EGCG和EGCG-3Me對根管牙本質(zhì)粘接界面穩(wěn)定性的作用

余昊翰，張 凌，李 芳，劉正雅，李銀花，陳吉華

（1.軍事口腔醫(yī)學(xué)國家重點實驗室，口腔疾病國家臨床醫(yī)學(xué)研究中心，陜西省口腔醫(yī)學(xué)重點實驗室，空軍軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院修復(fù)科，陜西 西安 710032；2.國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點實驗室，湖南 長沙 410128）

EGCG和EGCG-3Me對根管牙本質(zhì)粘接界面穩(wěn)定性的作用

余昊翰1，張 凌1，李 芳1，劉正雅1，李銀花2，陳吉華1

（1.軍事口腔醫(yī)學(xué)國家重點實驗室，口腔疾病國家臨床醫(yī)學(xué)研究中心，陜西省口腔醫(yī)學(xué)重點實驗室，空軍軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院修復(fù)科，陜西 西安 710032；2.國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點實驗室，湖南 長沙 410128）

將質(zhì)量濃度為400 μg/mL的EGCG及EGCG-3Me添加到全酸蝕粘接劑Single Bond 2（SB2）中，制備改性粘接劑E-SB2及E3-SB2，SB2為對照組。激光共聚焦顯微鏡和分光光度法檢測改性粘接劑抗糞腸球菌的性能；微拉曼光譜儀檢測粘接劑雙鍵轉(zhuǎn)化率；制備纖維樁粘接試件，用于即刻和老化后的微推出實驗。結(jié)果表明，改性粘接劑可以抑制糞腸球菌生物膜形成，且EGCG-3Me作用更顯著；改性粘接劑與SB2的雙鍵轉(zhuǎn)化率和即刻微推出粘接強度差異無顯著性（P＞0.05）；老化后改性粘接劑的微推出粘接強度顯著高于SB2（P＜0.05）。

EGCG；EGCG-3Me；粘接劑；粘接穩(wěn)定性

纖維樁在殘根、殘冠的保存治療中應(yīng)用越來越廣泛，已逐漸取代傳統(tǒng)的金屬樁及樁核成為主流的修復(fù)方式。但是，近年來纖維樁修復(fù)的遠期成功率成為備受廣大學(xué)者和臨床醫(yī)生關(guān)注的問題[1，2]。細(xì)菌感染、繼發(fā)齲，以及纖維樁失去粘接力、從根管中脫落都是導(dǎo)致纖維樁修復(fù)失敗的常見問題[3，4]。因此，開發(fā)具有抗菌和提高根管牙本質(zhì)粘接持久性的功能性粘接劑，是延長纖維樁修復(fù)體使用壽命的一項有效措施。本研究擬通過表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）及其甲基化修飾物（EGCG-3Me）對牙本質(zhì)粘接劑進行功能改性，測定改性后粘接劑對根管常見致病菌、糞腸球菌的抗菌性能、粘接劑雙鍵轉(zhuǎn)化率（degree of conversion，DC）以及冷熱循環(huán)老化前后粘接劑與根管牙本質(zhì)的粘接性能，初步探索EGCG及EGCG-3Me功能改性的粘接劑對根管牙本質(zhì)粘接界面穩(wěn)定性的作用，以期為提高纖維樁遠期修復(fù)效果提供可靠的科學(xué)依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 主要原材料

全酸蝕粘接劑Single Bond 2（N689951，3M ESPE，美國）；復(fù)合樹脂F(xiàn)iltekTMZ250（N655907，3M ESPE，美國）；35%磷酸凝膠Ultra-Etch（ET4N6437，Ultradent Products，美國）；腦心浸液培養(yǎng)基（Gibco，美國）；EGCG標(biāo)準(zhǔn)品[（-）-Epigallocatechin gallate analytical standard（Sigma，美國）]；EGCG-3Me（實驗室制備）。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外可見分光光度計（UV-2550，Shimadzu）；EliparTMS10 LED光固化燈（3M ESPE，美國）；活死菌染色試劑盒LIVE/DEAD?BacLightTMBacterial Viability Kit L7012（Molecular Probes，美國）；慢速金剛石刀片切割機（沈陽科晶自動化設(shè)備制造有限公司）；超聲波細(xì)胞粉碎儀（天津科萊恩，中國）；萬能試驗機AGS-10-KN（Shimadzu，日本）；激光共聚焦顯微鏡FluoViewTMFv1000（Olympus，日本）；微拉曼光譜儀HR800（Horiba JOBIN YVON，法國）。

1.3 改性粘接劑的制備

參考Du等[5]的方法將EGCG和EGCG-3Me粉末以400μg/mL的濃度添加至商品粘接劑SingleBond2（SB2）中并充分?jǐn)嚢?，制備成改性粘接劑樣本。實驗分組如下：（1）EGCG 400μ g/mL 改性Single Bond 2（E-SB2）；（2）EGCG-3Me 400μ g/mL改性Single Bond 2（E3-SB2）；（3）Single Bond 2（SB2）。

1.4 改性粘接劑抗菌性能檢測

1.4.1 試件制備

使用96孔板蓋（Corning/Costar，美國）進行粘接劑試件的制備。使用微量加樣器向96孔板蓋的小孔中滴加粘接劑，每孔30μL，然后使用LED光固化燈光照10 s固化，堆塑復(fù)合樹脂并固化，最終得到直徑8 mm，厚度1 mm的粘接劑試件。按照1.3中的分組，每組制備6個試件，無菌蒸餾水37 ℃浸泡24 h去除未聚合單體，干燥后環(huán)氧乙烷熏蒸消毒，分裝備用[5,6]。

1.4.2 細(xì)菌培養(yǎng)及接種

根據(jù)文獻報道[5]，進行細(xì)菌培養(yǎng)及接種，菌種ATCC 29212由第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院檢驗科提供。細(xì)菌培養(yǎng)完成后對各組試件進行漂洗，并按照隨機數(shù)字表隨機分成2組，每組3個，分別用于激光共聚焦顯微鏡及分光光度計檢測。其中細(xì)菌數(shù)量通過分光光度計測得的OD600值表示。OD600值指的是溶液在光波長600 nm 處的吸光值，該數(shù)值與溶液中的吸光物質(zhì)濃度呈正比，在本實驗中即反應(yīng)試件表面附著的細(xì)菌的數(shù)量。

1.4.3 試件表面生物膜觀察

根據(jù)Fang等[6]的描述，對試件表面細(xì)菌生物膜進行染色和觀察。使用激光共聚焦顯微鏡配套軟件FV10-ASW 3.1 Viewer（Olympus

，日本）采集并分析圖像。

參考Du等[5]的實驗，檢測每組試件表面生物膜混懸液的OD600值，每組最終值取各組試件檢測值的平均值。

1.5 微推出粘接強度測試

1.5.1 根管預(yù)備及纖維樁粘接

取因牙周病或正畸治療需要拔除的無齲單根前磨牙30顆，按照隨機數(shù)字表隨機分為3組，每組10顆。參考Zhang等[7]的研究，對牙根進行根管預(yù)備和樁道預(yù)備，采用全酸蝕粘接技術(shù)，分別使用上述3種粘接劑和RelyXARC（3M ESPE，美國）樹脂水門汀粘固纖維樁。每個實驗組的試件隨機分為2個亞組，分別用于即刻微推出粘接強度測試和老化處理后進行微推出粘接強度測試。本研究使用冷熱循環(huán)5 000次作為老化方式（5 ℃和55 ℃水浴，各溫度浸漬時間60 s）。

1.5.2 微推出粘接強度測試

參考Zhang等[7]的研究，制備微推出粘接強度測試試件并參考其測試參數(shù)進行測試。探頭加載速度為0.5 mm/min，將應(yīng)力-時間曲線上波形陡降處的應(yīng)力值計為最大斷裂載荷處Fmax（N）。使用如下公式計算粘接面積 S（mm2）以及粘接強度P（MPa）：P=Fmax/S，S=π（R+r）[H2+（R-r）2]0.5。

1.6 雙鍵轉(zhuǎn)化率測試

取人無齲單根前磨牙18顆，按照隨機數(shù)字表隨機分為3組，每組6顆。按照方法“1.4.1”進行根管預(yù)備和樁道預(yù)備。每組取3顆牙根，沿牙體長軸的方向縱劈為2等份，暴露根管牙本質(zhì)。表面酸蝕處理后涂布各組粘接劑，置于微拉曼光譜儀下，選取牙根上、中、下3個部分隨機進行點檢測。每組剩余的3顆牙根，按照“1.4.1”中方法進行纖維樁粘接，然后將牙根沿牙體長軸縱分為二。選取牙根上、中、下3個部分選取隨機位置，按照根方牙本質(zhì)→粘接劑→樹脂水門汀的順序進行線掃。使用配套軟件LabSpec5采集光譜圖，使用Origin 9.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析處理，得到粘接劑固化前特征峰值：記為和；粘接劑固化后特征峰值：記為和R。用式（1）計算粘接劑的雙鍵轉(zhuǎn)化率（ degree of conversion，DC）[8]：

1.7 統(tǒng)計分析

各實驗數(shù)據(jù)均具備方差齊性（Levene’s test， P＜ 0.05），使用SPSS 13.0軟 件（SPSS 13.0，SPSS Inc，Chicago，USA）對微推出粘接強度測試結(jié)果進行雙因素方差分析，試件表面生物膜OD600值以及雙鍵轉(zhuǎn)化率進行單因素方差分析，選擇Tukey檢驗進行組間兩兩比較，P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗菌性能

熒光染色標(biāo)記后，激光共聚焦顯微鏡下，活著的細(xì)菌被染為綠色，死亡的細(xì)菌被染為紅色（圖1）。SB2組粘接劑固化后表面粘附著一層非常密集的細(xì)菌（圖1A），其中死亡細(xì)菌（紅色）占總細(xì)菌量的比例很?。籈-SB2組粘接劑表面細(xì)菌總數(shù)量較SB2組明顯減少（圖1B），且死亡細(xì)菌（紅色）所占比例有所增加。E3-SB2組粘接劑表面細(xì)菌與SB2組和E-SB2組相比，細(xì)菌總量顯著減少，而且死亡細(xì)菌（紅色）占總菌量比例明顯增加（圖1C）。

圖1 固化后粘接劑表面細(xì)菌生物膜的激光共聚焦顯微鏡觀察Fig.1 CLSM observation of bacterial biofilm on surface of cured adhesives

試件表面生物膜OD600值結(jié)果見圖2。單因素方差分析顯示，粘接劑種類對OD600值有顯著影響（P＜0.001）。組間兩兩比較顯示，E3-SB2組最低，E-SB2組及SB-2組依次升高（P＜0.001）。

圖2 固化后粘接劑表面細(xì)菌生物膜OD600值Fig.2 OD600value of bacterial biofilm on surface of cured adhesives

糞腸球菌（Enterococcus faecalis，E. faecalis）是根管內(nèi)最常見的致病細(xì)菌之一[9]。牙本質(zhì)-樹脂粘接界面在口腔中因溫度變化、咬合力以及粘接劑本身性能等影響產(chǎn)生微滲漏[10]，有利于細(xì)菌侵入牙體組織，進而引發(fā)修復(fù)體邊緣繼發(fā)齲或根管的逆行性感染[10]。EGCG可以抑制多種革蘭氏陽性細(xì)菌，將EGCG添加至粘接劑中，其抗菌作用不隨水存老化時間的延長而減弱[5]。然而，EGCG穩(wěn)定性較差，在生理條件下易發(fā)生變性[11]。EGCG-3Me穩(wěn)定性好，更易溶于血液，且抗過敏、抗血管緊張素、抗結(jié)核分枝桿菌等方面均優(yōu)于EGCG[12～14]。激光共聚焦顯微鏡觀察顯示 ， 當(dāng) EGCG和 EGCG-3Me的 濃 度 為 400 μg/mL時，試件表面粘附的細(xì)菌總數(shù)量明顯下降且細(xì)菌中死菌數(shù)量明顯增加。同濃度下，EGCG-3Me對糞腸球菌生長的抑制作用更強。OD600結(jié)果顯示，E-SB2和E3-SB2組的試件表面糞腸球菌生物膜的細(xì)菌數(shù)量顯著低于SB2組，且E3-SB2組低于E-SB2組（P＜0.0 5）。EGCG可能通過抑制細(xì)菌的葉酸代謝、誘導(dǎo)細(xì)菌內(nèi)氧化應(yīng)激的發(fā)生或產(chǎn)生羥自由基等機制殺傷細(xì)菌[5，15]。此外，它可以減少糞腸球菌分泌明膠酶、膠原鏈接抗原、細(xì)胞溶素以及蛋白酶等毒力因子的能力，抑制細(xì)菌生物膜的形成[16]。本研究中，EGCG-3Me改性的粘接劑表現(xiàn)出更好的抗糞腸球菌生物膜形成的作用?？赡苁荅GCG-3Me結(jié)構(gòu)中的甲基增強了分子的穩(wěn)定性和親脂性，有利于EGCG-3Me的穩(wěn)定及其與細(xì)菌細(xì)胞膜的結(jié)合能力，進而增強其抗菌效果[17]。

2.2 微推出粘接強度

各實驗組微推出粘接強度的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差見表1。雙因素方差分析顯示，粘接劑種類對微推出粘接強度無顯著影響（P=0.47 7），老化處理對微推出粘接強度有顯著影響（P=0.004），粘接劑種類和老化處理之間無顯著交互作用（P=0.261）。Tukey檢驗組間兩兩比較顯示，各實驗組間的即刻微推出粘接強度無顯著性差異（P＞0.05）。冷熱循環(huán)老化5 000次后，各組微推出粘接強度較老化前均呈現(xiàn)下降趨勢（P＜0.05）。老化后，ESB2和E3-SB2組微推出粘接強度均明顯高于SB2組（P＜0.05），E-SB2組和E3-SB2組老化后的微推出粘接強度無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

“MMPs（基質(zhì)金屬蛋白酶）降解牙本質(zhì)膠原”被認(rèn)為是牙本質(zhì)-樹脂粘接界面退變的主要機制[18]。氯己定、乙二胺四乙酸、季銨鹽類抗菌單體等外源性MMPs抑制劑被學(xué)者們用來抑制MMPs的活性，從而保護牙本質(zhì)-樹脂粘接界面[19]。研究證明，EGCG對MMP-2和MMP-9有明顯的抑制作用[20]，EGCG改性粘接劑可以促進冠方牙本質(zhì)粘接的耐久性[5]。EGCG及EGCG-3Me為茶葉提取物，相較于化學(xué)類MMPs抑制劑毒性小，應(yīng)用于口腔中更安全[5]。冷熱循環(huán)老化5 000次可以加速冠方牙本質(zhì)-樹脂粘接界面的退行性變[21]。本研究中，各組微推出粘接強度在冷熱循環(huán)老化5 000次后均顯著降低，證實冷熱循環(huán)5 000次用于模擬纖維樁修復(fù)體在口內(nèi)的老化效果的可行性。微推出粘接強度測試顯示，EGCG和EGCG-3Me可以顯著提高樹脂-根管牙本質(zhì)粘接界面的穩(wěn)定性。EGCG和EGCG-3Me可能是通過抑制牙本質(zhì)源性MMPs的活性，進而提高樹脂-根管牙本質(zhì)粘接界面的穩(wěn)定性。學(xué)者認(rèn)為，EGCG通過改變MMPs的結(jié)構(gòu)、與鋅離子發(fā)生螯合作用影響MMPs活化來抑制MMPs的作用[20]。EGCG-3Me對MMPs的抑制作用目前尚未見報道，其作用機制可能與EGCG相似。有報道稱，隨著EGCG結(jié)構(gòu)中甲基的增多，其對蛋白酶體的抑制作用降低[11]；同時有研究發(fā)現(xiàn)，隨著結(jié)構(gòu)中甲基的增多，EGCG對血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的抑制作用有所提高[12]。本研究的結(jié)果顯示，EGCG-3Me及EGCG改性粘接劑冷熱循環(huán)5 000次后的微推出粘接強度沒有顯著性差異，提示2種物質(zhì)提高樹脂-根管牙本質(zhì)粘接界面耐久性的作用相近。然而，EGCG-3Me在中性以及堿性環(huán)境中，穩(wěn)定性均優(yōu)于EGCG。在長期復(fù)雜的口腔環(huán)境中，EGCG-3Me可能會表現(xiàn)出更持久的生物活性作用。在后期的實驗中，將通過檢測EGCG和EGCG-3Me對牙源性MMPs活性的抑制作用，深入探討它們抗MMPs的作用以及提高根管牙本質(zhì)粘接界面穩(wěn)定性的可能機制。

各實驗組雙鍵轉(zhuǎn)化率的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差見表2。單因素方差分析顯示，粘接劑種類對

表1 各組試件微推出粘接強度測試結(jié)果Tab.1 Push-out bonding strength results

雙鍵轉(zhuǎn)化率無顯著影響（P＞0.05）。組間兩兩比較顯示，對照組SB2、E-SB2和E3-SB2 3種粘接劑的雙鍵轉(zhuǎn)化率均沒有顯著性差異（P＞0.05）。

表2 粘接劑雙鍵轉(zhuǎn)化率（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）Tab.2 Degree of double bond conversion（mean±standard deviation）

雙鍵轉(zhuǎn)化率的結(jié)果顯示，在EGCG和EGCG-3Me的添加濃度為400 μg/mL時，粘接劑固化性能并未受到影響。Du等[5]采用了傅里葉紅外光譜法檢測粘接劑雙鍵轉(zhuǎn)化率，發(fā)現(xiàn)當(dāng)EGCG的添加量達到300 μg/mL時，粘接劑雙鍵轉(zhuǎn)化率輕微下降，但數(shù)值無統(tǒng)計學(xué)差異。2種檢測方法所得到的結(jié)果一致。因此，采用離體牙-纖維樁粘接模型和微拉曼光譜儀檢測粘接劑雙鍵轉(zhuǎn)化率是一種可靠的方法，具有較好的研究前景。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，EGCG和EGCG-3Me改性的粘接劑都表現(xiàn)出了一定的抗糞腸球菌生物膜形成的作用，其中EGCG-3Me的效果更好，同時2種改性粘接劑都能夠起到改善樹脂-根管牙本質(zhì)粘接耐久性的作用，且不會影響材料聚合固化的雙鍵轉(zhuǎn)化率。因此，將400 μg/mL EGCG和EGCG-3Me添加到全酸蝕粘接劑Single Bond 2中對其進行功能改性具有較高的可行性，且改性粘接劑E3-SB2較E-SB2的效果更好。提示改性粘接劑E3-SB2用于有根尖周感染或根管感染病史的患牙的纖維樁修復(fù)，具有良好的應(yīng)用前景。

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Effects of EGCG and EGCG-3Me on the bonding stability to intraradicular dentin

YU Hao-han1, ZHANG Ling1, LI Fang1, LIU Zheng-ya1, LI Yin-hua2, CHEN Ji-hua1

(1.State Key Laboratory of Military Stomatology&National Clinical Research Center for Oral Diseases&Shaanxi Key Laboratory of Oral Diseases, Department of Prosthodontics, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, Xi'an, Shaanxi 710032, China; 2.National Research Center of Engineering Technology for Utilizations of Functional Ingredients from Botanicals, Key Laboratory of Tea Science of Ministry of Education, Hunan Agricultural University, Changsha, Hunan 410128, China)

Epigallocatechin-3-gallate (EGCG) and epigallocatechin-3-O-(3-O-methyl)-gallate ( EGCG-3Me ) was incorporated into the total-etch adhesive of Single Bond 2 separately to obtain two modified adhesives E-SB2 and E3-SB2 with the concentration of 400 μg/mL of EGCG and EGCG-3Me respectively. The confocal laser scanning microscopy (CLSM) and the ultraviolet spectrophotometry were used to evaluate the anti-bacterial effect of modified adhesives. The micro-Raman spectrum was used to test the degree of double bond conversion (DC) of adhesives. The push-out bond strength test was conducted to test the immediate bonding strength and the bonding strength after thermocycling. The results demonstrated that E-SB2 and E3-SB2 both showed inhibiting effect to the growth and activity of E.faecalis, while E3-SB2 performed stronger inhibiting effect. The DC and immediate push-out bonding strength of SB2 were not decreased with the incorporation of EGCG or EGCG-3Me (P>0.05). E-SB2 and E3-SB2 showed significantly higher push-out bonding strengths than that of SB2 (P < 0.05).

epigallocatechin-3-gallate; epigallocatechin-3-O-(3-O-methyl)-gallate; adhesive; stability

TQ437

A

1001-5922（2017）09-0017-06

2017-03-29

余昊翰（1990-），男，博士在讀，研究方向：口腔粘接材料、高分子材料、纖維樁。E-mail：yhh.king@foxmail.com。

張凌（1980-）女，博士、講師、主治醫(yī)師。研究方向：口腔粘接材料、高分子材料、纖維樁；發(fā)表論文數(shù)：SCI論文近20篇，中文核心期刊近10篇，會議論文近10篇，參編專著2本。E-mail：ciaociaofan@qq.com。

國家自然科學(xué)基金（No.51373198，81470773，81571019），陜西省重點研發(fā)計劃項目（2017SF-115），長江學(xué)者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃（IRT13051）。