MAPK/FOXA2介導(dǎo)香煙煙霧提取物對支氣管上皮細胞分化的影響

杜春玲， 段艷紅， 周 磊， 吳 波

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院呼吸內(nèi)科，上海 201700

·短篇論著·

MAPK/FOXA2介導(dǎo)香煙煙霧提取物對支氣管上皮細胞分化的影響

杜春玲， 段艷紅， 周 磊， 吳 波

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院呼吸內(nèi)科，上海 201700

目的： 探討吸煙對支氣管上皮細胞分化的影響及絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/叉頭框轉(zhuǎn)錄因子 A2(FOXA2)信號通路在此過程中發(fā)揮的作用。方法： 培養(yǎng)BEAS-2B細胞，分為空白對照組、香煙煙霧提取物(CSE)處理組、CSE+ERK抑制劑U0126處理組、CSE+JNK抑制劑SP600125處理組、CSE+p38抑制劑SB203580處理組。ELISA測定各組磷酸化的ERK1/2、JNK、p38蛋白的水平；實時熒光定量PCR檢測FOXA2、E-cadherin、CD44、ZO-1的mRNA水平；用Western印跡檢測FOXA2、E-cadherin、CD44、ZO-1的蛋白水平。結(jié)果： 與空白對照組相比，用CSE的細胞中磷酸化的ERK1/2、JNK、p38蛋白水平明顯升高(P<0.05)，而FOXA2、 E-cadherin、CD44、ZO-1的mRNA及蛋白表達水平均明顯降低(P<0.05)；CSE處理同時采用ERK、JNK或 p38抑制劑處理顯著改善上述基因及蛋白表達的變化(P<0.05)。結(jié)論： 吸煙可影響支氣管上皮細胞分化，而MAPK/FOXA2信號通路在此過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。

絲裂原活化蛋白激酶；叉頭框轉(zhuǎn)錄因子 A2；香煙煙霧提取物；支氣管上皮細胞;分化

香煙煙霧包含多種化學(xué)成分，已被證實為多種肺疾病的重要危險因素，例如肺癌和慢性阻塞性肺疾病(COPD)[1-2]。多項體外和在體實驗[3-4]已表明，香煙煙霧可導(dǎo)致氣道炎癥，引起DNA損傷，但是香煙煙霧導(dǎo)致氣道病變和肺功能持續(xù)惡化的機制非常復(fù)雜，目前尚不明確。

香煙煙霧可通過激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路而導(dǎo)致支氣管上皮細胞異常增生，且MAPK信號通路與吸煙誘導(dǎo)的支氣管上皮細胞鱗狀化生、黏蛋白(MUC)5AC高分泌密切相關(guān)[5-7]。叉頭框轉(zhuǎn)錄因子A2(FOXA2)是氣道上皮細胞分化所必需的因子，與MUC5AC的分泌負相關(guān)，在肺泡上皮細胞發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用，且可參與調(diào)控細胞的增殖與成熟[8-10]。但是，F(xiàn)OXA2是否參與香煙誘導(dǎo)的MAPK活化及上皮細胞分化，目前尚未明確。本研究采用香煙煙霧提取物(CSE)刺激人氣道上皮細胞，體外模擬吸煙活化的人支氣管上皮細胞模型，研究CSE對人支氣管上皮細胞分化的影響，以及MAPK信號通路、FOXA2在這個過程中可能發(fā)揮的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 細 胞 正常人支氣管上皮細胞(BEAS-2B)購自上海博谷生物科技有限公司，在含10%胎牛血清的RMPI 1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.2 試劑和儀器 ELISA試劑盒購于Abcam(ab119674)公司；TRIzol、Bio-Serve定量檢測擴增試劑盒、Bio-Serve反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Invitrogen公司；Western 印跡實驗所用一抗購于Abcam公司，二抗購于碧云天公司；ECL顯影液購于Pierce公司。酶標(biāo)儀購于Thermo公司；實時熒光定量PCR儀購于Olympus公司。

1.3 CSE的制備 參照Ballweg等[11]的方法并改良：4支香煙(上海紅雙喜，焦油含量8 mg/支、煙氣煙堿量0.7 mg/支、煙氣一氧化碳量10 mg/支)燃燒的煙霧在負壓吸引下溶于40 mL無血清培養(yǎng)液中，制成懸液。調(diào)節(jié)懸液pH值為約7.4，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌后作為100%CSE溶液。每次實驗時現(xiàn)制備CSE，稀釋到所需濃度后采用。

1.4 MTT法篩選CSE、MAPK抑制劑的適宜濃度 參照文獻[12]，根據(jù)MTT法測定的細胞生長抑制率，篩選1%的CSE及20 μmol/L的ERK、JNK/p38抑制劑用于后續(xù)實驗。

1.5 細胞分組及干預(yù) 無血清培養(yǎng)BEAS-2B細胞。將生長對數(shù)期的BEAS-2B細胞鋪3個24孔板，每個孔的接種細胞數(shù)為1×105；第2天，細胞融合度約60%，制備CSE，細胞換液后，每孔加入適量的CSE制劑和(或)抑制劑，不加抑制劑的孔加入相同體積的DMSO。按照實驗設(shè)計將細胞分為5組，每板每組4個復(fù)孔：對照組，CSE處理組(CSE組)，CSE+ERK抑制劑組(CSE+U0126組)，CSE+JNK抑制劑組(CSE+SP600125組)，CSE+p38抑制劑組(CSE+ SB203580組)。每2天按原濃度換液1次。處理1周后收集細胞，用于后續(xù)檢測。

1.6 ELISA法測定各組磷酸化的ERK1/2、JNK、p38蛋白水平[1]ELISA試劑盒檢測磷酸化的ERK1/2、JNK、p38蛋白水平，檢測結(jié)果用相對熒光單位(RFU)表示。CSE處理預(yù)定的時間后，取其中1個24孔板，吸出培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗1遍，每孔加入200 μL新稀釋的裂解液，室溫裂解10 min，回收，分裝待檢測磷酸化的ERK1/2、p38、JNK蛋白水平。取檢測微板，每孔分別加入50 μL相應(yīng)的裂解液，繼續(xù)加入50 μL相應(yīng)的抗體溶液，室溫孵育1 h。每孔用200 μL PBS洗液洗板，洗3遍。每孔加入100 μL底物溶液，室溫放置10 min，加入終止液后進行熒光測定。

1.7 實時熒光定量PCR檢測FOXA2、E-cadherin、CD44、ZO-1的mRNA水平 CSE處理預(yù)定的時間后，取其中1個24孔板，PBS洗板后，TRIzol法抽提總RNA。每份RNA樣品取4 μL，采用Bio-Serve反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Cat No. BS-PCR005)反轉(zhuǎn)錄。取等量的標(biāo)準(zhǔn)品和反轉(zhuǎn)錄樣品2 μL，采用Bio-Serve定量檢測擴增試劑盒(Cat No. BS-PCR002)進行定量PCR檢測。在72℃檢測熒光信號。定量PCR擴增FOXA2、E-cadherin、ZO-1及CD44的引物見表1。

表1 FOXA2、E-cadherin、ZO-1及CD44的擴增引物

1.8 Western印跡檢測FOXA2、E-cadherin、CD44、ZO-1的蛋白水平 CSE處理預(yù)定的時間后，取其中1個24孔板，胰酶消化每孔細胞，PBS洗板后加入裂解液，冰上裂解30 min，加入5×上樣緩沖液后，煮沸10 min，離心(12 000×g)并自然冷卻后上樣。配制8%的分離膠及3.9%的濃縮膠，每孔加樣20 μL，先恒壓45 V電泳，待樣品在濃縮膠與分離膠之間跑成一條直線時，換成恒壓70 V，電泳3～5 h。將蛋白電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜(NC膜)上，恒流300 mA，1 h(ZO-1為90 min)。麗春紅S染色顯示轉(zhuǎn)膜成功后行免疫顯色：洗膜液洗滌，用封閉液稀釋一抗，加一抗( ACTIN鼠單抗、E-cadherin鼠單抗、FOXA2兔多抗、CD44兔多抗或ZO-1羊多抗，比例均為1∶1 000)，4℃孵育過夜；洗膜液洗滌，加辣根酶標(biāo)記的二抗(比例均為1∶500)室溫孵育2 h；洗膜液洗滌，最后在暗室中進行ECL(Pierce公司)化學(xué)發(fā)光法顯影。

2 結(jié) 果

2.1 各組磷酸化ERK1/2、JNK、p38蛋白水平的比較 ELISA法檢測結(jié)果顯示，處理48 h后，CSE組細胞中磷酸化ERK1/2、JNK、p38蛋白水平較對照組升高(P<0.05)，提示MAPK信號通路可能是CSE影響支氣管上皮細胞生長的重要機制。ERK抑制劑、JNK抑制劑和p38抑制劑處理細胞后，CSE引起的磷酸化ERK1/2、JNK、p38蛋白水平升高被抑制，證明MAPK通路抑制劑有效地發(fā)揮了抑制作用(圖1)。

2.2 各組FOXA2、 E-cadherin、CD44、ZO-1的mRNA水平比較 與對照組相比，CSE組FOXA2、E-cadherin、CD44、ZO-1的mRNA水平均明顯下降(P<0.05)，而CSE處理同時用ERK、JNK或 p38抑制劑處理則使CSE誘導(dǎo)的上述因子的mRNA水平下降被抑制(P<0.05，圖2)。

圖1 各組細胞中磷酸化ERK1/2、JNK、p38蛋白的表達

圖2 各組細胞中FOXA2、E-cadherin、CD44、ZO-1 mRNA水平

2.3 各組FOXA2、E-cadherin、CD44、ZO-1蛋白水平比較 與對照組相比，CSE組FOXA2、E-cadherin、CD44、ZO-1蛋白水平均明顯下降，而CSE處理同時采用ERK、JNK或p38抑制劑處理則可抑制CSE誘導(dǎo)的上述蛋白水平的下降(P<0.05,圖3)。

圖3 各組細胞中FOXA2、 E-cadherin、CD44、ZO-1蛋白的表達

3 討 論

MAPK是一組絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，ERK、JNK和 p38均為其亞單位，可參與介導(dǎo)細胞的增殖、凋亡、分化以及對炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)等過程。近年來有研究[5-7]發(fā)現(xiàn)，吸煙可通過激活ERK、JNK和 p38誘導(dǎo)支氣管上皮細胞的鱗狀化生和異常增生。這可能是吸煙增加肺癌及COPD發(fā)生風(fēng)險的重要機制[8,13-14]。

FOXA2是氣道上皮細胞分化所必需的成份。有研究[15]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXA2在哮喘等肺病變組織中表達下降；且在小鼠中發(fā)現(xiàn)FOXA2的表達與MUC5AC的分泌呈負相關(guān)，提示FOXA2在支氣管上皮細胞分化中起重要調(diào)節(jié)作用。E-cadherin是一類跨膜黏附受體，廣泛分布于動物及人的各類上皮細胞，在細胞的黏附作用、維持細胞的完整性中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[16]。ZO-1是一類緊密連接蛋白，主要調(diào)節(jié)細胞的緊密連接[17]，同樣在維持上皮細胞極性及屏障功能中發(fā)揮作用。CD44屬于介導(dǎo)細胞與基質(zhì)、細胞與細胞間黏附的黏附因子，是一組分布廣泛、多分子形式的膜整合蛋白[18]。氣道上皮細胞是COPD發(fā)病機制中關(guān)鍵的細胞之一，也是新興的治療靶點之一[18]。作為上皮細胞的標(biāo)志物，E-cadherin、ZO-1及CD44的變化能反映上皮細胞的極性、黏附功能的變化，與氣道上皮細胞的分化狀態(tài)相關(guān)，也是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT) 的重要標(biāo)志。肺癌與COPD具有很多共同特點：吸煙為重要病因，疾病起始于氣道上皮細胞，與氣道炎癥相關(guān)。因此，探究CSE誘導(dǎo)人氣道上皮細胞分化的改變以及MAPK參與的機制可能對進一步闡明COPD、肺癌的發(fā)病機制有重要意義。

本研究采用正常人支氣管上皮細胞體外吸煙模型，探究MAPK信號通路對吸煙誘導(dǎo)的上皮細胞分化的影響，發(fā)現(xiàn)CSE處理后的支氣管上皮細胞中E-cadherin、CD44、ZO-1的mRNA水平及蛋白水平均明顯下降，表明支氣管上皮細胞的分化出現(xiàn)異常，細胞連接、黏附及完整性受到破壞。研究[10]認(rèn)為，F(xiàn)OXA2作為支氣管上皮細胞分化的調(diào)節(jié)因子，也是肺癌抑制基因。本研究中，CSE引起FOXA2下降，說明FOXA2參與了吸煙誘導(dǎo)的支氣管異常分化。但這種分化的改變是否與吸煙導(dǎo)致的肺癌有關(guān)需要進一步研究。本研究發(fā)現(xiàn)，E-cadherin、CD44、ZO-1與FOXA2的表達變化一致，但是否受到FOXA2的調(diào)控還需進一步研究。研究[19]證實，在胰腺導(dǎo)管細胞癌細胞系，F(xiàn)OXA2能激活E-cadherin啟動子，是內(nèi)源性E-cadherin的強活化劑；而FOXA2表達受抑可誘導(dǎo)EMT，同時伴有E-cadherin表達的下降。該研究結(jié)論與本研究相似，且說明E-cadherin的表達可能受到FOXA2的調(diào)控，提示CD44和ZO-1也可能受到FOXA2的調(diào)控。

本研究中，當(dāng)MAPK信號通路受到抑制時，可明顯抑制CSE對支氣管上皮細胞的影響，ERK、JNK、p38受到抑制后，由CSE引起的FOXA2、 E-Cadherin、CD44、ZO-1的表達回升，說明MAPK信號通路參與了支氣管上皮細胞的分化調(diào)節(jié)，與研究[13]結(jié)論相似，提示CSE可能通過MAPK信號通路誘導(dǎo)支氣管上皮細胞的異常分化。而氣道上皮細胞的這種分化改變可能參與COPD、肺癌的發(fā)病。然而，MAPK信號通路如何調(diào)控FOXA2以及E-cadherin、CD44、ZO-1的表達，或FOXA2與E-cadherin、CD44、ZO-1之間是否有級聯(lián)調(diào)控作用仍不明了，尚需進一步研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，吸煙可導(dǎo)致支氣管上皮細胞異常分化，這可能是吸煙增強COPD、肺癌發(fā)生風(fēng)險的原因之一；吸煙對支氣管上皮細胞分化的影響可能通過MAPK/FOXA2信號通路介導(dǎo)，ERK、JNK和p38的抑制劑可明顯抑制細胞的分化。本研究可能為吸煙導(dǎo)致COPD、肺癌的發(fā)生提供了潛在的分子機制，也為COPD、肺癌的治療提供了靶點。

[ 1 ] PAUWELS R A, BUIST A S, CALVERLEY P M, et al. Global strategy for the diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive pulmonary disease. NHLBI/WHO Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease (GOLD) Workshop summary[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2001, 163(5):1256-1276.

[ 2 ] NYUNOYA T, MEBRATU Y, CONTRERAS A, et al. Molecular processes that drive cigarette smoke-induced epithelial cell fate of the lung[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 2014, 50(3):471-482.

[ 3 ] HASWELL L E, HEWITT K, THORNE D, et al. Cigarette smoke total particulate matter increases mucous secreting cell numbers in vitro: a potential model of goblet cell hyperplasia[J]. Toxicol In Vitro,2010, 24(3):981-987.

[ 4 ] PESCH B, KENDZIA B, GUSTAVSSON P, et al. Cigarette smoking and lung cancer--relative risk estimates for the major histological types from a pooled analysis of case-control studies[J]. Int J Cancer, 2011, 131(5):1210-1219.

[ 5 ] ZHONG C Y, ZHOU Y M, DOUGLAS G C, et al. MAPK/AP-1 signal pathway in tobacco smoke-induced cell proliferation and squamous metaplasia in the lungs of rats[J]. Carcinogenesis, 2005, 26(12):2187-2195.

[ 7 ] XIAO J, WANG K, FENG Y L, et al. Role of extracellular signal-regulated kinase 1/2 in cigarette smoke-induced mucus hypersecretion in a rat model[J]. Chin Med J (Engl), 2011, 124(20):3327-3333.

[ 8 ] 江德鵬, VICTOR P KOLOSOV, JULIY M PERELMAN,等. 白細胞介素-13刺激大鼠氣道黏液高分泌的分子機制[J]. 南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2011, 31(1):73-76.

[ 9 ] ZHEN G, PARK S W, NGUYENVU L T, et al. IL-13 and epidermal growth factor receptor have critical but distinct roles in epithelial cell mucin production[J]. Am J Respir Cell Mol Biol,2007, 36(2):244-253.

[10] TANG Y, SHU G, YUAN X, et al. FOXA2 functions as a suppressor of tumor metastasis by inhibition of epithelial-to-mesenchymal transition in human lung cancers[J]. Cell Research, 2011, 21(2):316.-326.

[11] BALLWEG K, MUTZE K, K?NIGSHOFF M, et al. Cigarette smoke extract affects mitochondrial function in alveolar epithelial cells[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2014, 307(11):L895-L907.

[12] 和 平, 趙玉杰, 劉 原,等. 姜黃素抑制香煙煙霧提取物刺激巨噬細胞RAW264.7所致炎癥反應(yīng)[J]. 山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2014, 45(5):343-346.

[13] MOSSMAN B T, LOUNSBURY K M, REDDY S P. Oxidants and signaling by mitogen-activated protein kinases in lung epithelium[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 2006, 34(6):666-669.

[14] SHEN N, GONG T, WANG J D, et al. Cigarette smoke-induced pulmonary inflammatory responses are mediated by EGR-1/GGPPS/MAPK signaling[J]. Am J Pathol, 2011, 178(1):110-118.

[15] WAN H, KAESTNER K H, ANG S L, et al. FOXA2 regulates alveolarization and goblet cell hyperplasia[J]. Development, 2004, 131(4):953-964.

[16] ODA H, TAKEICHI M. Evolution: structural and functional diversity of cadherin at the adherens junction[J]. J Cell Biol, 2011, 193(7):1137-1146.

[17] 翁密霞, 吳翠環(huán), 楊秀萍. E-cadherin、CD44v6和PCNA在非小細胞肺癌組織中的表達及意義[J]. 癌癥, 2008, 27(2):191-195.

[18] NAOR D, WALLACH-DAYAN S B, ZAHALKA M A, et al. Involvement of CD44, a molecule with a thousand faces, in cancer dissemination[J]. Semin Cancer Biol, 2008, 18(4):260-267.

[19] SONG Y, WASHINGTON M K, CRAWFORD H C. Loss of FOXA1/2 is essential for the epithelial-to-mesenchymal transition in pancreatic cancer[J]. Cancer Res,2010, 70(5):2115-2125.

[本文編輯] 姬靜芳

Effect of cigarette smoke extract on differentiation of bronchial epithelial cells mediated by MAPK/FOXA2

DU Chun-ling, DUAN Yan-hong, ZHOU Lei, WU Bo

Department of Respiratory Medicine, Qingpu Branch of Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 201700, China

Objective： To explore the effect of cigarette smoke extract (CSE) on the differentiation of bronchial epithelial cells and the role of mitogen-activated protein kinase (MAPK)/forkhead box A2 (FOXA2) signaling pathways in this process.Methods： BEAS-2B cells were cultivated and treated respectively with cigarette smoke extract (CSE), CSE and ERK inhibitor U0126, CSE and JNK inhibitor SP600125, CSE and p38 inhibitor SB203580. Thus the blank control group and cigarette smoke extract (CSE) treatment group, CSE+ERK inhibitor U0126 treatment group, CSE+JNK inhibitor SP600125 treatment group, and CSE+p38 inhibitor SB203580 treatment group were set. ELISA was developed for detecting the protein levels of phosphorylated ERK1/2, JNK, and p38. The mRNA and protein levels of FOXA2, E-cadherin, CD44 and ZO-1 were measured by real-time fluorescent quantitative PCR and Western blotting, respectively.Results： Compared with the blank control group, the phosphorylated ERK1/2, JNK, and p38 protein levels were significantly increased (P<0.05), and the mRNA and protein expression of FOXA2, E-cadherin, CD44 and ZO-1 were significantly decreased (P<0.05) when cells were treated with CSE. CSE treatment with ERK, JNK or p38 inhibitors significantly improved the expression of the above genes and proteins (P<0.05).Conclusions： Smoking can affect the differentiation of bronchial epithelial cells, and the MAPK/FOXA2 signaling pathway plays an important regulatory role in this process.

mitogen-activated protein kinase; forkhead box A2; cigarette smoke extract; bronchial epithelial cells; differentiation

R 562

A

2016-08-01 [接受日期] 2017-03-28

上海市衛(wèi)生和計劃生育委員會面上項目(20124277).Supported by Program of Shanghai Municipal Commission of Health and Family Planning(20124277).

杜春玲, 博士,主任醫(yī)師.E-mail:duchunling966@163.com

10.12025/j.issn.1008-6358.2017.20160777