激光共聚焦顯微鏡在牙本質(zhì)粘接界面觀察中的應(yīng)用

周 唯，陳吉華

（軍事口腔醫(yī)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，口腔疾病國(guó)家臨床醫(yī)學(xué)研究中心，陜西省口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，空軍軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院修復(fù)科，陜西 西安 710032）

激光共聚焦顯微鏡在牙本質(zhì)粘接界面觀察中的應(yīng)用

周 唯，陳吉華

（軍事口腔醫(yī)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，口腔疾病國(guó)家臨床醫(yī)學(xué)研究中心，陜西省口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，空軍軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院修復(fù)科，陜西 西安 710032）

先制備牙本質(zhì)粘接試件，將切片打磨后使用激光共聚焦顯微鏡對(duì)牙本質(zhì)粘接界面的自發(fā)熒光特征進(jìn)行探測(cè)。不同粘接劑形成的粘接界面都表現(xiàn)出了特異性的自發(fā)熒光現(xiàn)象，不同結(jié)構(gòu)區(qū)分明顯。這種激光共聚焦顯微鏡探測(cè)自發(fā)熒光有可能成為一種新的牙本質(zhì)粘接界面觀察分析方法。

牙科粘接劑；牙本質(zhì)粘接界面；自發(fā)熒光；激光共聚焦顯微鏡

牙科粘接技術(shù)和粘接修復(fù)材料在經(jīng)過數(shù)十年的發(fā)展后，其短期修復(fù)效果大多良好，但長(zhǎng)期穩(wěn)定性不太理想，牙本質(zhì)粘接耐久性的保持已成為制約牙科粘接修復(fù)效果提高的重要問題[1]。近年來，國(guó)內(nèi)外都有大量的研究，并提出了很多新的粘接技術(shù)和粘接修復(fù)材料。值得注意的是，所有提高牙本質(zhì)粘接耐久性措施的有效性確認(rèn)都必須依賴于各種粘接性能檢測(cè)手段，其中非常重要也是必不可少的一項(xiàng)就是牙本質(zhì)粘接界面的觀察分析。目前常用的粘接界面觀察分析方法包括掃描電子顯微鏡、透射電子顯微鏡和顯微拉曼光譜等[2～4]，然而這些方法都有缺點(diǎn)或局限。例如電鏡技術(shù)，都有樣本制作復(fù)雜、操作敏感性較高等缺點(diǎn)，并且樣本的觀察分析是一次性的，無法實(shí)現(xiàn)對(duì)同一樣本粘接界面的變化進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。

自發(fā)熒光（Auto-fluorescence，AF）是物質(zhì)受一定光線激發(fā)后，其本身發(fā)出的一種熒光現(xiàn)象[5]。有研究表明，牙體硬組織能夠在一定激發(fā)光下產(chǎn)生自發(fā)熒光現(xiàn)象，并且在齲壞時(shí)牙本質(zhì)和牙釉質(zhì)的自發(fā)熒光信號(hào)會(huì)發(fā)生改變，這些均能夠被激光共聚焦顯微鏡（Confocal Laser Scanning Microscopy，CLSM）觀察到，因此，自發(fā)熒光可被用于對(duì)未發(fā)生組織崩解的早期齲的探測(cè)[6～8]?？梢娮园l(fā)熒光能夠被當(dāng)作一種物質(zhì)的特有屬性，用于復(fù)合結(jié)構(gòu)觀察辨認(rèn)的分析研究中。那么牙科粘接劑和牙本質(zhì)粘接界面的各個(gè)結(jié)構(gòu)是否也具有自發(fā)熒光、是否具備足夠的特異性以用于對(duì)牙本質(zhì)粘接界面的觀察分析呢？本研究以檢測(cè)牙本質(zhì)粘接界面的自發(fā)熒光為特性，使用激光共聚焦顯微鏡探測(cè)自發(fā)熒光這種技術(shù)在牙本質(zhì)粘接界面觀察分析中的應(yīng)用前景進(jìn)行評(píng)估。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

新鮮無齲的離體人第3磨牙（通過第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并與病人簽署知情同意書）；全酸蝕粘接劑（Adaper?Single bond 2）、自酸蝕粘接劑（Adaper?Easy One）、37%磷酸凝膠（Scotchbond?Universal Etchant） 、 Z250復(fù)合樹脂（Filtek? Z250），美國(guó)3M ESPE公司；自酸蝕粘接劑（Clearfil? SE Bond、Clearfil?S3 Bond），日本Kuraray Noritake Dental公司； 氰基丙烯酸膠（Zapit, Dental Ventures of America） ， 美國(guó)Anaheim Hills公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

SYJ-150型慢速切割機(jī)，中國(guó)沈陽(yáng)科晶公司；BioSonic UC50D型超聲波清洗機(jī)，美國(guó)威爾登特公司；臨床三用氣槍、Spectrum ?800型光固化燈，美國(guó)登士柏公司；MATADOR型水砂紙，德國(guó)公司；FV1000型激光共聚焦顯微鏡，日本Olympus Corp.公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 牙本質(zhì)粘接試件的分組制備

取新鮮無齲人的第3磨牙（拔除后30 d以內(nèi)，保存在4 ℃生理鹽水中），慢速切割機(jī)和金剛砂切割片在冷水下去除冠部釉質(zhì)及牙根，制成2 mm厚的牙本質(zhì)片。水砂紙按20 μm、10 μm、5 μm、3 μm、2 μm的次序進(jìn)行逐級(jí)打磨，然后蒸餾水超聲清洗5 min，以形成類似牙體預(yù)備后的牙本質(zhì)玷污層。使用氰基丙烯酸膠將牙本質(zhì)片固定在樹脂平臺(tái)上，連接水壓裝置并設(shè)置20 cm的水柱壓力以模擬髓腔壓力[9]。4種粘接劑的使用均按照說明書中的指導(dǎo)進(jìn)行牙本質(zhì)粘接，然后堆塑1 mm厚的Z250復(fù)合樹脂并固化。

此外，還要對(duì)所有固化粘接劑本身的自發(fā)熒光進(jìn)行觀察，并設(shè)立了2組對(duì)照組，包括：①磷酸酸蝕不粘接組，使用37%磷酸凝膠處理牙本質(zhì)15 s，不涂布粘接劑，然后堆塑復(fù)合樹脂；②直接涂布粘接劑組，在預(yù)備好的牙本質(zhì)片表面直接涂抹粘接劑Single Bond 2，固化后再堆塑復(fù)合樹脂。

1.3.2 激光共聚焦顯微鏡觀察

按照上述方法制備的牙本質(zhì)粘接樣本在37℃生理鹽水中保存24 h，待材料完全聚合后，使用慢速切割機(jī)在水冷卻下，沿垂直于粘接界面的方向?qū)⒀辣举|(zhì)片切成厚度為0.5 mm的薄片，然后使用水砂紙打磨，用蒸餾水超聲清洗10 min。為了預(yù)防牙本質(zhì)樣本在觀察過程中發(fā)生因干燥脫水而導(dǎo)致的組織收縮，在進(jìn)行激光共聚焦顯微鏡觀察前，通過在濕潤(rùn)樣本上滴加甘油來阻止水分蒸發(fā)[10]。制備好的樣本置于蓋玻片上，使用激光共聚焦顯微鏡在488 nm的激發(fā)波長(zhǎng)及505 nm濾鏡下對(duì)樣本的自發(fā)熒光進(jìn)行激發(fā)并觀察[11，12]。在對(duì)粘接劑本身自發(fā)熒光情況進(jìn)行觀察時(shí)，在粘接劑旁邊放置了正常牙本質(zhì)樣本作為對(duì)比，以便更好地對(duì)粘接劑自發(fā)熒光情況進(jìn)行研究。圖像觀察采集使用逐層掃描的方法，掃描厚度為2 μm，獲取的圖像使用FV10-ASW 3.1 Viewer軟件進(jìn)行深度方向的疊加形成最終圖像。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)果

Single Bond 2粘接組、酸蝕不粘接組以及不酸蝕粘接組的激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果如圖1所示。圖像的灰度代表了熒光信號(hào)的強(qiáng)弱，灰度越高，熒光信號(hào)越強(qiáng)，反之亦然。在低倍視野中可以看到（圖1，A，B，C），牙本質(zhì)能夠發(fā)出中等強(qiáng)度的熒光，而復(fù)合樹脂的自發(fā)熒光信號(hào)則非常低。值得注意的是，在Single Bond 2粘接組和酸蝕不粘接組，牙本質(zhì)和復(fù)合樹脂之間可以觀察到一條亮帶。在高倍鏡觀察下（圖1，a，b，c）Single Bond 2粘接組界面處能夠觀察到4層結(jié)構(gòu)，分別為，熒光信號(hào)相對(duì)最弱的復(fù)合樹脂（RC）；正常牙本質(zhì)顯示出一般強(qiáng)度的自發(fā)熒光，并且能夠清楚的觀察到牙本質(zhì)小管（MD）；在視野中相對(duì)最明顯的是位于牙本質(zhì)表面的一個(gè)高熒光信號(hào)帶，寬度在5 μm左右（箭頭），此外，亮帶之上還能夠看到一層稍稍低于牙本質(zhì)的熒光強(qiáng)度，但強(qiáng)于復(fù)合樹脂的結(jié)構(gòu)（A）。而在酸蝕不粘接組的界面中只能觀察到3種結(jié)構(gòu)，分別為中等熒光強(qiáng)度的牙本質(zhì)（MD）、幾乎不發(fā)熒光的復(fù)合樹脂（RC）以及寬度為5 μm左右的高熒光信號(hào)帶（DD）。不酸蝕粘接組中界面結(jié)構(gòu)也只有3層，但是與酸蝕不粘接組相比，高熒光信號(hào)帶消失，而在Single Bond 2組中存在稍稍低于牙本質(zhì)的熒光強(qiáng)度，但強(qiáng)于復(fù)合樹脂的結(jié)構(gòu)則再次出現(xiàn)（A）。

圖1 牙本質(zhì)粘接界面自發(fā)熒光激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果Fig.1 Observed results of dentin-adhesive interfaces spontaneous fluorescence by laser confocal microscopy

3種自酸蝕粘接劑處理組的激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果如圖2所示。除了正常牙本質(zhì)（MD）和復(fù)合樹脂部分（RC）是相同的之外，其界面自發(fā)熒光特征與全酸蝕粘接劑Single Bond 2有著較大的不同。在低倍鏡下，3種自酸蝕粘接劑處理的界面處都能觀察到一條自發(fā)熒光信號(hào)很強(qiáng)的帶狀區(qū)域，然而通過高倍鏡可以發(fā)現(xiàn)，2種一步法自酸蝕粘接劑的粘接界面相似，都表現(xiàn)為3層結(jié)構(gòu)，在牙本質(zhì)和復(fù)合樹脂間能夠發(fā)現(xiàn)一條寬度在10 μm左右的高熒光信號(hào)帶（圖2，a，b箭頭）。而2步法自酸蝕粘接劑SE Bond除了在界面處觀察到強(qiáng)熒光信號(hào)帶外，牙本質(zhì)小管所在的位置也能發(fā)現(xiàn)很多高亮區(qū)域（圖2，c），這是其他粘接處理組所沒有的特征。

對(duì)各種粘接劑本身自發(fā)熒光的觀察結(jié)果如圖3所示。粘接劑邊緣呈圓弧形，并與作對(duì)比用的牙本質(zhì)片相鄰?？梢钥闯鯯ingle Bond 2的自發(fā)熒光強(qiáng)度稍低于牙本質(zhì)（圖3，A），而Easy One和S3 Bond的自發(fā)熒光強(qiáng)度則要明顯弱于正常牙本質(zhì)（圖3，B，C）。在SE Bond的圖像中出現(xiàn)了大面積的紅色區(qū)域，這是熒光信號(hào)過高導(dǎo)致信號(hào)采集時(shí)過度曝光所致（圖3，D，E）。圖中RC為復(fù)合樹脂，A為粘接劑，MD為正常牙本質(zhì)。

圖2 牙本質(zhì)粘接界面自發(fā)熒光激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果Fig.2 Observed results of dentin-adhesive interfaces spontaneous fluorescence by laser confocal microscopy

圖3 粘接劑自發(fā)熒光激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果（×100倍）Fig.3 Observed results of adhesive spontaneous fluorescence by laser confocal microscopy

2.2 討論

自發(fā)熒光與經(jīng)熒光染料染色的外源性熒光不同，其是物質(zhì)本身的一種屬性[5]。牙本質(zhì)粘接界面含有多種不同成分組成的結(jié)構(gòu)，根據(jù)相關(guān)研究結(jié)果可以推測(cè)牙本質(zhì)粘接界面也會(huì)有其特殊的自發(fā)熒光特征，并且不同的粘接系統(tǒng)其粘接界面的自發(fā)熒光特征是不同的。按照這個(gè)假設(shè)，設(shè)計(jì)了觀察牙本質(zhì)粘接界面自發(fā)熒光的試驗(yàn)研究，以期得到一種新的觀察分析牙本質(zhì)粘接界面的方法。

Single Bond 2是一種經(jīng)典的2步法全酸蝕粘接劑，Single Bond 2在牙本質(zhì)粘接界面的結(jié)構(gòu)及形成過程如下：牙本質(zhì)表面首先在酸蝕劑的作用下，玷污層被溶解去除，牙本質(zhì)小管口開放，牙本質(zhì)表面輕度脫礦，膠原纖維暴露，在保持濕潤(rùn)的情況下涂布粘接劑，粘接劑滲入脫礦的牙本質(zhì)，以包裹膠原纖維從而形成混合層（Hybrid layer），另外粘接劑還可以滲入牙本質(zhì)小管內(nèi)形成樹脂突（Resin tags），在混合層上面則是粘接劑層（Adhesive layer），并以此與復(fù)合樹脂（Resin composite）相接[13]。按照這幾種結(jié)構(gòu)在粘接界面的位置分布與激光共聚焦顯微鏡圖像進(jìn)行對(duì)照可推測(cè)，Single Bond 2組中，牙本質(zhì)和復(fù)合樹脂之間的2層結(jié)構(gòu)應(yīng)該就是混合層和粘接劑層，其中靠近牙本質(zhì)一側(cè)的應(yīng)為混合層，而靠近復(fù)合樹脂一側(cè)的為粘接劑層。在激光共聚焦顯微鏡的觀察下，混合層發(fā)射出很強(qiáng)的熒光，具有很高的辨識(shí)度（圖1，a）。

在對(duì)照組中可以發(fā)現(xiàn)，在酸蝕組的界面也能觀察到一條高熒光信號(hào)帶，亮度略低于混合層，但寬度與混合層一樣（圖1，b）；而未經(jīng)酸蝕只涂布粘接劑的牙本質(zhì)則沒有觀察到此結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)，只存在發(fā)出弱熒光的粘接劑層（圖1，c）。根據(jù)這個(gè)結(jié)果可以推測(cè)，牙本質(zhì)在酸蝕劑的作用下發(fā)生了表層脫礦，因脫礦而暴露膠原的牙本質(zhì)之自發(fā)熒光強(qiáng)于正常的礦化牙本質(zhì)，從對(duì)粘接劑本身自發(fā)熒光的分析結(jié)果中也可以發(fā)現(xiàn)，Single Bond 2能夠發(fā)出稍弱于正常牙本質(zhì)的自發(fā)熒光（圖3，A）。混合層是牙本質(zhì)脫礦粘接劑滲入所形成的結(jié)構(gòu)，由于粘接劑中不含有任何阻射成分[14]，其滲入非但不能阻擋脫礦牙本質(zhì)的自發(fā)熒光，反而還因?yàn)楸旧淼臒晒庠黾恿嘶旌蠈拥臒晒鈴?qiáng)度，這可能是酸蝕后，粘接組中的混合層和自酸蝕組中的脫礦牙本質(zhì)層都能發(fā)出較強(qiáng)熒光信號(hào)、同時(shí)混合層的熒光強(qiáng)度又略強(qiáng)于脫礦層的緣故。樹脂突是粘接劑進(jìn)入牙本質(zhì)小管形成的結(jié)構(gòu)，由于Single Bond 2本身的熒光強(qiáng)度略弱于牙本質(zhì)，因此樹脂突與牙本質(zhì)的熒光交雜在一起，在激光共聚焦顯微鏡下難以分辨。

Easy One和S3 Bond是目前常用的2種一步法自酸蝕粘接劑，其溶解但是不去除玷污層。這種粘接劑中含有一定量的酸性功能單體，可在溶解玷污層的同時(shí)與牙本質(zhì)發(fā)生化學(xué)結(jié)合[15]。因此，在一步法自酸蝕粘接劑的界面可以觀察到粘接劑改性的玷污層。在這2種粘接劑處理組的自發(fā)熒光觀察結(jié)果中，都能在牙本質(zhì)表面看到一層高熒光信號(hào)帶（圖2，A，B，a，b）。而在對(duì)粘接劑本身自發(fā)熒光的觀察中還能發(fā)現(xiàn)，Easy One和S3 Bond所發(fā)出的熒光明顯弱于牙本質(zhì)（圖3，B，C），因此在粘接界面處的高熒光信號(hào)帶是一步法自酸蝕粘接劑與玷污層和牙本質(zhì)發(fā)生反應(yīng)的結(jié)果，代表了粘接劑改性的玷污層。可見自發(fā)熒光法對(duì)一步法自酸蝕粘接劑形成的粘接界面也有很高的分辨能力。

SE Bond是目前國(guó)內(nèi)臨床上最常用的2步法自酸蝕粘接劑之一，分為底涂劑（primer）和粘合劑（bond）這2個(gè)部分，含有大量酸性單體的primer能夠起到酸蝕溶解玷污層的作用，并能滲透到深層的牙本質(zhì)中形成樹脂突，然后再涂布起封閉作用的bond[14，16]。因此，在SE Bond的粘接界面含有包括primer改性的玷污層以及進(jìn)入到牙本質(zhì)小管中的粘接劑所形成的樹脂突。從SE Bond界面的自發(fā)熒光觀察結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，牙本質(zhì)表面的高熒光信號(hào)帶的位置應(yīng)該就是primer改性的玷污層（圖2，C，c）。在對(duì)SE Bond本身熒光進(jìn)行觀察后發(fā)現(xiàn)，其primer和bond都能發(fā)出很強(qiáng)的熒光（圖3，D，E），這就能夠解釋激光共聚焦圖像中粘接界面以下位于牙本質(zhì)小管中的高熒光信號(hào)結(jié)構(gòu)，這應(yīng)該就是粘接劑所形成的樹脂突。

3 結(jié)語(yǔ)

不同類型的粘接劑所形成的粘接界面的不同結(jié)構(gòu)在激光共聚焦顯微鏡下都表現(xiàn)出了相應(yīng)的自發(fā)熒光特征。與掃描電鏡、透射電鏡等常見的粘接界面觀察方法相比，此種方法不需經(jīng)過固定、干燥和脫水等步驟，既能保持粘接樣本最原始的狀態(tài)，又簡(jiǎn)化了樣本制作步驟，并且能夠獲得一些特別的信息。使用CLSM觀察后的樣本還能再次使用，使得對(duì)同一樣本進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)成為可能，從而可更好地對(duì)牙本質(zhì)粘接界面的老化過程進(jìn)行觀察分析。

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遺失聲明

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特此聲明。

粘接雜志編輯部

2017年9月1日

Observation of the dentin-adhesive interface using confocal laser scanning microscopy

ZHOU Wei, CHEN Ji-hua
(State Key Laboratory of Military Stomatology&National Clinical Research Center for Oral Diseases&Shaanxi Key Laboratory of Oral Diseases, Department of Prosthodontics, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, Xi'an, Shaanxi 710032, China)

The dentin bonding specimens were prepared according to instruction of manufactures. Then bonding specimens were cut into the slices and polished. Then all the specimens were observed by the confocal laser scanning microscopy under the same condition. The results showed that the dentin-adhesive interfaces formed by different bonding agents exhibited special auto-fluorescence. Identification of different structure in the bonding interface was distinctive. So the observation of auto-fluorescence by confocal laser scanning microscopy could be a novel method for the analysis to the dentin-adhesive interface.

dental adhesive; dentin-adhesive interface; auto-fluorescence; confocal laser scanning microscopy

TQ430

A

1001-5922（2017）09-0022-05

2017-03-25

周唯（1986-），女，博士研究生，主治醫(yī)師，研究領(lǐng)域及成果：牙科粘接修復(fù)材料技術(shù)、生物高分子材料。已發(fā)表中文核心期刊論文2篇，SCI論文3篇。E-mail：zw861231@163.com。

國(guó)家自然科學(xué)基金（81470773）；教育部創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)及長(zhǎng)江學(xué)者獎(jiǎng)勵(lì)計(jì)劃（No.IRT13051）。