三氧化二砷對MRL/lpr狼瘡鼠T-bet/GATA3信號通路的影響*

朱曉芳， 胡宏葉， 李永吉， 朱小春， 張 章， 陳 丹△

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 1風(fēng)濕免疫科， 2腫瘤外科， 浙江 溫州 325000)

三氧化二砷對MRL/lpr狼瘡鼠T-bet/GATA3信號通路的影響*

朱曉芳1， 胡宏葉2， 李永吉1， 朱小春1， 張 章1， 陳 丹1△

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院1風(fēng)濕免疫科，2腫瘤外科， 浙江 溫州 325000)

目的： 本文旨在探討三氧化二砷(arsenic trioxide，ATO)對MRL/lpr狼瘡鼠T-bet/GATA3信號通路的影響及其作用機制。方法: 將20周齡MRL/lpr狼瘡鼠和正常C57BL/6J小鼠隨機分組，分別接受ATO (0.4 mg·kg-1·d-1)和同體積生理鹽水(NS)治療2個月，分離脾臟淋巴細(xì)胞，然后用實時熒光定量PCR法檢測T-bet、GATA3、IFN-γ、IL-4的mRNA水平及T-bet/GATA3 mRNA的比值，Western blot法檢測T-bet和GATA3的蛋白表達，ELISA法檢測血清中IFN-γ和IL-4的濃度。結(jié)果: (1)MRL/lpr狼瘡鼠NS組T-bet、IFN-γ的mRNA及蛋白表達、T-bet/GATA3 mRNA比值均高于C57BL/6J小鼠NS組(P<0.05)，而GATA3、IL-4的mRNA及其蛋白表達均低于C57BL/6J小鼠NS組(P<0.05)；(2) 在MRL/lpr狼瘡鼠中，與NS組相比，ATO組T-bet、IFN-γ的mRNA及蛋白表達、T-bet/GATA3 mRNA比值均下降(P<0.05)，而2組中GATA3、IL-4的mRNA及蛋白表達無明顯差異；(3) 在C57BL/6J小鼠中，NS組和ATO組之間以上指標(biāo)均無顯著性差異。結(jié)論: ATO可能通過影響MRL/lpr狼瘡鼠T-bet/GATA3信號通路，降低T-bet表達，從而減少Th1型細(xì)胞因子IFN-γ的表達和分泌。

三氧化二砷； MRL/lpr狼瘡鼠； T-bet/GATA3信號通路； IFN-γ； IL-4

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種病因不明的，以自身抗體產(chǎn)生過多和多器官受累為特點的自身免疫性疾病[1]。研究發(fā)現(xiàn)Th1/Th2比例的失衡及其相應(yīng)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的紊亂是導(dǎo)致SLE發(fā)病的重要機制[2-3]。而Th細(xì)胞分化是由相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，其中T-bet(T-box基因家族新型的轉(zhuǎn)錄因子)和GATA結(jié)合蛋白3(GATA binding protein 3，GATA3)分別是Th1和Th2細(xì)胞分化的主要驅(qū)動者[4]，二者表達異?？梢杂绊懨庖邞?yīng)答,從而導(dǎo)致免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)失衡。并且有研究表明SLE病人及狼瘡模型鼠中存在T-bet/GATA3信號通路的異常[5]。三氧化二砷(arsenic trioxide，ATO)是我國傳統(tǒng)中藥砒霜的主要成分，已成功應(yīng)用于急性白血病及一些腫瘤的治療[6-7]。國外研究[8]及我們的前期研究[9-10]均表明ATO是一種治療SLE很有前景的藥物，但ATO是否是通過對MRL/lpr狼瘡鼠T-bet/GATA3信號通路的影響來調(diào)節(jié)狼瘡鼠Th1/Th2比例的失衡是本次研究的目的。

材料和方法

1動物

20周齡MRL/lpr狼瘡鼠20只，體重36～42 g，20周齡C57BL/6J小鼠20只，體重20～22 g，購自中國科學(xué)院上海實驗動物中心，飼養(yǎng)在溫州醫(yī)學(xué)院動物實驗中心SPF級動物房。

2主要試劑和器材

三氧化二砷鈉注射針劑(哈爾濱伊達藥業(yè)有限公司)；小鼠淋巴細(xì)胞分離液(北京索萊寶)；鼠細(xì)胞因子ELISA試劑盒(深圳晶美生物工程有限公司)；Trizol購自Invitrogen；RT-qPCR試劑盒購自TOYOBO；實驗中所用引物由Invitrogen合成，具體序列見表1；實時熒光定量PCR 儀采用ABI的StepOne Plus Real-time PCR System；垂直電泳儀(Bio-Rad)；酶標(biāo)儀(Bio-Tek)。

3主要方法

3.1實驗分組 MRL/lpr狼瘡鼠和C57BL/6J小鼠均隨機平均分成2組：(1)ATO組：0.4 mg·kg-1·d-1，腹腔注射；(2)生理鹽水(NS)組：作為陰性對照組，根據(jù)ATO溶液體積按體重取量，腹腔注射。給藥持續(xù)2個月，于實驗起點和終點采尾血標(biāo)本，分離血清于 -70 ℃保存待測。

表1 引物序列

3.2脾臟淋巴細(xì)胞制備 藥物或NS作用2月后，頸椎脫臼法處死小鼠后，無菌條件下取出脾臟，用200目篩網(wǎng)輕輕研磨脾臟過濾成單細(xì)胞懸液，采用密度梯度離心法自脾臟單細(xì)胞懸液中分離小鼠淋巴細(xì)胞，用冷PBS洗滌2次，重懸于10% FCS-RPMI-1640中，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×109/L，臺盼藍(lán)染色法測定細(xì)胞存活率(>98%)。

3.3血清IFN-γ、IL-4濃度的測定 采用ELISA法，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作，顯色后在全自動酶標(biāo)儀上450 nm波長處讀取吸光度(A)值，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出指標(biāo)含量。

3.4實時熒光定量PCR法檢測各組細(xì)胞T-bet、GATA3、IFN-γ及IL-4 mRNA的表達 用Trizol法抽提RNA，測定RNA濃度，取 2 μg的RNA按照說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。以β-actin 為內(nèi)參照，用實時熒光定量PCR進行T-bet、GATA3、IFN-γ、IL-4以及β-actin 產(chǎn)物擴增及結(jié)果分析。PCR循環(huán)條件設(shè)置為:94 ℃10 min；94 ℃ 20 s、60 ℃ 1 min，擴增50個循環(huán)；反應(yīng)完成后再于95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min、95 ℃ 15 s繪制熔解曲線。根據(jù)Livak和Schmittgen設(shè)計的閾值法測定目的基因的相對表達水平，目的基因量以2-ΔΔCt法計算，將C57BL/6J小鼠NS組(C57 NS)作為樣本校正，其表達水平設(shè)置為1，ΔΔCt=[Ct目的基因(其它實驗組)-Ct內(nèi)參照(其它實驗組)]-[Ct目的基因(C57 NS)-Ct內(nèi)參照(C57 NS)]。

3.5Western blot法檢測T-bet、GATA3蛋白的表達 收集脾臟淋巴細(xì)胞，用RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法檢測待測蛋白的濃度。將10 μg蛋白樣品與4倍體積上樣緩沖液混勻，100 ℃加熱10 min充分變性。經(jīng)15% SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜。加入5%脫脂奶粉室溫2 h封閉。加 I 抗GATA3、T-bet(1∶500稀釋)4℃孵育過夜。加 II 抗IgG(1∶5 000稀釋)室溫孵育2 h。應(yīng)用ECL發(fā)光液，曝光成像。圖像經(jīng)Quantity One分析軟件分析各條帶的光密度值，以GAPDH作為內(nèi)參照，比較各組T-bet、GATA3分別與GAPDH的灰度比值。

4統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，進行方差齊性檢驗后根據(jù)樣本的性質(zhì)采用兩樣本t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1RT-qPCR法分析各組T-bet、GATA3、IFN-γ及IL-4的mRNA表達

與C57BL/6J小鼠NS組相比，MRL/lpr狼瘡鼠NS組T-bet和IFN-γ的mRNA表達升高，而GATA3和IL-4的mRNA表達下降。ATO能下調(diào)MRL/lpr狼瘡鼠T-bet和IFN-γ的mRNA表達，而ATO對MRL/lpr狼瘡鼠GATA3和IL-4的mRNA表達無明顯影響。ATO對C57BL/6J小鼠的T-bet、GATA3、IFN-γ和IL-4 mRNA 的表達無明顯影響，見圖1。

Figure 1. Samples were analyzed by RT-qPCR to measure the mRNA levels of T-bet, GATA3, IFN-γ and IL-4. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsC57BL/6J NS group;#P<0.05vsMRL/lpr NS group.

圖1實時熒光定量PCR分析各組T-bet、GATA3、IFN-γ及IL-4的mRNA表達

2分析各組T-bet/GATA3mRNA比值的變化

與C57BL/6J小鼠NS組相比，MRL/lpr狼瘡鼠NS組T-bet/GATA3 mRNA比值升高，ATO能下調(diào)MRL/lpr狼瘡鼠T-bet/GATA3 mRNA比值，見表2。

3Westernblot法分析各組T-bet和GATA3蛋白的表達

與C57BL/6J小鼠NS組相比，MRL/lpr狼瘡鼠NS組中T-bet蛋白表達升高，而GATA3蛋白表達下降。ATO能下調(diào)MRL/lpr狼瘡鼠中T-bet的蛋白表達，而對GATA3的蛋白表達無明顯影響。ATO對C57BL/6J小鼠的T-bet和GATA3蛋白表達無明顯影響，見圖2。

表2 各組T-bet/GATA3 mRNA比值的比較

**P<0.01vsC57BL/6J NS group;#P<0.05vsMRL/lpr NS group.

Figure 2. The protein expression of T-bet and GATA3 in MRL/lpr mice and C57BL/6J mice were determined by Western blot analysis. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsC57BL/6J NS group;#P<0.05vsMRL/lpr NS group.

圖2Westernblot法檢測各組T-bet和GATA3的蛋白表達

4ELISA測定血清中IFN-γ和IL-4濃度的變化

用ELISA法檢測各組外周血IFN-γ和IL-4的濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與C57BL/6J小鼠NS組相比，MRL/lpr狼瘡鼠NS組中血清IFN-γ的分泌升高，IL-4的分泌下降。ATO能減少MRL/lpr狼瘡鼠中IFN-γ的分泌，而對IL-4的分泌無明顯影響。ATO對C57BL/6J小鼠IFN-γ和IL-4的分泌無明顯影響，見圖3。

Figure 3. The serum levels of IFN-γ and IL-4 in the MRL/lpr mice and C57BL/6J mice. Mean±SD.n=10.*P<0.05，**P<0.01vsC57BL/6J NS group;##P<0.01vsMRL/lpr NS group.

圖3ELISA法檢測各組小鼠血清中IFN-γ和IL-4的濃度

討 論

SLE是一種原因不明的累及多系統(tǒng)的自身免疫性疾病[1]，在SLE的治療中糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑仍然是一線治療藥物，這些藥物能延長患者的壽命，但是往往伴隨嚴(yán)重的毒副作用[11]，這為尋找新的治療SLE的高效低毒的藥物提供契機。Bobé等[8]的研究表明砷制劑ATO在SLE的治療中有較好的療效，而我們的前期研究[9-10]也證實ATO能延長狼瘡鼠的壽命，改善狼瘡鼠的病情，并伴有較少的毒副作用，但ATO治療SLE的具體機制尚待進一步的研究。有研究發(fā)現(xiàn)SLE中存在轉(zhuǎn)錄因子T-bet/GATA3信號通路的表達異常[5]，但ATO是否通過T-bet/GATA3信號通路對SLE起到治療作用尚不清楚，因此本研究以MRL/lpr狼瘡鼠為試驗對象，觀察ATO對MRL/lpr狼瘡鼠T-bet/GATA3信號通路的影響。

T淋巴細(xì)胞在SLE的發(fā)病中有著重要的作用，然而初始T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為Th1、Th2的過程中受多種因素影響，其中轉(zhuǎn)錄因子T-bet和GATA3在Th細(xì)胞分化發(fā)育中發(fā)揮重要的作用。T-bet是近年哈佛大學(xué)的Szabo等[12]發(fā)現(xiàn)的重要的Th1轉(zhuǎn)錄因子，它在Th1細(xì)胞的分化及效應(yīng)功能維持中起了關(guān)鍵的作用，研究發(fā)現(xiàn)T-bet正調(diào)控Th1細(xì)胞的發(fā)育，引起Th1型細(xì)胞因子IFN-γ基因的染色質(zhì)重塑，激活I(lǐng)FN-γ基因轉(zhuǎn)錄[12]。而GATA3屬于GATA轉(zhuǎn)錄因子家族，在Th2細(xì)胞分化中發(fā)揮了中心性的作用，GATA3正調(diào)控Th2細(xì)胞的發(fā)育，引起Th2型細(xì)胞因子IL-4基因染色質(zhì)重塑，從而誘導(dǎo)IL-4的產(chǎn)生[13]。近來一些研究表明，通過一些干預(yù)調(diào)節(jié)T-bet、GATA3的活性，可以引起Th1/Th2的變化，從而達到控制疾病的目的[14]。

文獻報道SLE的免疫紊亂趨向于以Th1型為主，表現(xiàn)為以IFN-γ為代表的Th1型細(xì)胞因子顯著升高，從而引發(fā)相關(guān)的組織臟器損傷[15]。在本次實驗中，我們發(fā)現(xiàn)與正常C57BL/6J小鼠相比，MRL/lpr狼瘡鼠中T-bet/GATA3 mRNA比值升高，轉(zhuǎn)錄因子T-bet的mRNA及其蛋白表達升高，而GATA3的mRNA及其蛋白表達下降。同時，我們發(fā)現(xiàn)MRL/lpr狼瘡鼠中Th1型細(xì)胞因子IFN-γ的表達與分泌增加，Th2型細(xì)胞因子IL-4的表達與分泌下降。這一結(jié)果表明SLE是以Th1型細(xì)胞因子水平升高，Th2型細(xì)胞因子水平下降為特點的Th1/Th2偏移性免疫性疾病。本次研究中我們還發(fā)現(xiàn)，MRL/lpr狼瘡鼠經(jīng)ATO干預(yù)后，T-bet/GATA3 mRNA比值下降，轉(zhuǎn)錄因子T-bet的mRNA及其蛋白表達下降，IFN-γ的表達與分泌下降。并且IFN-γ的表達增減與T-bet/GATA3 mRNA比值、轉(zhuǎn)錄因子T-bet的表達增減相一致，故而我們可以估測ATO可能通過調(diào)節(jié)SLE異常的T-bet/GATA3信號通路，下調(diào)T-bet/GATA3 mRNA比值，抑制T-bet的表達，干預(yù)T細(xì)胞分化的上游環(huán)節(jié)，進而抑制Th1型免疫反應(yīng)，而趨向于保護性的Th2型反應(yīng)。而Bobé 等[8]研究證實ATO能減少IL-18、IFN-γ的分泌，減輕組織損傷，這也從另一側(cè)面反映了ATO可以阻斷Th1型免疫反應(yīng)，從而達到治療SLE的目的。

綜上所述，我們可以推測ATO可能通過影響T-bet/GATA3信號通路，下調(diào)T-bet的表達，抑制Th1型免疫反應(yīng)，減少Th1型細(xì)胞因子IFN-γ的表達和分泌，從而使狼瘡鼠失衡的Th1/Th2反應(yīng)相對地向Th2型免疫反應(yīng)方向漂移。但ATO又是通過什么途徑或什么機制使T-bet轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生變化，還待進一步研究。

[1] Kuper BC, Failla S. Systemic lupus erythematosus: a multisystem autoimmune disorder[J]. Nurs Clin North Am, 2000, 35(1):253-265.

[2] Nakashima H, Akahoshi M, Masutani K. Th1/Th2 balance of SLE patients with lupus nephritis[J]. Rinsho Byori, 2006, 54(7):706-713.

[3] Choi EW, Lee M, Song JW, et al. Mesenchymal stem cell transplantation can restore lupus disease-associated miRNA expression and Th1/Th2 ratios in a murine model of SLE[J]. Sci Rep, 2016, 6: 38237.

[4] Kanhere A, Hertweck A, Bhatia U, et al.T-bet and GATA3 orchestrate Th1 and Th2 differentiation through lineage-specific targeting of distal regulatory elements[J]. Nat Commun, 2012, 3:1268.

[5] Yu B, Shao Y, Yue X, et al. Copy number variations of Interleukin-12B and T-bet are associated with systemic lupus erythematosus[J]. Rheumatology (Oxford), 2011, 50(7):1201-1205.

[6] Yang H, Lin S, Cui J. Identifying arsenic trioxide (ATO) functions in leukemia cells by using time series gene expression profiles[J]. Gene, 2014, 535(2):312-317.

[7] 任瑋瑋， 李 弘， 張 洹. 三氧化二砷對肝癌細(xì)胞生長抑制作用差異性探討[J]. 中國病理生理雜志, 2004, 20(7):1179-1182.

[8] Bobé P, Bonardelle D, Benihoud K, et al. Arsenic trioxide: A promising novel therapeutic agent for lymphoproliferative and autoimmune syndromes in MRL/lpr mice[J]. Blood, 2006, 108(13):3967-3975.

[9] 王曉冰， 陳培榮， 張 挺， 等. 三氧化二砷對MRL/lpr狼瘡鼠IFN-γ、IL-4表達和Th1-Th2平衡的影響[J]. 細(xì)胞生物學(xué)雜志, 2008, 30(4):509-514.

[10] Xia XR， Hong XU, Zhu XC. Effects of arsenic trioxide on survival rate and autoimmune responses of lupus mice[J]. Chin J Pharm Toxicol, 2007, 21(6):482-486.

[11] Cunnane G, Lane NE. Steroid-induced osteoporosis in systemic lupus erythematosus[J]. Rheum Dis Clin North Am, 2000, 26(2) :311-329.

[12] Szabo SJ, Sullivan BM, Stemmann C, et al. Distinct effects of T-bet in TH1 lineage commitment and IFN-gamma production in CD4 and CD8 T cells[J]. Science, 2002, 295(5553): 338-342.

[13] Tindemans I, Serafini N, Di Santo JP, et al. GATA-3 function in innate and adaptive immunity[J]. Immunity, 2014, 41(2):191-206.

[14] Lin Y, Zhou X, Guo W, et al. RhIL-11 treatment normalized Th1/Th2 and T-bet/GATA-3 imbalance in human immune thrombocytopenic purpura (ITP)[J]. Int Immunopharmacol, 2016, 38:40-44.

[15] Hasegawa K, Hayashi T， Maeda K. Promotion of lupus in NZBx NZWF1 mice by plasmids encoding interferon (IFN)-gamma but not by those encoding interleukin (IL)-4[J]. J Comp Pathol, 2002, 127(1):1-6.

Effects of arsenic trioxide on T-bet/GATA3 signal pathway in MRL/lpr mice

ZHU Xiao-fang1, HU Hong-ye2, LI Yong-ji1, ZHU Xiao-chun1, ZHANG Zhang1, CHEN Dan1

(1Department of Rheumatology，2Department of Surgical Oncology, The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou 325000, China. E-mail: june8587@outlook.com)

AIM: To investigate the effect of arsenic trioxide (ATO) on T-bet/GATA3 signal pathway in MRL/lpr mice.METHODS: MRL/lpr mice and C57BL/6J mice at the age of 20 weeks were chosen and then divided in 2 different sub-groups， respectively. The mice in 2 sub-groups

ATO (0.4 mg·kg-1·d-1) and sodium chloride (NS, volume weight-determined) by intraperitoneal injection respectively for 2 months. Afterward, the spleens were isolated from the MRL/lpr and C57BL/6J mice under pathogen-free condition and the suspensions were prepared. The mRNA level of T-bet, GATA3, IFN-γ,IL-4 and the mRNA ratio of T-bet/GATA3 were detected by RT-qPCR. The protein expression of T-bet and GATA3 was determined by Western blot. The serum levels of IFN-γ and IL-4 were measured by ELISA.RESULTS: The mRNA and protein levels of T-bet， IFN-γ and the mRNA ratio of T-bet/GATA3 in NS group of MRL/lpr mice were higher than those in NS group of C57BL/6J mice (P<0.05). However, the GATA3 and IL-4 were lower in NS group of MRL/lpr mice in both mRNA and protein level (P<0.05 ). In MRL/lpr mice, the mRNA and protein levels of T-bet, IFN-γ and the mRNA ratio of T-bet/GATA3 were lower in ATO group compared with NS group (P<0.05), no difference was found in GATA3 and IL-4. No difference of the indexes mentioned above between ATO group and NS group in C57BL/6J mice was observed.CONCLUSION: ATO may affect the signaling pathway of T-bet/GATA3 to down-regulate the mRNA expression and the protein secretion of IFN-γ by decreasing the expression of T-bet in MRL/lpr mice.

Arsenic trioxide; MRL/lpr mice; T-bet/GATA3 signal pathway; IFN-γ; IL-4

1000- 4718(2017)09- 1708- 05

2017- 03- 03 [

] 2017- 07- 18

溫州科技局重大項目(No. Y20090240)

R593.2； R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.09.028

△通訊作者 Tel： 0577-55579268； E-mail： june8587@outlook.com