以乙肝病毒核心蛋白為載體制備腸道病毒71型非結(jié)構(gòu)蛋白3D單克隆抗體①

李永超 朱 瑞 徐龍發(fā) 巫洋濤 趙 歡 吳 坤 劉東曉 程 通 夏寧邵

(廈門大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院分子疫苗學(xué)與分子診斷學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研究中心，廈門361102)

·免疫學(xué)技術(shù)與方法·

以乙肝病毒核心蛋白為載體制備腸道病毒71型非結(jié)構(gòu)蛋白3D單克隆抗體①

李永超 朱 瑞 徐龍發(fā) 巫洋濤 趙 歡 吳 坤 劉東曉 程 通 夏寧邵

(廈門大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院分子疫苗學(xué)與分子診斷學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研究中心，廈門361102)

目的：預(yù)測(cè)腸道病毒71型(EV71)非結(jié)構(gòu)蛋白3D的表位，以HBc蛋白為載體展示多肽，制備并鑒定抗EV71-3D的特異性單克隆抗體(mAb)。方法：應(yīng)用生物信息學(xué)方法分析預(yù)測(cè)出EV71 3D蛋白親水性和免疫原性指數(shù)較高的多肽片段，并運(yùn)用HBc顆粒型蛋白載體展示肽段，構(gòu)建多肽融合蛋白，免疫BALB/c雌鼠，通過雜交瘤技術(shù)和親和層析技術(shù)制備和純化抗EV71-3D蛋白的特異性mAb，用間接ELISA、ELISPOT、IFA和IHC對(duì)mAb的性質(zhì)進(jìn)行初步鑒定。結(jié)果：構(gòu)建表達(dá)分別嵌合3D蛋白34～43位氨基酸殘基、 61～76位氨基酸殘基、151～164位氨基酸殘基的HBc重組蛋白，免疫并經(jīng)過多輪克隆化篩選，獲得抗EV71-3D單克隆抗體3E1，其亞類為IgG2a；免疫熒光試驗(yàn)、ELISPOT法和免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示其可與EV71特異性結(jié)合。結(jié)論：成功制備可特異性識(shí)別EV71的單克隆抗體3E1，為病毒的檢測(cè)及進(jìn)一步研究3D蛋白的功能奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)還驗(yàn)證了生物信息學(xué)技術(shù)與HBc顆粒型載體展示多肽技術(shù)相結(jié)合可快速高效地制備單克隆抗體。

乙肝病毒核心蛋白；腸道病毒71型；非結(jié)構(gòu)蛋白3D；單克隆抗體

手足口病(Hand,foot and mouth disease，HFMD)是一種常見的嬰幼兒傳染性疾病，其主要病原體之一為腸道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)。EV71感染不僅可引起患者的手、足和口腔等部位出現(xiàn)皰疹，重癥者還可引發(fā)心肌炎、肺水腫、無菌性腦膜炎或脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹等嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，個(gè)別嚴(yán)重患者甚至引起死亡[11-16]。EV71屬小RNA病毒科腸道病毒屬，病毒基因組為單股正鏈RNA，含一個(gè)開放閱讀框(ORF)，由P1-P3編碼翻譯產(chǎn)生。其中P3區(qū)編碼的前體蛋白可被水解成非結(jié)構(gòu)蛋白3A、3B、3C和3D。3D蛋白由462個(gè)氨基酸組成，是有一段核定位信號(hào)(Nuclear localization signal，NLS)的RNA 依賴多聚酶(RNA dependent RNA polymerase，RDRP)，能催化VPg蛋白的尿苷酸化，啟始病毒RNA的復(fù)制[11-13]。此外，有研究證明3D蛋白可以使宿主細(xì)胞停滯在S期，從而影響病毒感染細(xì)胞后的整個(gè)生命周期[14,15]。因此，快速獲得針對(duì)3D蛋白的單克隆抗體，能更好地研究3D蛋白在EV71病毒致病機(jī)理中所起的作用。

本研究利用生物信息學(xué)方法和顆粒型蛋白載體展示技術(shù)預(yù)測(cè)并表達(dá)重組蛋白，成功制備抗EV71非結(jié)構(gòu)蛋白3D的單克隆抗體，驗(yàn)證生物信息學(xué)預(yù)測(cè)多肽技術(shù)和顆粒型蛋白載體展示技術(shù)在單抗篩選中的可行性。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1細(xì)胞株、病毒株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物細(xì)胞株 小鼠骨髓瘤細(xì)胞(Sp2/0)為本實(shí)驗(yàn)室保存；人惡性胚胎橫紋肌瘤細(xì)胞(RD)購(gòu)于ATCC；病毒株:EV71 JS-06-52-3 (GenBank:FJ600325.1)為C4亞型，來源于江蘇省CDC；PSVA-EV71-Mp4為鼠適應(yīng)株[16]，原型株為感染性克隆PSVA-EV71(GenBank:AB469182，Satoshi Koike博士惠贈(zèng))；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:6～8周齡SPF級(jí)BALB/c雌鼠，14～18日齡SPF級(jí)BALB/c孕鼠，均購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.1.2主要試劑培養(yǎng)基 RPMI1640和MEM培養(yǎng)基均購(gòu)自Gibco公司；細(xì)胞培養(yǎng)用胎牛血清(FBS)購(gòu)自Invitrogen公司；弗氏不完全和弗氏完全佐劑購(gòu)自Sigma公司；抗體純化介質(zhì)Protein A購(gòu)自GE公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG及 TMB顯色底物購(gòu)自北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1EV71 3D蛋白的預(yù)測(cè)及表達(dá)載體的構(gòu)建 EV71 3D蛋白抗原預(yù)測(cè) 根據(jù)EV71 JS-06-52-3中非結(jié)構(gòu)蛋白3D的序列信息，采用protean、IEDB、epitopia等軟件對(duì)3D蛋白氨基酸序列進(jìn)行親疏水性和免疫原性分析。選取親水性高，免疫原性強(qiáng)的氨基酸區(qū)段為候選展示肽段，由上海生物工程公司進(jìn)行全基因合成。對(duì)合成的肽段進(jìn)行上下游引物互搭，反應(yīng)體系為48 μl水，上下游引物各1 μl，混合后于90℃反應(yīng)4 min，然后置于70℃反應(yīng)10 min，緩慢冷卻至室溫。將互搭好的片段插入到pC149/mut載體上，插入位點(diǎn)為BamHⅠ和EcoRⅠ[17]。將連接后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化ER2566菌株，挑取單克隆菌落進(jìn)行PCR和測(cè)序鑒定(測(cè)序由英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行)，從而獲得包含目的片段的陽(yáng)性克隆。

1.2.2重組蛋白的表達(dá)、純化與鑒定 將包含正確重組質(zhì)粒的ER2566菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)表達(dá)條件為0.2 mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在30℃誘導(dǎo)表達(dá)6 h。收集菌液于磷酸鹽緩沖液(0.5 mmol/L EDTA，300 mmol/L NaCl，0.2 mol/L NaHPO4,0.2 mol/L NaHPO4,pH6.0)中重懸并進(jìn)行超聲破碎離心，將離心得到的上清組分經(jīng)熱變性(65℃，反應(yīng)30 min)和飽和硫酸銨沉淀方法進(jìn)行純化，接著將純化后的重組蛋白透析至10 mmol/L PBS緩沖液中，隨后運(yùn)用SDS-PAGE凝膠電泳和負(fù)染透射電鏡觀察鑒定。

1.2.3透射電鏡觀察與同源模建 將蛋白樣品滴加到200目的銅柵上，吸附10 min，接著用純水洗滌銅柵2次并晾干，最后用2%磷酸鎢溶液負(fù)染銅柵15 min后直接進(jìn)行電鏡觀察。運(yùn)用軟件以HBV衣殼蛋白(PDB:4G93)為模板進(jìn)行3D模建。

1.7.3 脾細(xì)胞介導(dǎo)羊紅細(xì)胞定量溶血分光度實(shí)驗(yàn)(QHS) 按照鐘昕[8]方法，分別制備補(bǔ)體、SRBC懸液和脾細(xì)胞懸液。將0.25 mL SRBC，0.25 mL脾細(xì)胞懸液和0.25 mL補(bǔ)體混合，37℃反應(yīng)60 min，3 000 r/min離心3 min，吸取上清測(cè)定413 nm吸光值?？瞻讓?duì)照用生理鹽水代替補(bǔ)體。

1.2.4單克隆抗體制備與純化 將純化好的重組蛋白按0、2、4和6周間隔免疫BALB/c小鼠，每種蛋白平行免疫5只小鼠，免疫劑量為100 μg/只，初次免疫使用弗氏完全佐劑，加強(qiáng)免疫時(shí)使用弗氏不完全佐劑，并在0、2、4、6和8周采血。在進(jìn)行細(xì)胞融合前3D經(jīng)脾臟對(duì)小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫，免疫劑量為50 μg/只。選取小鼠免疫后血清與免疫原親和力高且能特異性結(jié)合EV71的小鼠脾細(xì)胞，按10∶1的比例與Sp2/0融合，采用差檢ELISA法對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選，具體方法為：在融合后7 d，將待檢培養(yǎng)上清一式兩份，分別加入包被了重組蛋白和載體蛋白的ELISA板上，運(yùn)用常規(guī)的間接ELISA法進(jìn)行后續(xù)的檢測(cè)，根據(jù)待檢培養(yǎng)上清對(duì)重組蛋白的反應(yīng)性與載體蛋白的反應(yīng)性差異對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選，對(duì)重組蛋白反應(yīng)為陽(yáng)性同時(shí)對(duì)載體蛋白反應(yīng)為陰性的雜交瘤細(xì)胞克隆判斷為陽(yáng)性。對(duì)檢測(cè)陽(yáng)性的克隆采用有限稀釋法進(jìn)行至少2次以上的克隆化，直到篩選出穩(wěn)定的克隆株。將陽(yáng)性克隆細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)后注入小鼠腹腔，待小鼠腹部明顯膨大，收集腹水，用辛酸-飽和硫酸銨沉淀和Protein A親和層析純化。

1.2.5單克隆抗體類型及亞類鑒定 采用Sigma公司的小鼠單克隆抗體分型試劑盒鑒定單克隆抗體的類型及亞類。首先，以純化的免疫原包板，用PBS緩沖液稀釋抗體，稀釋策略為首孔1 μg/ml按2倍比梯度稀釋8孔，加入100 μl稀釋抗體至預(yù)先包被好的板中，37℃孵育1 h；其次，PBST緩沖液洗板3次后，分別加入50 μl HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgA、IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3，37℃孵育30 min；接著PBST緩沖液洗板3次后，每孔加入100 μl TMB底物，37℃孵育10 min；最后每孔加入50 μl終止液，在酶標(biāo)儀上進(jìn)行讀數(shù)。

1.2.6單克隆抗體對(duì)病毒特異性鑒定 (1)間接免疫熒光試驗(yàn):將13 mm×13 mm圓形玻璃片放入24孔板中，鋪入1×106個(gè)/孔的RD細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組按MOI=0.1接種EV71；37℃感染12 h后，用4%多聚甲醛固定30 min并依次加入通透液、抗EV71單克隆抗體、GAM-FITC IgG和DAPI染液，封片后在熒光顯微鏡下進(jìn)行結(jié)果觀察。(2)ELISPOT法:將EV71接種于96孔板單層的RD細(xì)胞中，37℃培養(yǎng)至出現(xiàn)細(xì)胞明顯病變，用0.2%戊二醛固定1 h后依次加入通透液、標(biāo)記了HRP的抗EV71的單抗和等體積混合的A/B顯色液，顯色結(jié)束后，拍干顯色液，用酶聯(lián)斑點(diǎn)分析儀拍照及計(jì)數(shù)。(3)免疫組織化學(xué)染色法:首先用鼠適應(yīng)株P(guān)SVA-EV71-Mp4對(duì)一日齡新生小鼠進(jìn)行攻毒，將收集到的攻毒死亡或?yàn)l臨死亡的動(dòng)物進(jìn)行初步解剖，暴露其組織器官并放入4%的福爾馬林中固定72 h；充分固定后采集小腸和肌肉組織進(jìn)行病理制片和檢測(cè)[18,19]。

2 結(jié)果

2.1重組表達(dá)載體的構(gòu)建 設(shè)計(jì)和合成編碼EV71-3D(aa34-43)、EV71-3D(aa61-76)和EV71-3D(aa151-164)多肽區(qū)段的上下游引物，引物見表1，將上下游引物進(jìn)行互搭獲得相應(yīng)的片段。接著，以本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒pC149/mut為載體，在其免疫優(yōu)勢(shì)區(qū)插入EV71 3D蛋白相應(yīng)區(qū)段(圖1A)，通過PCR和測(cè)序鑒定，最終獲得正確的pC149-3D(aa34-43)、pC149-3D(aa61-76)和pC149-3D(aa151-164)質(zhì)粒。

2.2重組蛋白的表達(dá)、純化與鑒定 重組大腸桿菌ER2566/pC149-3D和ER2566/pC149經(jīng)0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)6 h后得到表達(dá)，經(jīng)鑒定主要以可溶形式表達(dá)于上清。接著用熱變性、飽和硫酸銨沉淀等方法純化獲得重組蛋白。結(jié)果如圖1B所示，HBc3D(aa34-43)、HBc3D(aa61-76)和HBc3D(aa151-164)目的蛋白條帶大小符合預(yù)期，單體約20 kD,純度高達(dá)95%，重組蛋白可形成明顯的二聚體。負(fù)染電鏡結(jié)果顯示，純化后的目的蛋白均能夠很好地組裝成VLP，顆粒大小和形態(tài)與對(duì)照蛋白HBc(aa1-149)顆粒類似，呈直徑為30 nm左右大小均勻的完整的空心球體結(jié)構(gòu)(圖1C)。此外，同源建模結(jié)果顯示，EV71-3D(aa34-43)、EV71-3D(aa61-76)和EV71-3D(aa151-164)多肽區(qū)段理論上可展示在顆粒的表面(圖1D)。

2.3免疫小鼠多抗血清評(píng)價(jià)及雜交瘤細(xì)胞株的篩選 運(yùn)用間接ELISA法檢測(cè)各組小鼠的免疫血清對(duì)各自免疫抗原和對(duì)照抗原HBc(aa1-149)的特異性抗體滴度。結(jié)果見圖2A和2B，免疫四針后嵌合表位肽融合蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的總體抗體水平高于抗HBc(aa1-149)蛋白抗體；如HBc3D(aa34-43)蛋白免疫血清針對(duì)免疫抗原產(chǎn)生的總體抗體滴度為3.3×106，而針對(duì)HBc(aa1-149)蛋白的抗體滴度僅為3.8×104，表明HBc3D(aa34-43)免疫原可較好地誘導(dǎo)小鼠機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)3D(aa34-43)表位的抗體。此外，運(yùn)用IFA檢測(cè)各組小鼠的免疫血清對(duì)EV71的結(jié)合活性，結(jié)果顯示，僅HBc3D(aa34-43)蛋白免疫血清可特異性結(jié)合EV71感染的RD細(xì)胞(圖2C)。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，挑選HBc3D(aa34-43)蛋白免疫的小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合，以差檢ELISA法對(duì)融合細(xì)胞進(jìn)行篩選，最終獲得1株穩(wěn)定分泌單克隆抗體的細(xì)胞株，命名為3E1。

表1EV713D蛋白表位片段克隆引物序列

Tab.1SequenceofoligonucleotideprimerforEV713Depitopefragments

PrimerSequence3D(aa34-43)-FGATCCTTCGAGGGAAATAAGGAACCAGCTGTCTTGG3D(aa34-43)-RAATTCCAAGACAGCTGGTTCCTTATTTCCCTCGAAG3D(aa61-76)-FGATCCAAGTATGTGGGAAATACACTACATGAGCCTGACGAGTACATCAAAGAGG3D(aa61-76)-RAATTCCTCTTTGATGTACTCGTCAGGCTCATGTAGTGTATTTCCCACATACTTG3D(aa151-164)-FGATCCGATCTTCCTTACTCCACTTATGTCAAGGACGAGCTGCGCTCAG3D(aa151-164)-RAATTCTGAGCGCAGCTCGTCCTTGACATAAGTGGAGTAAGGAAGATCG

圖1 重組克隆的構(gòu)建及表位肽融合蛋白的性質(zhì)分析Fig.1 Construction of chimeric HBc proteins and analysis of purified recombinant VLPsNote: A.Schematic presentation of the construct；B.SDS-PAGE analysis of purified recombinant proteins.Lane M.Molecular mass marker;Lane 1.HBc(aa1-149);Lane 2.HBc3D(aa34-43);Lane 3.HBc3D(aa61-76);Lane4.HBc3D(aa151-164);C.Electron microphotographs;D.Molecular modeling.EV71-3D(aa34-43),EV71-3D(aa61-76)and EV71-3D(aa151-164)epitopes located on the surface of HBc-VLPs colored by red,yellow and blue.

2.4單克隆抗體性質(zhì)鑒定 (1)單抗的類型及亞類鑒定:使用小鼠單克隆抗體分型試劑盒對(duì)單克隆抗體3E1進(jìn)行亞型鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其屬于IgG2a亞型。(2)間接免疫熒光驗(yàn)證單抗:檢測(cè)結(jié)果顯示，感染EV71的RD細(xì)胞顯示出較亮的綠色熒光，而未感染病毒的細(xì)胞則未觀察到綠色熒光反應(yīng)，見圖3A。(3)ELISPOT檢測(cè):結(jié)果如圖3B顯示，接種EV71的RD細(xì)胞顯示出藍(lán)色的病變斑，而未感染病毒的細(xì)胞則未觀察到病變斑，且單抗3E1稀釋至 2.5 μg/ml 時(shí)仍可特異性結(jié)合EV71。(4)單抗在受

圖2 免疫小鼠多抗血清評(píng)價(jià)Fig.2 Evaluation antiserum of immune miceNote: A.HBc3D(aa34-43),HBc3D(aa61-76)and HBc3D(aa151-164)as coated proteins respectively to detect the antibodies of antiserum;B.HBc(aa1-149)as coated protein as a control;C.Detection EV71 in RD cells by immunofluorescence assay using the antiserum.

圖3 單克隆抗體3E1性質(zhì)鑒定Fig.3 Reactivity of anti-EV71-3D mAb 3E1 with EV71Note: A.Immunofluorescence assay of EV71 infected RD cells;B.Elispot assay of EV71 infected RD cells;C..Immunohist-ochemistry staining assay of pSVA-EV71-MP4 infected and uninfected mice tissues with 3E1.

感染小鼠組織中的免疫組織化學(xué)染色:將攻毒后5～8 d 發(fā)生肢體癱瘓或死亡的乳鼠組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)(IHC)檢測(cè)，結(jié)果如圖3C所示，在感染EV71小鼠的小腸和肌肉中檢測(cè)到病毒陽(yáng)性信號(hào)，而在陰性小鼠組織中未發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)。間接IFA、ELISPOT檢測(cè)和免疫組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明單抗3E1可特異性結(jié)合EV71。

3 討論

手足口病是一種由人腸道病毒引起的全球性傳染病，常見于5歲以下的嬰幼兒。其臨床癥狀主要為手、足和口等部位出現(xiàn)水泡樣潰瘍或皮疹，重癥患者可引發(fā)嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，甚至死亡。手足口病的重癥和死亡病例主要由EV71感染引起的，目前尚無特效治療藥物，且對(duì)EV71的致病機(jī)制尚未完全明了。EV71主要由RNA、結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白組成，其中非結(jié)構(gòu)蛋白3D是RNA多聚酶的主要組分，可催化VPg蛋白尿苷酸化，參與病毒的復(fù)制過程。鑒于其在病毒生命周期中的重要的作用[14,15]，獲得穩(wěn)定、可靠的抗3D蛋白的單克隆抗體是進(jìn)一步研究該蛋白作用機(jī)制的重要基礎(chǔ)。

從病毒顆粒中純化天然蛋白或利用基因工程技術(shù)表達(dá)全長(zhǎng)的重組蛋白，特別是一些分子量較大的蛋白，常需耗費(fèi)較長(zhǎng)的時(shí)間去摸索表達(dá)與純化的策略；且當(dāng)外源蛋白進(jìn)入機(jī)體時(shí)，機(jī)體免疫應(yīng)答并非通過識(shí)別完整的蛋白分子而發(fā)揮功能，往往識(shí)別的位點(diǎn)僅僅是外源蛋白的某一小區(qū)段，如抗原表位。但多肽表位分子量小，半衰期短，單獨(dú)使用時(shí)免疫原性較弱，因此常借助表位展示載體的輔助作用增強(qiáng)其穩(wěn)定性和免疫原性。類病毒顆粒如HBV-VLPs被認(rèn)為是較理想的展示外源表位的運(yùn)載工具。它不僅在體外可自發(fā)組裝成類病毒顆粒，還可將表位展示在顆粒的表面，充分暴露表位的分布密度以增強(qiáng)其免疫原性。此外，如今運(yùn)用生物信息學(xué)工具預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的優(yōu)勢(shì)表位，已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)表位的分析與鑒定[20,21]。因此，我們認(rèn)為結(jié)合生物信息學(xué)和類病毒顆粒載體展示技術(shù)，能夠作為一種快速、高效地篩選識(shí)別特定表位肽，并用于制備針對(duì)大分子量蛋白的單克隆抗體的重要技術(shù)策略。

基于此，本研究將生物信息學(xué)技術(shù)與HBc顆粒型蛋白載體展示技術(shù)相結(jié)合，并運(yùn)用常規(guī)的雜交瘤技術(shù)篩選出針對(duì)EV71 3D蛋白的單克隆抗體3E1，抗體性質(zhì)鑒定結(jié)果顯示其能特異性結(jié)合EV71病毒，為進(jìn)一步研究蛋白的功能奠定了基礎(chǔ)。

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[收稿2017-01-11 修回2017-02-28]

(編輯 張曉舟)

Preparationofmonoclonalantibodiesagainst3DproteinofEV71basedonHBcparticlesasexpressionvector

LIYong-Chao,ZHURui,XULong-Fa,WUYang-Tao,ZHAOHuan,WUKun,LIUDong-Xiao,CHENGTong,XIANing-Shao.

StateKeyLaboratoryofMolecularVaccinologyandMolecularDiagnostics,NationalInstituteofDiagnosticsandVaccineDevelopmentofInfectiousDisease,SchoolofPublicHealth,XiamenUniversity,Xiamen361102，China

Objective:To prepare and preliminarily identify the monoclonal antibodies(mAbs) specifically against 3D protein of Enterovirus 71(EV71),using bioinformatics to predict the epitopes of 3D,with HBc protein as a carrier.Methods: Artificial screening of 3D protein epitope sequences by bioinformatic method,inserted into the major immunodominant region(MIR) area of Hepatitis B virus core protein(HBc),to construct the recombinant protein.BALB/c mice were immunized with the recombinant virus like particles(VLPs),to prepare the mAbs against 3D protein of EV71.Affinity chromatography technology was used to purify the mAb.The indirect ELISA,ELISPOT,immunofluorescence and immunohistochemistry staining methods were used to identify the characteristic of the mAb.Results: We displayed 3D(aa34-43),3D(aa61-76) and 3D(aa151-164) epitopes by constructing fusion protein using HBc VLPs as a vector,after hybridization,one positive hybridoma cell line(3E1) was selected by ELISA.The isotype of 3E1 was IgG2a.The results of immunofluorescence and immunohistochemistry staining assay showed that the mAb 3E1 could specifically recognize EV71.Conclusion: The prepared mAb 3E1 can specifically recognizes the EV71,which laid the foundation for the detection of virus and further study on 3D protein,and verified the bioinformatics technology combined with HBc carrier displaying peptides could prepare mAb quickly and efficiently.

Hepatitis B virus core protein;Enterovirus 71;Non-structural protein 3D;Monoclonal antibody

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.09.013

①本文受國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.31670933，No.81371817)資助。

李永超(1993年-)，男，實(shí)驗(yàn)員，主要從事腸道病毒功能方面的研究，E-mail:18850569602@163.com。

及指導(dǎo)教師：程 通(1977年-)，男，博士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事分子病毒學(xué)研究，E-mail:tcheng@xmu.edu.cn。

R392.11

A

1000-484X(2017)09-1341-05