人結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移瘤中CD11b+髓系細(xì)胞分選方法的建立與鑒定*

王東旭， 霍婷婷， 田耀文， 趙 磊1, △

(1濟(jì)南大學(xué)，山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院， 山東 濟(jì)南 250200； 2鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450001； 3山東大學(xué)附屬山東省腫瘤醫(yī)院肝膽外科， 山東 濟(jì)南 250117)

·實(shí)驗(yàn)技術(shù)·

人結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移瘤中CD11b+髓系細(xì)胞分選方法的建立與鑒定*

王東旭1, 3， 霍婷婷2, 3， 田耀文1, 3， 趙 磊1, 2, 3△

(1濟(jì)南大學(xué)，山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院， 山東 濟(jì)南 250200；2鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450001；3山東大學(xué)附屬山東省腫瘤醫(yī)院肝膽外科， 山東 濟(jì)南 250117)

目的： 從結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移瘤組織中分選出高純度的CD11b+髓系細(xì)胞，從而建立從一種組織中獲得特異單細(xì)胞的方法。方法: 采用機(jī)械聯(lián)合酶消化法將實(shí)體瘤組織制備成單細(xì)胞懸液；利用流式細(xì)胞術(shù)分選出CD11b+髓系細(xì)胞，并回測細(xì)胞純度；采用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)對分選出細(xì)胞的特異性進(jìn)行鑒定；采用吉姆薩和臺盼藍(lán)染色對獲得細(xì)胞進(jìn)行評價。結(jié)果: 流式細(xì)胞術(shù)能從機(jī)械聯(lián)合酶消化法制備的單細(xì)胞懸液中分選出高純度、足夠數(shù)量的CD11b+細(xì)胞；分選前細(xì)胞陽性率與分選后純度的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，分選后純度達(dá)到實(shí)驗(yàn)研究的要求(P<0.05)；免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)驗(yàn)證了分選細(xì)胞的特異性；分選后的細(xì)胞形態(tài)完整，活性良好。結(jié)論: 機(jī)械聯(lián)合酶消化法制備的單細(xì)胞懸液，經(jīng)過流式細(xì)胞術(shù)分選，能夠分選出高純度、活性良好且形態(tài)完整的特異性細(xì)胞，操作方法穩(wěn)定可重復(fù)，滿足進(jìn)一步研究的要求。

結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移瘤； 流式細(xì)胞術(shù)； 細(xì)胞分選； CD11b+髓系細(xì)胞； 免疫細(xì)胞化學(xué)

結(jié)直腸癌是世界范圍內(nèi)最常見的腫瘤類型之一，肝轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌患者的主要致死因素[1-2]。目前而言結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者的五年生存期并沒有多大改觀，有效治療率依舊保持在低水平[3]。腫瘤的轉(zhuǎn)移是一個多步驟的復(fù)雜過程，對肝轉(zhuǎn)移的抑制是治療結(jié)直腸癌有效的手段[4]。大量研究表明髓系細(xì)胞廣泛參與了腫瘤轉(zhuǎn)移灶的形成與進(jìn)展[5-6]，而在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移中，不同亞群的髓系細(xì)胞發(fā)揮著不同的作用。分泌腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)與誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)的樹突狀細(xì)胞(TNF-α/iNOS producing dendritic cells，Tip-DCs)是一群表面分子表型為CD11b的特殊類型髓系細(xì)胞[7]。前期研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌肝臟轉(zhuǎn)移灶中，機(jī)體通過趨化因子CCL2結(jié)合其受體CCR2，募集大量的CD11b+髓系細(xì)胞浸潤。而在動物實(shí)驗(yàn)中，選擇性地去除該群CD11b+髓系細(xì)胞后肝轉(zhuǎn)移灶的生長明顯受到抑制，一些已形成的轉(zhuǎn)移灶縮小甚至消失[8-9]。

因此，對該群髓系細(xì)胞參與結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的研究有利于更好地了解肝轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，為臨床工作提供新的方向。我們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移灶中CD11b+髓系細(xì)胞則較多存在于腫瘤浸潤組織的邊緣以及瘤組織的基質(zhì)中[9]。因此我們探尋從手術(shù)取下的肝轉(zhuǎn)移瘤組織中，對該髓系細(xì)胞進(jìn)行特異分離與提取。本實(shí)驗(yàn)聯(lián)合機(jī)械-酶消化法與流式細(xì)胞術(shù)分選出目標(biāo)細(xì)胞，并對獲取的細(xì)胞進(jìn)行鑒定和評價，從而建立了一種從結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移瘤組織中獲取特異性細(xì)胞的分選方法。

材料和方法

1標(biāo)本來源

收集2016.02～2016.11期間山東省腫瘤醫(yī)院外科七病區(qū)肝膽外科中10例結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移瘤患者的手術(shù)切除組織標(biāo)本(年齡35～78歲，平均62.8歲)，所有患者病理結(jié)果確診為結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移。取離體30 min內(nèi)腫瘤邊緣組織1 cm×1 cm×1 cm，立即放入備好的裝有冰冷PBS的保存管內(nèi)。

2試劑、材料與主要儀器

RPMI-1640培養(yǎng)基、紅細(xì)胞裂解液和胎牛血清(Gibco)；膠原酶(Roche)；胰酶抑制劑(Invitrogen)；70 μm細(xì)胞篩網(wǎng)(北京優(yōu)尼康生物科技有限公司)；臺盼藍(lán)染液(Sigma)；吉姆薩工作液(北京索萊寶科技有限公司)；細(xì)胞計數(shù)板、載玻片與蓋玻片(ThermoFisher)；抗體CD11b-FITC(11-0113)、抗體IgG1-K-FITC(11-4714)和抗體CD11b-PE(11-0128)均購自eBioscience；即用型DAPI溶液和抗熒光衰減封片劑(北京索萊寶科技有限公司)；流式細(xì)胞檢測儀(BD，F(xiàn)ACSCalibur)；流式細(xì)胞分選儀(BD，F(xiàn)ACSAria Ⅱ)；恒溫水浴箱(常州精達(dá)儀器)；造冰機(jī)(上海知信實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司)；離心機(jī)(Kendro)；熒光顯微鏡(Olympus)。

3方法

3.1瘤組織分離成單細(xì)胞懸液 將轉(zhuǎn)移瘤組織放入小培養(yǎng)皿中(保持操作在冰上進(jìn)行)，剪成小塊，越小越好；將剪碎的轉(zhuǎn)移瘤組織轉(zhuǎn)移至裝有10 mL RPMI-1640培養(yǎng)基(內(nèi)含有0.05%的膠原酶100 μL，0.01%的胰酶抑制劑200 μL)的50 mL離心管內(nèi)；置于37 ℃恒溫水浴箱中保持30 min，每5 min搖晃1次；置于冰上冷卻，后用70 μm的細(xì)胞篩網(wǎng)過濾到另一個50 mL試管，用10～20 mL的冰冷PBS沖洗，確保過濾完全； 4 ℃下1 400 r/min離心5 min，去上清，可觀察到一些黏液狀黃色的絮狀物在試管底，用30 mL的冰冷PBS重懸；4 ℃下1 400 r/min離心5 min，去上清，用預(yù)熱的紅細(xì)胞裂解液(3～5)mL重懸裂解沉淀，室溫下裂解液中保持3 min以裂解紅細(xì)胞；用20 mL冰冷FACS緩沖液(PBS、2% FCS和0.09% NaN3)稀釋；再次用70 μm細(xì)胞篩網(wǎng)過濾到另一離心管中，去除脂質(zhì)碎片；4 ℃下1 400 r/min離心5 min，去上清，用20 mL冰冷FACS緩沖液重懸； 4 ℃下1 400 r/min離心5 min，去上清；加入1 mL的FACS染色緩沖液，調(diào)整細(xì)胞密度到(1～2)×1010/L，取100 μL于顯微鏡下細(xì)胞計數(shù)；各取100 μL單細(xì)胞懸液到2個流式試管(細(xì)胞數(shù)目1×106左右)，分對照(control)組和實(shí)驗(yàn)(experimental)組，6 h內(nèi)上機(jī)檢測。

3.2流式細(xì)胞術(shù)檢測與分選 實(shí)驗(yàn)組試管加入CD11b-FITC抗體5 μL，對照組試管加入IgG1-K-FITC抗體5 μL，避光，4 ℃孵育(30～40) min；加3 mL FACS緩沖液到每個FACS試管，4 ℃下1 200 r/min離心3 min，去上清；再次加入3 mL FACS緩沖液，4 ℃下1 200 r/min離心3 min，去上清；(200～500) μL冰浴FACS緩沖液重懸細(xì)胞；調(diào)整流式細(xì)胞分選儀到最佳狀態(tài)，以CD11b+細(xì)胞設(shè)門，先檢測樣品中1萬個細(xì)胞中免疫表型為CD11b的髓系細(xì)胞的百分比，即分選前陽性率，然后對樣品進(jìn)行分選，收集盡可能多的細(xì)胞。

3.3流式細(xì)胞術(shù)檢測分選后的細(xì)胞純度 取分選后的細(xì)胞懸液100 μL，加入100 μL冰PBS，以原對照管為基礎(chǔ)熒光，檢測分選得到的細(xì)胞懸液中CD11b+細(xì)胞的比例，即分選后的純度。

3.4鑒定分選后細(xì)胞的特異性 取分選得到的細(xì)胞懸液100 μL，加入CD11b-PE(與分選所用的CD11b-FITC克隆號以及結(jié)合表位均不同)抗體5 μL， 4 ℃避光孵育30 min；加入FACS緩沖液3 mL，4 ℃下1 200 r/min離心3 min，去上清； 加入適量FACS緩沖液，取細(xì)胞懸液滴于載玻片上，保持避光；待玻片上細(xì)胞涂層均勻后，滴加100 μL DAPI溶液，保持避光；滴加1滴抗熒光衰減封片劑，避免氣泡生成，加蓋蓋玻片；靜置1 min，立即置于熒光顯微鏡下觀察。

3.5分選后細(xì)胞的存活率 將0.4%的臺盼藍(lán)染液與分選出的細(xì)胞按1∶9混勻，滴入改良牛鮑計數(shù)板，3 min內(nèi)顯微鏡下觀察細(xì)胞存活率。計算公式如下：細(xì)胞存活率(%)=染色陰性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

3.6對比觀察細(xì)胞形態(tài) 取吉姆薩濃縮液0.1 mL和吉姆薩稀釋液0.9 mL充分混勻成1 mL染色液；細(xì)胞懸液滴于載玻片上，推片成膜，自然干燥，水平放置；用甲醇固定2～3 min；將細(xì)胞涂片放置于染色架上，滴加稀釋好的染色液，使其覆蓋全部細(xì)胞，室溫下靜置15～30 min；用PBS緩慢從玻片的一端沖洗(不要先倒去染液或直接對細(xì)胞沖洗)；趁濕加蓋玻片或待干燥后鏡檢；用分選前后的細(xì)胞懸液分別進(jìn)行染色，對比觀察。

4統(tǒng)計學(xué)處理

用軟件SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。肝瘤組織中CD11b+髓系細(xì)胞的數(shù)量不一，因此分選前檢測單細(xì)胞懸液的陽性細(xì)胞的比例各不相同。采用配對樣本t檢驗(yàn)對10例樣本的分選前陽性率以及分選后純度進(jìn)行比較，以P<0.01為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。同時根據(jù)以往研究[10-11]，流式分選可以達(dá)到95%～100%的純度，采用單樣本均數(shù)t檢驗(yàn)，判斷本研究的10例樣本分選純度是否不低于一般流式分選純度，以標(biāo)準(zhǔn)95%為已知總體的分選純度，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1流式細(xì)胞術(shù)檢測CD11b陽性細(xì)胞并分選

原始數(shù)據(jù)通過流式分析軟件FlowJo 7.6.1 分析。除去微小細(xì)胞碎片，選取對照組80%左右的樣品設(shè)門；以對照組的樣品區(qū)域劃分界線，非特異表達(dá)的陽性率控制在2%左右；將操作應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)組樣品數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示能夠?qū)㈥栃约?xì)胞與陰性細(xì)胞分為2個細(xì)胞群，實(shí)驗(yàn)組的陽性細(xì)胞比率為20%，即為分選前陽性率。表明從瘤組織中能夠分離出陽性細(xì)胞，而且分群明顯，進(jìn)而將圖1C中Q2區(qū)域進(jìn)行分選，見圖1。

Figure 1. The single cell suspension in control group and experimental group was sorted by flow cytometry. A: selecting the 80.4% sample data in control group; B: defining the boundary according to the data of control group; C: in the experimental group, the negative and positive cells were clearly divided, and the positive rate was 20%.

圖1流式細(xì)胞術(shù)分選單細(xì)胞懸液

2流式細(xì)胞術(shù)分選后CD11b+細(xì)胞純度的測定

流式細(xì)胞術(shù)分選后得到的單細(xì)胞懸液中，檢測陽性細(xì)胞的比例，即為分選后純度。圖2A、B為對照組的基礎(chǔ)熒光結(jié)果；圖2C為分選后細(xì)胞的檢測結(jié)果，顯示陽性細(xì)胞率達(dá)到98%左右。結(jié)果表明分選后細(xì)胞具有較高純度，可以進(jìn)行后續(xù)的細(xì)胞生物學(xué)和免疫學(xué)研究。

Figure 2. The sorted cells were tested, based on the original control group. A: selecting the 80.1% sample data in control group; B: defining the boundary, nonspecific expression 4.06%; C: the percentage of positive cells was 98.7%.

圖2分選所得單細(xì)胞懸液的陽性細(xì)胞純度的測定

3分選后細(xì)胞的特異性鑒定

采用直接免疫熒光技術(shù)對分選出細(xì)胞的特異性進(jìn)行鑒定。熒光顯微鏡3個通道下觀察，1號通道下DAPI染色細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色熒光(圖3A)，2號通道下細(xì)胞表面黃綠色熒光為流式分選時標(biāo)記的CD11b-FITC抗體(圖3B)，3號通道下細(xì)胞表面呈現(xiàn)均勻的CD11b-PE紅色熒光(圖3C)，圖3D為細(xì)胞DAPI染色和PE染色的圖片融合，顯示細(xì)胞膜呈現(xiàn)紅色熒光，核顯示藍(lán)色熒光。結(jié)果表明CD11b-PE抗體可以特異性地結(jié)合在分選后的細(xì)胞表面，證明分選后的細(xì)胞為一致的CD11b陽性細(xì)胞。

Figure 3. Direct immunofluorescence was observed (×40). A: under channel 1, DAPI staining showed that the nuclei were stained blue; B: under channel 2, the cell membrane showed yellow fluorescence; C: under channel 3, CD11b-PE staining showed that the cell membrane was stained with red; D: the fusion photograph of channel 1 and 3 showed that the cell membrane was red and nuclear was blue.

圖3直接免疫熒光觀察

4分選前后細(xì)胞的形態(tài)對比

采用吉姆薩染色法對分選前后的細(xì)胞形態(tài)對比觀察(圖片經(jīng)過處理)。分選前的細(xì)胞成團(tuán)成塊，形態(tài)各不相同，為各種細(xì)胞混合；分選后的細(xì)胞，不再成團(tuán)塊，形態(tài)類型相似。證明分選后的細(xì)胞類型單一，且形態(tài)完整，見圖4。

5分選后細(xì)胞成活率的計算和分選差異的統(tǒng)計學(xué)分析

對10例分選后的細(xì)胞樣品進(jìn)行臺盼藍(lán)染色后，根據(jù)染色結(jié)果計算平均存活率約為(90.2±1.2)%。

統(tǒng)計分析10例樣本分選前細(xì)胞陽性率與分選后細(xì)胞純度。分選前的陽性細(xì)胞率為(18.87±3.14)%，分選后細(xì)胞的純度為(96.97±0.66)%(P<0.01)，分選效果明顯；分選后細(xì)胞純度與一般流式分選純度的差異比較有統(tǒng)計學(xué)意義，可以認(rèn)為該10例樣本平均分選純度高于95%，同時表明所建立的方法具有良好的可重復(fù)性，見圖5。

Figure 4. The morphological changes of the cells before and after sorting were observed with Giemsa staining. A: the Giemsa staining showed that the cells were agglomerate before sorting; B: the cells were dissociative after sorting.

圖4吉姆薩染色下細(xì)胞分選前后的形態(tài)觀察

Figure 5. The statistical distribution of the positive rate before sorting and the purity after sorting. Thettest of paired samples proved that the difference was obvious between the positive rate [(18.87±3.14)%] and purity [(96.97±0.66)%] (P<0.01). The single-samplettest showed that the purity of the sorting was higher than that of the general flow sorting, and the difference was significant (single tail，P<0.05/2).n=10.

圖5分選前細(xì)胞陽性率以及分選后陽性細(xì)胞純度的統(tǒng)計分布

討 論

目前，從實(shí)體組織中分離出單細(xì)胞的方法分為機(jī)械法和化學(xué)法兩大類，機(jī)械法包括研磨法、網(wǎng)搓法等，化學(xué)法有酶消化法、化學(xué)試劑分解法等[12]。各類方法的原理各不相同，效果也參差不齊。由于腫瘤組織病理類型的不同，適用的分離方法也不相同[13-15]。結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移瘤中，單純的利用機(jī)械法處理組織制成單細(xì)胞懸液，經(jīng)過流式檢測，發(fā)現(xiàn)分離的細(xì)胞數(shù)量很有限，同時單細(xì)胞懸液中的陽性細(xì)胞比例很少，達(dá)不到流式分選的上樣條件；而單純利用化學(xué)消化法，我們發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移瘤的結(jié)締組織較多導(dǎo)致并不能充分消化組織塊，難以制成有效的單細(xì)胞懸液。因此，我們首先采用機(jī)械法將瘤組織剪成勻漿狀態(tài)，增大酶消化的接觸面積，然后采用膠原酶消化間質(zhì)組織進(jìn)而使充盈其中的髓系細(xì)胞游離出來，二者相互配合，不可或缺。同時，在37 ℃水浴消化時加入的胰酶抑制劑可以盡可能地避免細(xì)胞死亡破碎時釋放的胰酶對髓系細(xì)胞的破壞。

單細(xì)胞懸液的細(xì)胞純化方法主要有密度梯度離心法、磁珠分選和流式細(xì)胞術(shù)分選[16]。密度梯度離心法依靠細(xì)胞沉降系數(shù)，所得到的細(xì)胞純度低，并且細(xì)胞的表面標(biāo)記不明確，現(xiàn)已很少使用。對于我們的研究來說，轉(zhuǎn)移瘤組織的取材部位不同、實(shí)驗(yàn)操作時間的長短都會導(dǎo)致制備的單細(xì)胞懸液中CD11b陽性髓系細(xì)胞并不多，有時會低于10%。同時盡可能高的細(xì)胞純度和數(shù)量對于我們來說也是十分必要的，因此盡管磁珠分選能夠使細(xì)胞純度達(dá)到90%以上，但仍然達(dá)不到我們要求的95%以及更高，同時對于表達(dá)較低(10%以下)的細(xì)胞來說并不適合，而且容易污染[17-18]。流式細(xì)胞術(shù)具有高的精準(zhǔn)度，操作過程封閉，能夠避免污染，分選純度以及回收率均高于磁珠分選，是目前公認(rèn)的細(xì)胞純化的金指標(biāo)。流式細(xì)胞術(shù)操作復(fù)雜、耗時長、費(fèi)用昂貴，但是很好地滿足了我們的研究要求[19]。在分選出陽性細(xì)胞后，我們依然需要對所獲細(xì)胞進(jìn)行鑒定以及評價。細(xì)胞免疫熒光技術(shù)鑒定了細(xì)胞的特異性，證明所分選的確實(shí)是CD11b陽性細(xì)胞，而吉姆薩染色表明分選后細(xì)胞的形態(tài)穩(wěn)定。結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移瘤中的CD11b+髓系細(xì)胞的數(shù)量受個體差異的影響，實(shí)驗(yàn)分選樣品的陽性率也因此有所不同，因而最后我們通過統(tǒng)計分析證明所建立的方法操作穩(wěn)定，分選效果顯著。同時10例分選后細(xì)胞純度達(dá)到了一般流式分選的純度，滿足后續(xù)的分子生化以及免疫學(xué)研究的要求。通常，在國內(nèi)外研究中采用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，特異地誘導(dǎo)培養(yǎng)出待研究觀察的細(xì)胞，并進(jìn)行各種細(xì)胞生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)研究，在某些情況下特異性細(xì)胞株難以培養(yǎng)或是各種原因難以獲得；而利用手術(shù)標(biāo)本中直接獲得特異性細(xì)胞，同樣可以滿足對細(xì)胞進(jìn)行生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)的要求[20]。因此，這對于相類似的腸道肝轉(zhuǎn)移瘤組織獲取單細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究來說，該實(shí)驗(yàn)提供了一種可以參考的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。

總而言之，CD11b+髓系細(xì)胞參與了肝轉(zhuǎn)移瘤的進(jìn)展過程，我們對該細(xì)胞的分選直接為后續(xù)進(jìn)行的深入研究提供了條件，同時確立了一套結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移瘤獲取特異細(xì)胞的操作方法。但是受限于離體組織的活性較差且實(shí)驗(yàn)中復(fù)雜的操作過程，獲取的細(xì)胞在活力與細(xì)胞狀態(tài)上與體外培養(yǎng)的細(xì)胞仍然有較大差距，這也是我們今后不斷改進(jìn)研究的方向。

[1] Siegel R, Naishadham D, Jemal A. Cancer statistics, 2012[J]. CA Cancer J Clin, 2012, 62(1):10-29.

[2] Weiss L, Grundmann E, Torhorst J, et al. Haematogenous metastatic patterns in colonic carcinoma: an analysis of 1541 necropsies[J]. J Pathol, 1986, 150(3):195-203.

[3] Cidón EU. The challenge of metastatic colorectal cancer[J]. Clin Med Insights Oncol, 2010, 4:55-60.

[4] Arru M, Aldrighetti L, Castoldi R, et al. Analysis of prognostic factors influencing long-term survival after hepatic resection for metastatic colorectal cancer[J]. World J Surg, 2008, 32(1):93-103.

[5] Medina-Echeverz J, Eggert T, Han M, et al. Hepatic myeloid-derived suppressor cells in cancer[J]. Cancer Immunol Immunother, 2015, 64(8):931-940.

[6] Sevko A， Umansky V. Myeloid-derived suppressor cells interact with tumors in terms of myelopoiesis, tumorigenesis and immunosuppression: thick as thieves[J]. J Cancer, 2013, 4(1):3-11.

[7] Wilsmann-Theis D, Koch S, Mindnich C, et al. Generation and functional analysis of human TNF-α/iNOS-producing dendritic cells (Tip-DC)[J]. Allergy, 2013, 68(7):890-898.

[8] Yang L, DeBusk LM, Fukuda K, et al. Expansion of myeloid immune suppressor Gr+CD11b+cells in tumor-bearing host directly promotes tumor angiogenesis[J]. Cancer Cell, 2004, 6(4):409-421.

[9] Zhao L, Lim SY, Gordon-Weeks AN, et al. Recruitment of a myeloid cell subset (CD11b/Gr1mid) via CCL2/CCR2 promotes the development of colorectal cancer liver metastasis [J]. Hepatology, 2013, 57(2):829-839.

[10] 陳朱波， 曹雪濤. 流式細(xì)胞術(shù)： 原理、操作及應(yīng)用[M]. 第2版. 北京： 科學(xué)出版社, 2014： 14-32.

[11] Rieseberg M, Kasper C, Reardon KF, et al. Flow cytometry in biotechnology[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2001, 56(3-4):350-360.

[12] 任興昌, 方 黎, 陳洪勛. 實(shí)體組織單細(xì)胞懸液制備方法[J]. 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志, 2007, 23(4):490-491.

[13] 顏 政， 方馳華．人肝細(xì)胞癌細(xì)胞亞群的克隆分離及異質(zhì)性機(jī)制的初步研究[J]. 世界華人消化雜志, 2006, 14(5):481-485.

[14] Yovchev MI， Dabeva MD， Oertel M. Isolation， characterization， and transplantation of adult liver progenitor cells[J]. Methods Mol Biol， 2013,976:37-51.

[15] 劉勝軍， 方馳華. 流式細(xì)胞儀、免疫磁珠及親和板結(jié)合分離法分選c-kit+肝癌細(xì)胞的比較[J]. 中華消化外科雜志, 2007, 6(3):206-208.

[16] Fulwyler MJ. Flow cytometry and cell sorting[J]. Blood Cells， 1980， 6(2)：173-184.

[17] 黃瑩瑩， 尹盛夏， 曹文強(qiáng)， 等. 高端流式分選與免疫磁珠法純化T細(xì)胞的比較[J]. 國際醫(yī)藥衛(wèi)生導(dǎo)報, 2016, 22(22):3377-3383.

[18] 徐 勇， 霍 梅. 免疫磁珠分離及流式細(xì)胞儀分選純化外周血CD34+/CD90+干細(xì)胞[J]. 臨床檢驗(yàn)雜志, 2004, 22(4):246-248.

[19] 胡 凡. 流式細(xì)胞分選術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用[J]. 藥物與人, 2014， 27(11):53-54.

[20] Xue K, Xia W, Zhang X, et al. Isolation and identification of stem cells in different subtype of cartilage tissue[J]. Expert Opin Biol Ther, 2015, 15(5):623-632.

(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 宋延君)

Identification and establishment of sorting method for isolating CD11b+myeloid cells in human hepatic metastases from colorectal cancer

WANG Dong-xu1, 3, HUO Ting-ting2, 3, TIAN Yao-wen1, 3, ZHAO Lei1, 2, 3

(1School of Medicine and Life Sciences, University of Jinan-Shandong Academy of Medical Sciences, Jinan University, Jinan 250200, China;2The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, China;3Department of Hepatobiliary Surgery， Shandong Cancer Hospital Affiliated to Shandong University, Jinan 250117, China. E-mail: drzhaolei@hotmail.com)

AIM: To establish a method for obtaining specific cells in solid tumor tissue by sorting of CD11b+myeloid cells in hepatic metastases from colorectal cancer.METHODS: Tumor tissues were prepared into single cell suspension by mechanical method combined with enzyme digestion, and then the CD11b+myeloid cells were isolated by flow cytometry. The sorted cells were identified by immunocytochemistry. The viability and morphologiy of the sorted cells were evaluated by Giemsa and Typan blue staining. The cell purity was evaluated by flow cytometry.RESULTS: Sufficient numbers of CD11b+cells with high purity were isolated by sorting with flow cytometry from the single cell suspension prepared by mechanical and enzyme digestion. The purity of the cells was confirmed by statistical analysis (P<0.05). The positive rates of the cells before and after sorting were significantly different (P<0.01). The positive cells were verified by immunocytochemical method. Meanwhile, the sorted cells had complete morphology and good activity.CONCLUSION: The CD11b+myeloid cells in solid tumor tissue can be isolated by flow cytometry from the machine-enzyme digestion suspension with high purity, good activity and complete morphology.

Colorectal liver metastases; Flow cytometry； Cell sorting; CD11b+myeloid cells; Immunocytochemistry

1000- 4718(2017)09- 1723- 06

2017- 03- 20 [

] 2017- 06- 13

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81272375； No. 81472713)

R735.3； R392.32

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.09.031

△通訊作者： Tel： 0531-67626242； E-mail： drzhaolei@hotmail.com