態(tài)，不添加抑菌劑時，HG-201生長旺盛，酵母生長受到抑制，VFA生成量增加27%，乙醇產(chǎn)量減少37%。添加抑菌劑時，菌株HG-201的生長受到顯著抑制，酵母的生長、乙醇和VFA生成趨勢較純酵母發(fā)酵幾乎沒有差別。

綜上所述，2種新型抑菌劑對污染菌HG-201都有很好抑菌效果，為新型抑菌劑應(yīng)用于工業(yè)酒精發(fā)酵過程中對雜菌的控制提供了參考。

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Isolationofcontaminationbacteriafromindustrialscalealcoholfermentationandapplicationofnovelantibacterialagents

LIU Ying1, CHEN Xiong1, LIAO Bei2, LI Zhi-jun2, WANG Zhi1*

1 (Key Laboratory of Fermentation Engineering (Ministry of Education), Hubei Provincial Cooperative Innovation Center of Industrial Fermentation, Hubei Key Laboratory of Industrial Microbiology, Hubei University of Technology, Wuhan 430068，China) 2 (Hubei Angel Yeast Limited by Share Ltd， Yichang 443003，China)

In order to study the application of the novel antibacterial agents for the contamination bacteria control in alcohol fermentations, the main contaminating strain HG-201 was isolated from the alcoholic fermentation liquor. 16S rDNA sequence analysis of strain HG-201 showed 99% homology toPantoeaananatis(JX215331). The effect of antibacterial agents on strain HG-201 was determined by adding novel antibacterial agents, namely， glucose oxidase and lysozyme, at mid-exponential growth phase of strain HG-201. The mixed fermentations ofSaccharomycescerevisiaeand strain HG-201 were inoculated at the ratio of 1/30, and the antibacterial agents with low concentration were added at the beginning of the fermentation. The results showed that 10 U/mL glucose oxidase and 0.25 g/L lysozyme could completely inhibit the growth and metabolism of strain HG-201 and had no effects on the growth ofSaccharomycescerevisiaeand the ethanol yield under experimental conditions. It provides a reference for the application of new antibacterial agents in the contamination bacteria control in industrial scale ethanol fermentation.

alcohol fermentation; contamination bacteria; glucose oxidase; lysozyme

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014343

碩士研究生(王志副教授為通訊作者,E-mail:476462848@qq.com)。

2017-03-20，改回日期：2017-05-12