滇皖產(chǎn)區(qū)鐵皮石斛居群SSR分子身份證的構(gòu)建△

董曉曼，袁媛，查良平，彭代銀，俞年軍，王繼永，趙玉洋，蔣超，黃璐琦

(1.道地藥材國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心，北京 100700；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；3.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院 中藥資源保護(hù)與開(kāi)發(fā)研究所，安徽 合肥 230012；4.中國(guó)中藥公司，北京 100195)

·基礎(chǔ)研究·

滇皖產(chǎn)區(qū)鐵皮石斛居群SSR分子身份證的構(gòu)建△

董曉曼1，2，袁媛1*，查良平2，3，彭代銀2，3，俞年軍2，王繼永4，趙玉洋1，蔣超1*，黃璐琦1

(1.道地藥材國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心，北京 100700；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；3.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院 中藥資源保護(hù)與開(kāi)發(fā)研究所，安徽 合肥 230012；4.中國(guó)中藥公司，北京 100195)

目的：建立滇皖產(chǎn)區(qū)鐵皮石斛SSR指紋圖譜，并構(gòu)建不同居群的SSR分子身份證。方法：使用生物信息學(xué)方法分析鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)全基因組SSR(Simple sequence repeat)序列，獲得SSR位點(diǎn)，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，選擇高多態(tài)性引物進(jìn)行遺傳多樣性分析并建立SSR指紋圖譜代碼，使用二維碼生成器表述鐵皮石斛居群的分子身份證。結(jié)果：共獲得91 653個(gè)SSR位點(diǎn)，平均分布距離為15.44 kb。據(jù)此開(kāi)發(fā)了75對(duì)SSR引物，篩選出32對(duì)多態(tài)性豐富、帶型清晰的引物，對(duì)11個(gè)滇、皖產(chǎn)區(qū)的鐵皮石斛居群進(jìn)行遺傳多樣性分析，共得到117個(gè)多態(tài)信息位點(diǎn)，平均每個(gè)SSR引物多態(tài)信息含量(PIC)為0.62，變化范圍為0.22～0.80；鐵皮石斛不同居群進(jìn)行親緣關(guān)系聚類(lèi)表明11個(gè)鐵皮石斛居群可分為三支，與種質(zhì)來(lái)源分布相一致。篩選出4對(duì)多態(tài)性高、帶型清晰易于統(tǒng)計(jì)的引物組合，建立不同居群鐵皮石斛的SSR指紋圖譜庫(kù)和不同居群的分子身份證。結(jié)論：SSR分子身份證可為今后鐵皮石斛的品種鑒別提供準(zhǔn)確、可靠的方法和溯源信息平臺(tái)。

鐵皮石斛；基因組SSR；分子身份證

鐵皮石斛DendrobiumofficinaleKimura et Migo是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥，自2010年起已作為單一品種收錄于《中華人民共和國(guó)藥典》[1]。近年來(lái)，由于鐵皮石斛野生資源衰竭和種植、加工技術(shù)的突破，人工栽培鐵皮石斛已占據(jù)主導(dǎo)地位。鐵皮石斛自然分布范圍廣[2]，生境差異大，種內(nèi)變異多，其栽培品種種源復(fù)雜，變異類(lèi)型廣泛。不同栽培品種的鐵皮石斛中氨基酸、多糖及微量元素等含量具有明顯差異[3-4]，市場(chǎng)上鐵皮石斛產(chǎn)量和質(zhì)量良莠不齊，嚴(yán)重制約了安全、優(yōu)質(zhì)和高產(chǎn)鐵皮石斛藥材的可持續(xù)生產(chǎn)。由于各企業(yè)均采用組織培養(yǎng)和快繁技術(shù)，頻繁繼代易導(dǎo)致體細(xì)胞無(wú)性系變異，即使同一品種也存在株間變異，品種內(nèi)形態(tài)差異較大[5]，且傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定也很難對(duì)種子、幼苗進(jìn)行品種鑒定。急需建立鐵皮石斛不同栽培變異類(lèi)型的特異性分子標(biāo)記，為其栽培引種、生產(chǎn)、流通過(guò)程以及產(chǎn)品的追溯和司法仲裁提供技術(shù)支撐。

分子身份證(molecular ID，mID)是一種基于DNA電泳圖譜的分子代碼，通過(guò)將品種分子特征數(shù)字化后以字符串的形式輸出，使結(jié)果更加簡(jiǎn)單明了，包含信息更加全面[6]。分子身份證既能夠鑒別生物個(gè)體差異，又能檢測(cè)生物種質(zhì)特征，已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物和果蔬的種質(zhì)分型、純度鑒定與種源追溯等[7-9]。由于簡(jiǎn)單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeat，SSR)多態(tài)性豐富、具共顯性、重現(xiàn)性好、在染色體上分布均勻[10]，已廣泛用于SSR指紋圖譜和種質(zhì)資源分子身份證的構(gòu)建。

本研究擬利用SSR技術(shù)，對(duì)云南和安徽地區(qū)的11個(gè)栽培鐵皮石斛居群進(jìn)行多態(tài)性分析，并篩選出重復(fù)性高、條帶清晰易統(tǒng)計(jì)的引物構(gòu)建鐵皮石斛的SSR指紋圖譜和分子身份證，為鐵皮石斛分子身份證數(shù)據(jù)庫(kù)的建立奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

研究材料取自云南省紅河市綠春縣、安徽省宣城市涇縣和六安市霍山縣的栽培基地，共188個(gè)樣品，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)俞年軍教授鑒定為鐵皮石斛DendrobiumofficinaleKimura et Migo，憑證標(biāo)本保存于安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥園，詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

1.2DNA提取

樣品采集后硅膠干燥，取20～100mg，使用兩步CTAB法[11]提取樣品總DNA，并進(jìn)行DNA濃度和純度測(cè)定，調(diào)整終濃度約為50 ng·μL-1用于進(jìn)一步研究。1.3基因組SSR篩選鐵皮石斛全基因組數(shù)據(jù)來(lái)自L(fǎng)iang等的文獻(xiàn)[12]。使用SSR搜索程序(http：//www.gramene.org/db/markers/ssrtool)搜索已獲得的鐵皮石斛基因組序列中潛在的2～6bp的SSR，參數(shù)設(shè)置為：二核苷酸重復(fù)≥14bp，三核苷酸重復(fù)≥18bp，四、五核苷酸重復(fù)≥20bp，六核苷酸重復(fù)≥18bp。

表1 鐵皮石斛樣品信息表

1.4SSR引物設(shè)計(jì)

依據(jù)SSR側(cè)翼區(qū)域序列，應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier5.0設(shè)計(jì)引物。引物設(shè)計(jì)的原則為：引物長(zhǎng)18～25bp， PCR產(chǎn)物長(zhǎng)100～250bp，GC含量為40%～60%。引物經(jīng)BLAST比對(duì)，根據(jù)結(jié)果重點(diǎn)對(duì)3′端堿基及上下游引物間隔進(jìn)行調(diào)整，最大限度保證引物3′端堿基與擴(kuò)增位點(diǎn)相匹配，以及有效擴(kuò)增長(zhǎng)度[13]，設(shè)計(jì)75對(duì)引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.5PCR擴(kuò)增及銀染檢測(cè)

PCR反應(yīng)在ABI公司的9700型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系(25μL)為：2.5μL10×PCR buffer，2μL2.5mmol·L-1dNTPs，10μmol·L-1引物各1μL，2.5U rTaq酶[寶生物工程(大連)有限公司]，1μL DNA模板。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min；95℃變性40s，52～60℃復(fù)性50s，72℃延伸50s，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。產(chǎn)物用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染檢測(cè)[14]。

1.6數(shù)據(jù)處理

擴(kuò)增條帶在相同遷移率位置上，有帶記為“1”，無(wú)帶記為“0”，用Excel軟件統(tǒng)計(jì)整理。利用Popgene32軟件計(jì)算SSR位點(diǎn)的等位基因數(shù)(Numberofalleles，Na)、有效等位基因數(shù)(Effectivenumberofalleles，Ne)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(Nei’sgenediversity) 、Shannon多樣性指數(shù)(Shannon’sinformationindex) 和Nei’s遺傳相似性系數(shù)和遺傳距離；用PICCalc軟件分析位點(diǎn)多態(tài)信息含量(Polymorphisminformationcontent，PIC)，PIC計(jì)算公式為PIC=1-∑fi2，其中fi為i位點(diǎn)基因頻率；并基于非加權(quán)組平均法(UnweightedPairGroupMethodwithArithmeticMean，UPGMA)算法對(duì)11個(gè)居群所有個(gè)體進(jìn)行聚類(lèi)分析。

1.7指紋圖譜構(gòu)建

參考指紋圖譜代碼構(gòu)建方法[15]，將挑選的多態(tài)性引物按照多態(tài)性降序排列，編號(hào)為A、B、C……每對(duì)SSR引物擴(kuò)增的多態(tài)性條帶依據(jù)分子量由大到小排列設(shè)編號(hào)為a、b、c……如樣品經(jīng)引物GD92263擴(kuò)增后有a、c處條帶，無(wú)b處條帶，則記錄為101。記錄每份材料經(jīng)不同SSR引物擴(kuò)增出現(xiàn)的條帶，則每個(gè)居群的樣品經(jīng)不同引物擴(kuò)增后將會(huì)形成由字母和阿拉伯?dāng)?shù)字組成的一系列帶型編號(hào)，便形成了該居群的SSR指紋圖譜代碼。

1.8鐵皮石斛居群分子身份證建立

結(jié)合鐵皮石斛不同居群的SSR指紋圖譜和樣品采集地信息等，構(gòu)建11個(gè)鐵皮石斛居群的分子身份證，并利用在線(xiàn)QR二維碼生成器(http：//tool.oschina.net/qr)以條碼表述構(gòu)建的鐵皮石斛居群的身份證。

2 結(jié)果與分析

2.1鐵皮石斛SSR發(fā)掘和特征分析

鐵皮石斛基因組1.35Gb，共784830條無(wú)冗余的基因組序列，按照設(shè)置參數(shù)共檢索到91653個(gè)SSR位點(diǎn)。平均距離為15.44kb，即基因組序列上每15.44kb出現(xiàn)一個(gè)SSR位點(diǎn)。在所搜索到的SSR中，二核苷酸重復(fù)類(lèi)型占比例最高(63.97%)，三核苷酸重復(fù)類(lèi)型所占比例為26.27%，四、五、六核苷酸重復(fù)單元類(lèi)型所占比例均較低，分別為3.50%、4.72% 和1.54%(見(jiàn)表2)。其中二核苷酸出現(xiàn)頻率為六核苷酸出現(xiàn)頻率的41.5倍，與忍冬[16]、鳶尾[17]、人參[18]等的研究結(jié)果相符，但在部分松屬物種[19]中獲得的SSR序列以三核苷酸重復(fù)為主，這種占優(yōu)勢(shì)的重復(fù)類(lèi)型可能與測(cè)序方式、篩選SSR參數(shù)[16]及待測(cè)物種有關(guān)。

表2 鐵皮石斛SSR分布及類(lèi)型

在各重復(fù)類(lèi)型中，不同重復(fù)基元出現(xiàn)的頻率也有差異。二核苷酸重復(fù)類(lèi)型中各基元所占比例依次為：AT/TA(24.90%)>AG/CT(18.86%)>TC/GA(15.89%)>AC/GT(3.64%)>TG/CA(1.97%)>CG/GC(0.02%) (見(jiàn)圖1)，表現(xiàn)出AT優(yōu)勢(shì)，與丹參[20]、巧家五針?biāo)蒣21]、思茅松[22]的SSR分析結(jié)果相一致。鐵皮石斛基因組存在少量CG/GC重復(fù)，有研究認(rèn)為[23]GC重復(fù)類(lèi)型較少是因?yàn)榛蚪MDNA中的CpG甲基化，很容易通過(guò)脫氨基作用轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏ぁＲ灿醒芯縖24]指出物種中的GC重復(fù)都是較少的，并進(jìn)一步認(rèn)為可能與GC重復(fù)所形成的DNA結(jié)構(gòu)有關(guān)。三核苷酸重復(fù)類(lèi)型共檢索出59種，其中AAT/ATT較多(5.75%)，其次是ACA/TGT(4.98%)，TAA/TTA(4.25%)，ATA/TAT(3.36%)，TTG/CAA(1.65%)和AAG/CTT(1.13%)，未見(jiàn)ACG重復(fù)基元，其余47種重復(fù)類(lèi)型均較少。

圖1 二核苷酸重復(fù)SSR和三核苷酸重復(fù)SSR基序類(lèi)型分析

2.2鐵皮石斛SSR引物設(shè)計(jì)及篩選

利用75對(duì)引物初步擴(kuò)增了每個(gè)居群中隨機(jī)選取的鐵皮石斛共11份樣品，

選出擴(kuò)增良好、帶型清晰、且具有多態(tài)性的引物32對(duì)(見(jiàn)表3)，利用多態(tài)性引物對(duì)11個(gè)居群樣品基因組DNA進(jìn)行SSR-PCR擴(kuò)增，共檢測(cè)到132個(gè)條帶，其中多態(tài)性條帶為117條，每對(duì)引物可以檢測(cè)到2～7條數(shù)目不等的多態(tài)性條帶，平均可檢測(cè)到4條。每對(duì)引物擴(kuò)增出3～14個(gè)等位基因，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出7.6個(gè)等位基因。每對(duì)引物擴(kuò)增的有效等位基因數(shù)為2.4～12，平均每對(duì)引物為6.3個(gè)。Nei’s基因多樣性系數(shù)變化范圍為0.0551～0.4298，平均為0.3158，有18對(duì)引物均高于均值水平；Shannon多樣性指數(shù)變化范圍為0.1015～0.6193，平均為0.4535，有19對(duì)引物高于均值水平。

32對(duì)SSR引物的多態(tài)信息含量平均值為0.62，按照Bostein[25]的理論，其中有26對(duì)引物具高度多態(tài)性(PIC>0.5)，5對(duì)具中度多態(tài)性(0.25

表3 SSR引物序列信息及多態(tài)性情況

表3(續(xù))

注：F.正向引物；R.反向引物；PIC.位點(diǎn)多態(tài)信息含量；Na.等位基因數(shù)；Ne.有效等位基因數(shù)；H.Nei’s 遺傳多樣性；I.Shannon’s 指數(shù)。

2.3基于SSR的遺傳多樣性分析

根據(jù)32對(duì)SSR引物擴(kuò)增形成的帶型多樣性，對(duì)11個(gè)供試的鐵皮石斛居群進(jìn)行了遺傳相似系數(shù)計(jì)算和聚類(lèi)分析(見(jiàn)圖2)。結(jié)果表明，11個(gè)鐵皮石斛居群的遺傳相似系數(shù)范圍在0.1121～0.8939，平均遺傳相似系數(shù)為0.5444。在此基礎(chǔ)上，對(duì)鐵皮石斛不同居群進(jìn)行親緣關(guān)系聚類(lèi)，11個(gè)鐵皮石斛居群可分為三支，第I支包含了于安徽省涇縣采集的YSTP和JXTP2個(gè)居群，其中YSTP為涇縣當(dāng)?shù)匾吧F皮石斛，JXTP為YSTP引種栽培的居群，二者親緣關(guān)系較近；第II支包含了由云南采集的HGTP、HJC、YGTP和YZTP4個(gè)居群，均為云南本地品種；而第III支除了由安徽六安采集的ZJTP、ZKTP和HSTP，還包含由云南采集的QGTP和XGTP共5個(gè)居群，其中ZJTP、ZKTP和HSTP均為安徽品種，而QGTP和XGTP種質(zhì)均來(lái)源于浙江，地理位置與安徽接近。結(jié)果表明，基于SSR多態(tài)性的聚類(lèi)與居群地理種源顯著相關(guān)，鐵皮石斛種內(nèi)地理位置相近的居群遺傳基礎(chǔ)相對(duì)接近，與丁鴿[26]、苑鶴[27]等對(duì)鐵皮石斛野生和栽培居群的遺傳多樣性研究相一致。

圖2 基于32對(duì)引物的滇皖鐵皮石斛UPGMA聚類(lèi)樹(shù)

2.4基于SSR構(gòu)建鐵皮石斛主產(chǎn)區(qū)居群的分子身份證

從32對(duì)多態(tài)性引物中挑選重復(fù)性好、擴(kuò)增條帶清晰易辨的4對(duì)引物，按PIC值降序排列為XJ89800(A)，GD92263(B)，F(xiàn)JS58122(C)和GD80011(D)進(jìn)行組合，對(duì)鐵皮石斛樣品進(jìn)行擴(kuò)增后，每居群特征電泳圖譜見(jiàn)圖3；依據(jù)設(shè)計(jì)的指紋圖譜構(gòu)建方法，為每一居群建立了唯一能夠區(qū)別于其他供試材料的指紋圖譜代碼，見(jiàn)表4。

利用在線(xiàn)二維碼生成器對(duì)所有鐵皮石斛居群進(jìn)行QR編碼，為每個(gè)居群構(gòu)建了分子身份證(見(jiàn)圖4)，其中包含了居群名稱(chēng)、物種、SSR指紋圖譜和采集地。如圖4中YSTP包含“居群名：YSTP；物種：鐵皮石斛Dendrobiumofficinale；SSR指紋圖譜：A01110B1000C1111D10；栽培地地理信息：安徽省涇縣，北緯：30°43′40″，東經(jīng)：118°32′26″，海拔：200m；種源地：安徽省涇縣”信息。

注：泳道1～11分別為YSTP、JXTP、HGTP、YZTP、QGTP、YGTP、HJC、HSTP、ZJTP、ZKTP和XGTP居群。圖3 滇皖產(chǎn)區(qū)鐵皮石斛典型SSR指紋圖譜

序號(hào)居群SSR指紋1YSTPA01110B1000C1111D102JXTPA11100B1000C0001D003HGTPA11110B1111C1111D114YZTPA01111B1100C1101D105QGTPA01111B1111C1111D106YGTPA01111B1111C1111D117HJCA01111B0111C1111D018HSTPA00111B1001C1101D119ZJTPA10111B1111C1101D1110ZKTPA10101B1111C1111D1111XGTPA01111B0111C0001D10

注：A～D.引物XJ89800、GD92263、FJS58122及GD80011。

圖4 滇皖產(chǎn)區(qū)11個(gè)鐵皮石斛居群分子身份證二維條碼

3 討論與結(jié)論

遺傳多樣性是種質(zhì)資源保護(hù)和開(kāi)發(fā)的重要依據(jù)，篩選等位變異大的SSR位點(diǎn)對(duì)揭示遺傳多樣性方面有重要的研究?jī)r(jià)值。與EST-SSR相比，基因組SSR變異更豐富，遺傳多樣性更高[28-30]，適合種內(nèi)及居群間親緣關(guān)系、分子系統(tǒng)學(xué)與遺傳多樣性研究[31-32]。本研究使用基因組SSR對(duì)不同鐵皮石斛居群進(jìn)行遺傳多樣性研究，其平均等位基因數(shù)、平均有效等位基因數(shù)、位點(diǎn)平均多態(tài)信息含量均較高，表明本研究中的鐵皮石斛居群遺傳多樣性水平較高。11個(gè)鐵皮石斛居群可聚為三大支，與種質(zhì)來(lái)源而非采集地聯(lián)系緊密，種質(zhì)資源地理位置相近的鐵皮石斛其遺傳關(guān)系較近，同時(shí)也體現(xiàn)了當(dāng)今鐵皮石斛種質(zhì)資源相互交流、引進(jìn)越來(lái)越頻繁。

鐵皮石斛種質(zhì)鑒定多基于形態(tài)學(xué)描述，受環(huán)境、生長(zhǎng)周期等影響，耗時(shí)且難以對(duì)種子、幼苗進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別?；赟SR的分子指紋圖譜和分子身份證被認(rèn)為是品種鑒定理想的標(biāo)記之一[33]，通過(guò)構(gòu)建指紋圖譜庫(kù)和分子身份證，可對(duì)鐵皮石斛種質(zhì)、品種乃至個(gè)體進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。另一方面，二維碼的普及為中藥的鑒定與溯源提供了直接的硬件支持[34-35]，由于SSR是一種基于條帶有無(wú)的判定方式，可以直接轉(zhuǎn)換為二維條碼而不改變分子指紋圖譜的內(nèi)容，且可添加照片、形態(tài)、性狀描述、居群、地理信息以方便核對(duì)，通過(guò)對(duì)分子身份證掃描二維條碼進(jìn)行真?zhèn)巍⒎N質(zhì)和產(chǎn)地溯源，用于中藥流通監(jiān)管的各個(gè)環(huán)節(jié)，實(shí)現(xiàn)數(shù)字化監(jiān)管。

分子身份證的核心是準(zhǔn)確、易區(qū)分的指紋圖譜庫(kù)。完善的指紋圖譜庫(kù)的構(gòu)建應(yīng)全面且具有代表性，不僅需要供試材料來(lái)源廣泛，對(duì)引物的選擇也有一定標(biāo)準(zhǔn)。在多態(tài)性高的前提下，擴(kuò)增條帶重復(fù)性高，清晰易統(tǒng)計(jì)也應(yīng)納入考慮范圍，故而隨著種質(zhì)資源數(shù)的擴(kuò)大，所選用的SSR引物也將不斷調(diào)整和優(yōu)化，最終建立囊括所有核心種質(zhì)的分子身份證。而居群內(nèi)的個(gè)體突變和人工種植中的機(jī)械混雜導(dǎo)致的種質(zhì)混雜等，同一品種鐵皮石斛的不同個(gè)體在DNA分子水平可能存在微弱差異，表現(xiàn)為同居群不同個(gè)體經(jīng)同一SSR引物擴(kuò)增后產(chǎn)物位點(diǎn)數(shù)不同，可根據(jù)中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)“T/CACM 010-2016 中藥分子鑒定通則”的要求根據(jù)樣品間差異位點(diǎn)數(shù)進(jìn)行判定。

本研究利用32對(duì)多態(tài)性引物進(jìn)行11份鐵皮石斛居群的遺傳多樣性分析，并從中篩選4對(duì)多態(tài)性好、分辨率高的SSR引物建立各鐵皮石斛居群唯一的SSR指紋圖譜，結(jié)合栽培基地地理位置等信息，以構(gòu)建鐵皮石斛居群的分子身份證，旨在為今后鐵皮石斛的品種鑒定提供準(zhǔn)確、可靠的方法及溯源信息平臺(tái)。

致謝：感謝安徽霍山長(zhǎng)沖中藥材開(kāi)發(fā)有限公司何祥林總經(jīng)理在樣品采集中提供的幫助！

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MolecularIDforPopulationsofDendrobiumofficinaleofYunnanandAnhuiProvinceBasedonSSRMarker

DONG Xiaoman1，2，YUAN Yuan1*，ZHA Liangping2，3，PENG Daiyin2，3，YU Nianjun2，WANG Jiyong4，ZHAO Yuyang1，JIANG Chao1*，HUANG Luqi1

(1.StateKeyLaboratoryofDao-diHerbsBreedingBase，NationalResourceCenterforChineseMateriaMedica，ChinaAcademyofChineseMedicalSciences，Beijing100700，China；2.SchoolofPharmacy，AnhuiUniversityofChineseMedicine，Hefei230012，China；3.InstituteofConservationandDevelopmentofTraditionalChineseMedicineResources，AnhuiAcademyofChineseMedicine，Hefei230012，China；4.ChineseTraditionalMedicineCompanyofChina，Beijing100195，China)

Objective：To establish a molecular ID(mID)forDendrobiumofficinalerigin from Yunnan and Anhui.Methods：Genome ofD.officinalewas analyzed and SSRs (Simple Sequence Repeats) were isolated.Primers were designed by Primer Premier 5.0 software，high polymorphism primers were isolated and genetic diversity analysis was performed，and thenSSR fingerprinting database and mIDs of 11 populations ofD.officinalewere constructed.Results：A total of 91 653 SSRs were isolated，the average distribution density was 15.44 kb.75 pairs of SSR primers were designed and screened，32 high polymorphismprimer pairs were selected to generate polymorphic fingerprints.The results showed that the 32 pairs of primers could generate 117 polymorphic alleles bands.The average polymorphism information content (PIC)as 0.62 with a range of 0.22-0.80.11 populations ofD.officinalecould be clustered to 3 branches，which accordance with the geographical distribution of its germplasm.Fingerprinting database of 11 populations ofD.officinalewere established with 4 pairs of primers，and in consequence the molecular ID were established for the 11 populations.Conclusion：SSR marker is suitable for construction of DNA fingerprinting database ofD.officinaleand the database could provide reference for population identification ofD.officinale.

Dendrobiumofficinale；genomic SSR；molecular ID

中醫(yī)藥行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)(201407003)；國(guó)家杰出青年科學(xué)基金項(xiàng)目(81325023)

] 蔣超，助理研究員，研究方向：中藥分子鑒定，E-mail：jiangchao0411@126.com；袁媛，研究員，研究方向：中藥資源與分子生藥學(xué)；E-mail：y_yuan0732@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.5.005

2017-03-22)

*[